CHƯƠNG I – TỔNG QUAN I. Sơ lược về vi khuẩn Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila là tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở cả người và vật nuôi như cừu, chó, mèo đặc biệt khi chủ thể bị stress [ HYPERLINK \l "APa94" 1 ] 2]} [ HYPERLINK \l "TCH78" 3 ]4]}, có thể thấy dải đối tượng gây bệnh của vi khuẩn A.hydrophila rất rộng, vấn đề này được đề cập trong sự xâm nhiễm qua đường ruột và ngoài ruột trên chủ thể bao gồm các hiện tượng tiêu chảy ở người và các động vật khác [ HYPERLINK \l "MSG02" 5 ], A.hydrophila cũng được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm và sản sinh nhiều loại chất độc như haemolysin, enterotoxin và xytotoxin 6]}[ HYPERLINK \l "Hri06" 7 ]8]}.hydrophila gây hoại tử nghiêm trọng có thể dẫn đến tử vong trên người khi bị nhiễm phải, theo cơ quan Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa kỳ CDC, ước tính trong 1.000 người bị hoại tử mỗi năm vì vi khuẩn A.hydrophila trên toàn thế giới, thì có khoảng 25% nạn nhân tử vong; còn tại Việt Nam từ năm 2009 đến nay, bệnh viện Nhiệt đới Trung ương đã tiếp nhận hàng chục ca nhiễm trùng máu do A.hydropila gây ra, chúng gây hoại tử nhanh chóng các tổ chức viêm nên còn có tên gọi khác là vi khuẩn “ăn thịt người”, trong 10 ca nhập viện năm 2010-2011 chỉ có 3 ca được cứu sống, 7 ca còn lại đều tử vong [ HYPERLINK \l "TuA13" 9 ]. Là vi khuẩn gram âm có mặt ở khắp nơi đặc biệt là môi trường nước, gây ra nhiều triệu chứng bệnh khác nhau 3]}, tuy nhiên các triệu chứng đều gây ra bởi độc tố aeromonad (MAS :motile aeromonad septicaemia), tác nhân gây bệnh A.hydrophila đóng vai trò là tác nhân thứ cấp kết hợp với một số bệnh khác trên cá ví dụ như hội chứng loét EUS (epizootic ulcerative syndrome) ở động vật [ HYPERLINK \l "APa94" 1 ]10]}. Theo nhiều nghiên cứu đã công bố cho thấy Aeromonas hydrophila là tác nhân gây bệnh sơ cấp, thứ cấp và cơ hội [ HYPERLINK \l "CEs93" 11 ]12]}[ HYPERLINK \l "GDL96" 13 ] của nhiều loài động vật dưới nước và trên cạn, trong 4 đó có cả con người.
Các dấu hiệu lâm sàng ở cá rất đa dạng từ sưng tấy ở mô, hoại tử, lở loét cho đến nhiễm trùng xuất huyết 3]} [ HYPERLINK \l "SLA901" 14 ]. Đặc điểm của Aeromonas hydrophila: A.hydrophila là trực khuẩn có kích thước khoảng 0.5 µm, chúng có khả năng di động nhờ 2 loại tiên mao là: tiên mao mọc ở cực khi bơi trong dung dịch và chu mao mọc ở khắp cơ thể khi di chuyển trên các bề mặt 15]}[ HYPERLINK \l "BAu07" 16 ].hydrophila có thể phân lập được trên môi trường không chọn lọc như môi trường dinh dưỡng NA hoặc TSA hay trên các môi trường chọn lọc như Rimler-shott hoặc peptone beef-extract glycogen (PBG) agar, ủ ở 20-30oC trong 18- 36 giờ.1: Aeromonas hydrophila dưới kính hiển vi (http://aem. Khuẩn lạc của A.hydrophila có thể mọc trên TSA ở 28oC trong 18-24 giờ, thường có hình tròn, màu vàng kem đến vàng sáng, lồi, có kích thước 2-3 mm. Hầu hết các 5 môi trường chọn lọc sử dụng ampiciline hoặc penyciline như tác nhân chọn lọc 17]}.
Các yếu tố môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và độc tính của vi khuẩn như chất dinh dưỡng, pH và nhiệt độ. Sautour (2003) đưa ra mô hình mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, hoạt độ nước (aw) (hàm lượng nước tự do) và pH lên sự tăng trưởng của A.hydrophila và chỉ ra rằng nhiệt độ và aw có ảnh hưởng chính lên sự phát triển của vi khuẩn, ngược lại yếu tố pH có ảnh hưởng không đáng kể [ HYPERLINK \l "MSa03" 18 ].hydrophila ở các giá trị pH khác nhau như 6.5 thì không có tác động ý nghĩa lên tốc độ phát triển, nhưng ở pH 6.0 thì pha lag ngắn hơn ở pH 7.hydrophila có thể phát triển ở dải nhiệt độ rộng nhưng nhiều nhà nghiên cứu cho rằng nhiệt độ tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn này là từ 25-35 oC, bên cạnh đó các nhà nghiên cứu khác lại nhận thấy rằng 20oC là nhiệt độ tối ưu cho A. Uddin (1997) nhận thấy nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của A.0oC, trong khi sự sản sinh protease lớn nhất ở 27. Một số dòng A.hydrophila không thể kháng lại nồng độ muối (< 5%) cũng như acid ( pH ~ 6) và có thể phát triển ở nhiệt độ thấp - 0.
Sự phát triển khác nhau trong khoảng 4-42 oC và 5-35 oC được báo cáo lần lượt bởi Palumbo (1985) và Callister cùng Agger (1987). Khả năng gây bệnh trên cá: A.hydrophila là tác nhân chính gây ra bệnh xuất huyết MAS (motile aeromonad septicaemia) và cũng là tác nhân thứ cấp trong hội chứng EUS [ HYPERLINK \l "RJR93" 10 ]. Bệnh gây ra bởi A.hydrophila còn được gọi là “Red-sore” theo Huizinga (1979), ở điều kiện thường thì A.hydrophila ít gây bệnh cho cá, nhưng khi cá bị stress do môi trường hoặc do các tác nhân vật lý hay khi có sự xâm nhiễm của các tác nhân khác thì A.hydrophila là một tác nhân gây bệnh tiềm năng 22]}[ HYPERLINK \l "JAP76" 23 ]. 6 Thông thường A.hydrophila trở thành tác nhân gây bệnh quan trọng trong nuôi cá thâm canh do sự gia tăng stress24]}.
Dưới các điều kiện môi trường thuận lợi thì tác nhân gây bệnh này dường như nhân lên và sản xuất các chất độc ECP ở mức cao gây ra sự bùng phát bệnh bất ngờ và tử vong ở cá [ HYPERLINK \l "BIA81" 25 ]26]}[ HYPERLINK \l "MYa92" 27 ]. Một vài nghiên cứu đã mô tả sự đa dạng trong biểu hiện bệnh do A.hydrophila gây ra trong các loài cá khác nhau, sự đa dạng này là do tính không đồng nhất của các dòng và sự khác nhau trong sự kết dính và các cơ chế đáp ứng với các chất độc gây ra bởi sự xâm nhiễm của vi khuẩn ở cá 28]}. Trong một nghiên cứu khác, độc tố haemolytic của A.hydrophila được báo cáo là nhân tố gây độc chính khi nghiên cứu trên chuột [ HYPERLINK \l "MWH99" 29 ]. Các dấu hiệu lâm sàng khi cá nhiễm bệnh: Karunasagar (1989) phân chia dấu hiệu lâm sàng của bệnh gây ra bởi A.hydrophila thành 4 nhóm : dạng cấp, nhiễm khuẩn nhanh chóng, với những triệu chứng xưng rõ rệt ; dạng nhiễm bệnh cấp với triệu chứng phù, phồng rộp, áp xe và tróc vảy ; dạng loét mãn tính với sự nổi nhọt và áp xe ; dạng tiềm ẩn không có triệu chứng.
Grizzle và Kiryu (1993) thì phân chia các dấu hiệu lâm sàng khi nhiễm A.hydrophila thành 3 nhóm khi gây nhiễm nhân tạo trên cá nheo là: MAS là sự xâm nhiễm toàn thân và có dấu hiệu của bệnh ; da, nhiễm bệnh được giới hạn trên da và các lớp cơ bên dưới da ; và dạng tiềm ẩn, nhiễm bệnh toàn thân mà không biểu hiện bệnh ra ngoài.2: Cá bị nhiễm bệnh do A.hydrophila gây ra (http://aquanetviet. Nhìn chung các dấu hiệu gây bệnh lâm sàng khi nhiễm A.hydrophila là sự biểu hiện những tổn thương nhỏ trên bề mặt (dẫn đến sự bong tróc vảy), xuất huyết cục bộ ở mang, các vết loét, áp xe, lồi mắt, bụng phình to và thường xuất hiện phù nề ở bụng. Jeney (1995) quan sát thấy dấu hiệu bên ngoài như hoại tử và phù nề ở cá rô phi sông Nil Oreochromis niloticus bị nhiễm A.hydrophila, cũng tương tự như các dấu hiệu đã được mô tả, nhiều dấu hiệu bệnh khác cũng được nhận thấy ở nội tạng ở các loài cá khác như gan và thận cũng bị phá hủy hoàn toàn ở cá hồi bị nhiễm A. Hoại tử lan rộng trong một vài cơ quan nội tạng và sự hiện diện của các đại thực bào chứa melanin trong máu cũng được quan sát thấy khi A.hydrophila nhiễm vào cá nheo Mỹ [ HYPERLINK \l "MTV87" 31 ].
LPS và vai trò của gen Wzz trong tổng hợp LPS LPS - lipopolysaccharide là thành phần chính của lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm, góp phần quan trọng tạo nên sự toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và giúp bảo vệ màng khỏi sự tấn công của một vài loại hóa chất, LPS cũng làm tăng điện tích âm của màng tế bào và giúp ổn định cấu trúc màng. LPS đóng vai trò chủ yếu trong sự xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào chủ và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, nhiều nghiên cứu đã xác định LPS là yếu tố gây độc chính của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 32]}[33]. Cấu trúc LPS gồm 3 vùng khác nhau: lipid A, oligosaccharide lõi và O antigen. - Lipid A thường là đường đôi glucosamine gắn với nhiều acid béo, những chuỗi acid béo kị nước này gắn chặt phân tử LPS vào màng tế bào vi khuẩn, lipid A 8 là thành phần gây độc chính của vi khuẩn gram âm là do khi tế bào vi khuẩn bị ly giải bởi hệ thống miễn dịch, những mảnh vỡ của màng chứa lipid A được giải phóng vào vòng tuần hoàn, gây sốt, tiêu chảy, và có thể gây sốc nội độc tố (còn gọi là sốc nhiễm khuẩn).
- Lõi của LPS luôn luôn chứa một thành phần oligosaccharide gắn trực tiếp với lipid A và thường chứa đường như heptose và 3-deoxy-D-mannooctulosonic Acid (KDO, keto-deoxyoctulosonate). - O antigen (O polysaccharide hoặc O side chain) là domain ngoài cùng của LPS, O antigen gồm nhiều phiên bản lặp lại (thường là 10 – 30 lần) của một đơn vị oligosaccharide (O unit), mỗi đơn vị Oligosaccharide gồm khoảng từ 2 đến 6 phân tử đường. O antigen tồn tại ngay bề mặt của màng tế bào vi khuẩn do đó nó là mục tiêu nhận biết của kháng thể vật chủ. O antigen có tính chuyên biệt kháng nguyên cao, sự thay đổi trong cách sắp xếp và liên kết giữa các phân tử đường trong O unit tạo nên các cấu trúc khác nhau của O antigen, và cũng là đặc trưng cho việc nhận biết kháng nguyên.3: Cấu trúc của một phân tử Lipopolysaccharide (LPS) (http://nl.4: Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn gram âm (http://nl.org) Từ lâu LPS được coi là nội độc tố và là nhân tố gây đáp ứng miễn dịch mạnh ở động vật, LPS cũng tham gia vào quá trình sản xuất nhiều loại chất trung gian liên quan tới sốc nhiễm khuẩn, LPS hoạt động như một nội độc tố đầu tiên vì nó bám vào phức hợp receptor CD14/TLR4/MD2 và xúc tiến sự tiết các cytokine tiền viêm trong nhiều loại tế bào đặc biệt là ở đại thực bào.
Ngoài ra những nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy LPS có vai trò trong việc hoạt hóa nhiều nhân tố phiên mã. Trong quá trình tổng hợp LPS, lipid A và oligosaccharide lõi được tổng hợp cùng với nhau, trong khi O antigen được tổng hợp độc lập [ HYPERLINK \l "AVF98" 33 ].