Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới, ung thư gan là một trong năm nguyên nhân gây tử vong do ung thư hàng đầu trên phạm vi toàn cầu, cướp đi sinh mạng của khoảng 782.000 người mỗi năm và chiếm 8,2% tổng số ca tử vong do các bệnh ác tính. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh được ghi nhận ở mức báo động khi đứng thứ 4 trong tổng số 185 quốc gia và vùng lãnh thổ, với trung bình 23,2 ca mắc mới trên 100.000 dân. Đáng chú ý, ung thư biểu mô tế bào gan chiếm tỷ trọng áp đảo trên 80% tổng số các ca ung thư gan nguyên phát. Căn bệnh này diễn tiến âm thầm, phần lớn người bệnh chỉ phát hiện khi khối u đã tiến triển sang giai đoạn muộn hoặc di căn phức tạp.

Các phác đồ điều trị phổ biến hiện nay như phẫu thuật triệt căn, nút mạch hóa chất hoặc liệu pháp nhắm trúng đích bằng các thuốc ức chế đa kinase như Sorafenib thường bị giới hạn bởi nguy cơ kháng thuốc, độc tính hệ thống cao và chi phí điều trị vượt quá khả năng tài chính của nhiều hộ gia đình. Tình trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc nghiên cứu, phát triển các hoạt chất sinh học tự nhiên có khả năng ức chế tế bào ác tính chọn lọc, ít gây độc cho mô lành và có nguồn cung nội địa dồi dào. Cây tỏi nhiều nhánh tại huyện đảo Lý Sơn thuộc tỉnh Quảng Ngãi từ lâu đã nổi tiếng với hàm lượng hợp chất lưu huỳnh hữu cơ cao nhờ thổ nhưỡng bazan pha cát núi lửa độc nhất vô nhị.

Luận văn thạc sĩ tập trung giải quyết bài toán khoa học trên bằng mục tiêu đánh giá toàn diện tác động của cao chiết cồn ethanol từ tỏi Lý Sơn lên sự tăng sinh, biến đổi hình thái, chu trình chết theo chương trình và khả năng tạo khối u cầu của dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2. Công trình được triển khai thực nghiệm nghiêm ngặt tại phòng thí nghiệm Y Sinh thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên trong giai đoạn từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 10 năm 2021. Kết quả nghiên cứu xác lập chỉ số nồng độ ức chế 50% tăng trưởng tế bào đạt 0,64 mg/ml, tạo tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các dòng sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư từ nguồn dược liệu quý của biển đảo Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết y sinh học hiện đại:

Thứ nhất là lý thuyết chu kỳ tế bào và cơ chế chết theo chương trình. Chu kỳ tế bào bình thường được kiểm soát chặt chẽ qua các pha G1, S, G2 và M dưới sự điều hòa của các phức hợp cyclin và kinase phụ thuộc cyclin. Ngược lại, tế bào ung thư có khả năng bỏ qua các điểm kiểm soát nội bào để tăng sinh vô hạn. Quá trình apoptosis là cơ chế phòng vệ sinh học giúp cơ thể chủ động loại bỏ tế bào bất thường mà không gây viêm mô xung quanh. Cơ chế này được nhận diện thông qua hiện tượng co cụm tế bào, ngưng tụ chất nhiễm sắc và đặc biệt là sự phân cắt chuỗi DNA nhân thành các đoạn ngắn khoảng 180 cặp bazơ dưới tác động của enzyme endonuclease.

Thứ hai là lý thuyết tế bào gốc ung thư và mô hình nuôi cấy không gian ba chiều (3D). Khối u rắn bao gồm một quần thể tế bào không đồng nhất, trong đó tế bào gốc ung thư đóng vai trò hạt nhân thúc đẩy sự tái phát, di căn và kháng hóa trị. Khả năng tự làm mới của nhóm tế bào này được đánh giá chuẩn xác qua mô hình nuôi cấy hình thành khối u cầu trong môi trường nuôi cấy không bám dính, mô phỏng chân thực vi môi trường khối u trong cơ thể sống tốt hơn mô hình nuôi cấy hai chiều truyền thống.

Thứ ba là lý thuyết hóa dự phòng từ các hợp chất tự nhiên thuộc chi Allium. Hoạt chất sinh học chính trong củ tỏi bao gồm các hợp chất organosulfur dễ bay hơi và hòa tan như allicin, diallyl sulfide, diallyl disulfide, diallyl trisulfide và S-allylmercaptocysteine. Các hợp chất này được chứng minh có khả năng trung hòa gốc oxy phản ứng, ức chế enzyme tân tạo mạch máu do yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu điều hòa, từ đó ngăn chặn tế bào khối u tiếp cận nguồn dinh dưỡng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu thực vật sử dụng là 500 gam củ tỏi nhiều nhánh đạt độ thuần thục cao, không sâu bệnh, thu hái trực tiếp tại các hộ nông dân huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Mẫu thực vật được giám định tên khoa học là loài Allium sativum (L.) dựa trên hình thái thân củ có từ 12 đến 20 tép nhỏ. Mẫu củ được bóc vỏ, sấy khô trong tủ sấy chuyên dụng ở nhiệt độ 70 độ C suốt 48 giờ rồi nghiền thành bột mịn. Quá trình trích ly hoạt chất sử dụng 3 gam bột tỏi ngâm trong 30 ml cồn ethanol 95%, tiến hành lắc cơ học với tốc độ 200 vòng/phút trong 24 giờ. Dịch chiết sau đó được lọc qua giấy lọc chuyên dụng và làm bay hơi dung môi trong 48 giờ để thu cao chiết nguyên chất phục vụ thử nghiệm.

Đối tượng tế bào nghiên cứu là dòng ung thư biểu mô tế bào gan người HepG2 được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Sức khỏe và Y học Quốc gia Pháp (Inserm U1053). Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% huyết thanh bò thai và 1% kháng sinh penicillin/streptomycin ở điều kiện chuẩn 37 độ C với 5% khí carbonic.

Để đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng, phương pháp so màu đo hoạt tính khử muối tetrazolium (MTT) được lựa chọn nhờ độ nhạy quang học cao và khả năng phản ánh chính xác hoạt động chuyển hóa của enzyme ty thể trong tế bào sống. Tế bào được gieo với mật độ 5.000 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng, tiếp xúc với các nồng độ cao chiết gồm 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/ml trong 48 giờ. Mật độ quang được đo ở bước sóng 570 nm trên máy quang phổ vi thể nano. Phương pháp nhuộm loại trừ Trypan blue được dùng để kiểm tra tính toàn vẹn màng tế bào dưới kính hiển vi quang học đảo ngược.

Xác định tỷ lệ tế bào đi vào chu trình apoptosis được thực hiện bằng kỹ thuật đo dòng tế bào chảy trên hệ thống BD Accuri C6 Plus. Tế bào được nuôi với mật độ 200.000 tế bào/giếng trên đĩa 24 giếng, xử lý cao chiết ở các nồng độ 0,5 và 1,0 mg/ml, cố định bằng cồn 70% và nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Propidium Iodide để định lượng tiểu quần thể subG1 mang các đoạn DNA phân mảnh.

Thử nghiệm tạo khối u cầu 3D được tiến hành trên đĩa nuôi cấy có bề mặt xử lý chống bám dính với mật độ 3.000 tế bào/giếng trong môi trường chuyên biệt DMEM-F12 không huyết thanh, bổ sung 20 ng/ml yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi và 5 microgam/ml insulin. Số lượng các khối cầu được theo dõi và đếm ở ngày thứ 6 của chu trình nuôi cấy. Tất cả các thử nghiệm được thực hiện lặp lại độc lập 3 lần (n = 3), số liệu được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 thông qua kiểm định phi tham số Mann-Whitney U test với ngưỡng sai số ý nghĩa p nhỏ hơn hoặc bằng 0,05. Toàn bộ chuỗi thực nghiệm được hoàn tất trong mốc thời gian từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 10 năm 2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phát hiện thứ nhất: Cao chiết ethanol tỏi Lý Sơn thể hiện hoạt tính ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư gan HepG2 rất rõ rệt và phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ xử lý. Qua xét nghiệm MTT sau 48 giờ ủ, tỷ lệ tế bào sống sót giảm tuần tự từ 100% ở lô đối chứng âm xuống còn 88% ở nồng độ 0,25 mg/ml; 57,6% ở nồng độ 0,5 mg/ml; 39,8% ở nồng độ 1,0 mg/ml; 22,6% ở nồng độ 2,0 mg/ml và chỉ còn vỏn vẹn 7,5% ở nồng độ cao nhất 3,0 mg/ml. Giá trị ức chế 50% tăng trưởng tế bào (IC50) được xác định chính xác ở mức 0,64 mg/ml.

Phát hiện thứ hai: Cao chiết gây tổn hại nghiêm trọng đến hình thái học và tính toàn vẹn của màng tế bào. Khi quan sát tế bào HepG2 đối chứng, chúng thể hiện cấu trúc đa giác đặc trưng với kích thước từ 10 đến 20 micromet, bám dính thành lớp đơn bào đồng nhất trên bề mặt đáy đĩa. Ngược lại, khi tiếp xúc với cao chiết tỏi từ nồng độ 1,0 mg/ml trở lên, tế bào co rút thành dạng hình cầu, mất chân bám, kết cụm rời rạc và xuất hiện hiện tượng vỡ màng nguyên sinh chất. Dưới phép nhuộm Trypan blue, các tế bào bị hủy hoại màng bắt màu xanh đậm lan tỏa, chiếm gần như toàn bộ vi trường quan sát ở nồng độ 3,0 mg/ml.

Phát hiện thứ ba: Kích hoạt mạnh mẽ quá trình chết tế bào theo chương trình apoptosis thông qua phân mảnh DNA nhân. Kết quả phân tích tế bào dòng chảy sau khi nhuộm Propidium Iodide ghi nhận sự gia tăng vượt bậc của đỉnh subG1 đại diện cho quần thể tế bào có bộ gen bị phân cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 180 cặp bazơ. Tỷ lệ apoptosis tăng dần tương ứng với sự gia tăng nồng độ cao chiết từ 0,5 mg/ml đến 1,0 mg/ml so với nhóm tế bào không xử lý thuốc.

Phát hiện thứ tư: Ức chế triệt để khả năng tự làm mới và tạo khối u cầu của tế bào gốc ung thư gan trong điều kiện nuôi cấy 3D. Tại ngày thứ 6 sau khi nuôi cấy trên bề mặt chống bám dính, nhóm tế bào đối chứng hình thành dày đặc các khối u cầu tumorsphere có đường kính lớn và bờ viền rõ nét. Trong khi đó, ở các giếng bổ sung cao chiết tỏi Lý Sơn, số lượng và kích thước các khối u cầu bị suy giảm trên 60% so với đối chứng (p nhỏ hơn hoặc bằng 0,05), chứng minh hoạt chất cản trở hiệu quả tiềm năng phát triển khối u rắn.

Thảo luận kết quả

Cơ chế phân tử đằng sau khả năng ức chế tăng sinh và kích nổ chu trình chết tế bào của cao chiết tỏi Lý Sơn gắn liền với sự hiện diện dồi dào của các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ có hoạt tính sinh học cao như diallyl disulfide và diallyl trisulfide. Khi đi qua màng tế bào, các phân tử này làm gia tăng nồng độ các gốc oxy phản ứng nội bào, gây mất cân bằng oxy hóa khử và làm suy giảm điện thế màng ty thể. Hiện tượng này dẫn tới sự giải phóng cytochrome c vào bào tương, kích hoạt chuỗi enzyme caspase phân giải protein, làm sụp đổ bộ khung tế bào và kích hoạt endonuclease cắt đứt chuỗi xoắn kép DNA.

Khi so sánh với các công bố quốc tế, hiệu lực ức chế tế bào ung thư gan của tỏi Lý Sơn thể hiện ưu thế vượt trội. Một nghiên cứu công bố năm 2021 đánh giá cao chiết methanol từ tỏi đen trên dòng tế bào HepG2 ghi nhận chỉ số IC50 đạt 0,80 mg/ml, cao hơn so với mức 0,64 mg/ml của tỏi Lý Sơn trong nghiên cứu này. Điều đó chứng minh tỏi nhiều nhánh Lý Sơn dù ở dạng cao chiết thô vẫn có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh mẽ. Hơn thế nữa, một nghiên cứu khác khảo sát dịch chiết tỏi thông thường trên các dòng tế bào chuẩn người BJ và tế bào sừng HaCaT cho thấy giá trị IC50 dao động ở mức rất cao, từ 8,84 đến 10,86 mg/ml. Sự chênh lệch lớn này khẳng định đặc tính thổ nhưỡng đất đảo Lý Sơn giúp tích lũy hàm lượng hợp chất diallyl cao hơn rõ rệt so với các giống tỏi trồng ở đồng bằng.

Các dữ liệu thực nghiệm trong luận văn hoàn toàn có thể được trình bày một cách khoa học thông qua đồ thị đường cong liều - đáp ứng (Dose-response curve), với trục tung thể hiện tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót (0% đến 100%) và trục hoành thể hiện nồng độ cao chiết theo thang đo logarit. Đồng thời, kết quả đếm số lượng khối u cầu tumorsphere và tỷ lệ apoptosis đo bằng tế bào dòng chảy có thể được trực quan hóa sinh động bằng biểu đồ cột so sánh sai số chuẩn giữa các lô nồng độ với mức ý nghĩa thống kê p nhỏ hơn hoặc bằng 0,05, đi kèm bảng đối chiếu mật độ quang học OD ở bước sóng 570 nm.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình phân đoạn chiết xuất và tinh chế hoạt chất: Đề nghị các viện hóa học chuyên ngành và phòng thí nghiệm trọng điểm phối hợp ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn để tách riêng từng phân đoạn giàu allicin, diallyl disulfide và diallyl trisulfide từ tỏi Lý Sơn. Mục tiêu cần đạt là nâng độ tinh sạch của nhóm hoạt chất kháng u chính lên trên 85% trong khung thời gian 12 tháng, làm cơ sở sản xuất nguyên liệu dược dụng đạt tiêu chuẩn quốc tế.

Thứ hai, triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật sống in vivo: Các nhóm nghiên cứu y sinh cần thiết lập mô hình khối u gan dị ghép trên chuột nhắt trắng suy giảm miễn dịch để đánh giá tác dụng ức chế kích thước khối u, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn. Chỉ tiêu hành động là chứng minh hiệu quả giảm thể tích khối u tối thiểu 50% sau 4 tuần dùng thuốc và xác lập khoảng liều an toàn trên động vật trong vòng 18 tháng tới.

Thứ ba, nghiên cứu hệ mang dẫn thuốc hướng đích công nghệ nano: Khuyến nghị Bộ Khoa học và Công nghệ cùng các doanh nghiệp dược phẩm tài trợ dự án phát triển các hạt nano lipid hoặc liposome mang cao chiết tỏi Lý Sơn. Công nghệ bao gói này nhằm bảo vệ hoạt chất allicin kém bền, hạn chế sự bay hơi mùi nồng và tăng sinh khả dụng đường uống lên thêm 40% trong lộ trình nghiên cứu 24 tháng.

Thứ tư, quy hoạch và xây dựng vùng chuyên canh dược liệu tỏi Lý Sơn đạt chuẩn GACP-WHO: Ủy ban nhân dân huyện đảo Lý Sơn cùng Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần phê duyệt đề án bảo tồn nguồn gen tỏi nhiều nhánh bản địa, thiết lập 300 hecta đất canh tác an toàn sinh học theo chuẩn Thực hành tốt trồng trọt và thu hái dược liệu. Mục tiêu duy trì ổn định hàm lượng hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong củ tỏi khô đạt tối thiểu 1,5 gam trên mỗi kilôgam trong thời gian 3 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm thứ nhất: Học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học và Sinh học ứng dụng. Luận văn cung cấp bản thiết kế thực nghiệm chi tiết từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2D, mô hình tạo khối u cầu 3D đến quy trình đo huỳnh quang dòng tế bào chảy, là tài liệu tham khảo chuẩn mực để xây dựng các đề tài sàng lọc hoạt tính dược liệu từ thực vật bản địa.

Nhóm thứ hai: Các nhà khoa học, dược sĩ nghiên cứu và phát triển thuốc ung thư. Dữ liệu thực nghiệm về chỉ số IC50 đạt 0,64 mg/ml và cơ chế ức chế tế bào gốc khối u là dẫn chứng học thuật tin cậy để các chuyên gia thiết kế các dẫn xuất hóa dược bán tổng hợp hoặc thử nghiệm kết hợp với các thuốc ức chế đa kinase nhằm giảm liều dùng và độc tính của hóa trị.

Nhóm thứ ba: Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Các nhà hoạch định sản phẩm có thể ứng dụng quy trình trích ly ethanol 95% đơn giản nhưng hiệu suất cao của luận văn để đăng ký sáng chế, nghiên cứu dạng bào chế viên uống bổ trợ chức năng gan và phòng ngừa các tổn thương tiền ung thư gan từ nguồn nguyên liệu tỏi Lý Sơn chuẩn hóa.

Nhóm thứ tư: Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và chuyên gia dinh dưỡng lâm sàng. Nghiên cứu mang lại góc nhìn khoa học thực chứng về khả năng bảo vệ tế bào gan và gây độc chọn lọc tế bào ung thư của tỏi, hỗ trợ các chuyên gia y tế tư vấn chế độ dinh dưỡng giàu hoạt chất lưu huỳnh nhằm nâng cao thể trạng và hỗ trợ kiểm soát bệnh cho các đối tượng viêm gan mạn tính, xơ gan có nguy cơ chuyển thành ung thư.

Câu hỏi thường gặp

Cao chiết ethanol từ tỏi Lý Sơn có thể ức chế tế bào ung thư biểu mô gan ở mức độ nào? Kết quả thực nghiệm trên dòng tế bào HepG2 cho thấy cao chiết thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh rất mạnh mẽ với giá trị IC50 đạt 0,64 mg/ml. Khi nâng nồng độ xử lý lên 3,0 mg/ml, tỷ lệ tế bào sống sót giảm sâu xuống chỉ còn 7,5% so với mức 100% của nhóm đối chứng sau 48 giờ nuôi cấy.

Vì sao nghiên cứu lại triển khai mô hình nuôi cấy khối u cầu 3D bên cạnh nuôi cấy 2D truyền thống? Mô hình nuôi cấy hai chiều thông thường chỉ đánh giá được sự tăng sinh của tế bào bám dính đơn lớp. Thử nghiệm khối u cầu trong môi trường 3D chống bám dính tái tạo chính xác vi môi trường thiếu oxy và cấu trúc khối u rắn trong cơ thể, giúp chứng minh cao chiết tỏi có khả năng ức chế tế bào gốc ung thư giảm trên 60% sau 6 ngày.

Hợp chất nào trong củ tỏi Lý Sơn tạo nên hoạt tính kháng u vượt trội so với tỏi vùng khác? Củ tỏi Lý Sơn được trồng trên lớp đất đỏ bazan từ miệng núi lửa cổ kết hợp với cát san hô, giúp tích lũy hàm lượng hợp chất organosulfur cao bất thường. Các hoạt chất chủ chốt gồm allicin, diallyl disulfide và diallyl trisulfide có khả năng phá vỡ điện thế màng ty thể và kích nổ con đường apoptosis trong tế bào ác tính.

Biến đổi hình thái của tế bào HepG2 khi tiếp xúc cao chiết tỏi phản ánh hiện tượng sinh học gì? Tế bào bình thường có hình đa giác kích thước từ 10 đến 20 micromet bám chắc vào bề mặt nuôi cấy. Khi tiếp xúc cao chiết từ 1,0 mg/ml trở lên, tế bào co cụm hình cầu, mất chân bám, màng tế bào rách vỡ khiến thuốc nhuộm Trypan blue thâm nhập vào nhân, chứng tỏ tế bào đã chết hoặc ở giai đoạn cuối của chu trình apoptosis.

Bệnh nhân ung thư gan có thể dùng tỏi Lý Sơn ăn sống hàng ngày để thay thế thuốc điều trị không? Không thể thay thế thuốc điều trị chuyên khoa. Mặc dù tỏi chứa 1 đến 2 gam allicin trên mỗi kilôgam tỏi tươi, allicin là chất rất kém bền và bị enzym tiêu hóa phân hủy nhanh khi ăn qua đường miệng. Cao chiết trong nghiên cứu là dạng hoạt chất cô đặc, cần được tiếp tục bào chế thành dạng thuốc nano trước khi đưa vào ứng dụng lâm sàng chính thức.

Kết luận

  • Đã xác định chính xác danh pháp thực vật giống tỏi nhiều nhánh tại đảo Lý Sơn là loài Allium sativum (L.) và thiết lập thành công quy trình trích ly cao chiết thô bằng dung môi ethanol 95%.
  • Xác lập chỉ số ức chế IC50 trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 đạt 0,64 mg/ml, làm suy giảm tỷ lệ sống sót của tế bào xuống mức thấp kỷ lục là 7,5% tại nồng độ 3,0 mg/ml.
  • Làm sáng tỏ tác động hủy hoại hình thái tế bào, khiến tế bào HepG2 kích thước 10 đến 20 micromet co cụm, mất bám dính và phá vỡ màng tế bào rõ rệt qua phép nhuộm Trypan blue.
  • Chứng minh cơ chế kích hoạt con đường chết theo chương trình apoptosis thông qua định lượng sự gia tăng tiểu quần thể subG1 mang các đoạn DNA phân mảnh xấp xỉ 180 cặp bazơ trên hệ thống đo dòng tế bào chảy.
  • Ghi nhận hiệu lực ức chế vượt trội đối với sự hình thành khối u cầu 3D sau 6 ngày nuôi cấy, mở ra tiềm năng tiêu diệt tế bào gốc ung thư gan để ngăn chặn di căn và tái phát khối u.

Đóng góp cốt lõi của luận văn là lần đầu tiên cung cấp các chứng cứ sinh học phân tử vững chắc về tiềm năng kháng ung thư biểu mô tế bào gan của nguồn gen tỏi nhiều nhánh Lý Sơn bản địa. Lộ trình kế tiếp đòi hỏi các nhà khoa học nhanh chóng tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật trong vòng 18 tháng và hoàn thiện công nghệ nano hóa trong 24 tháng tới. Các doanh nghiệp và đơn vị y tế cần chủ động hợp tác đầu tư để sớm chuyển giao kết quả nghiên cứu thành chế phẩm dược liệu điều trị thực tiễn.