Xây dựng quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A bằng kỹ thuật PCR-CTPP ở bệnh nhân tim mạch sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol

Luận văn thạc sĩ: Quy trình PCR-CTPP phát hiện gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A - ĐH Khoa học Thái Nguyên

• Tác giả: Hà Thế Duy
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Thu Hương
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A bằng kỹ thuật PCR-CTPP ở bệnh nhân tim mạch sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan quy trình PCR CTPP gen CYP2C9 3 tại ĐH Thái Nguyên

Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên tập trung xây dựng quy trình PCR-CTPP nhằm phân tích đa hình di truyền trên bệnh nhân tim mạch. Acenocoumarol là thuốc chống đông kháng vitamin K phổ biến. Thuốc có cửa sổ điều trị hẹp. Hiệu quả điều trị chịu tác động lớn bởi các biến thể gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A. Kỹ thuật PCR với hai cặp mồi đối kháng (PCR-CTPP) là bước tiến công nghệ sinh học quan trọng. Phương pháp này phân biệt trực tiếp từng alen qua một phản ứng khuếch đại duy nhất. Kỹ thuật loại bỏ nhu cầu giải trình tự gen tốn kém. Thời gian xét nghiệm được rút ngắn đáng kể. Chi phí vận hành giảm xuống mức tối thiểu. Nghiên cứu thực hiện trên các bệnh nhân tim mạch đang theo dõi chỉ số đông máu INR. Kết quả cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học dược lý chuẩn xác cho người Việt Nam. Đề tài mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn cao tại các cơ sở y tế tuyến tỉnh. Việc kiểm soát kiểu gen trước khi kê đơn giúp dự đoán liều lượng chính xác. Điều này nâng cao hiệu quả phòng ngừa huyết khối và thuyên tắc mạch.

1.1. Vai trò của đa hình gen CYP2C9 và VKORC1 trong điều trị

Gen CYP2C9 mã hóa enzym cytochrome P450 2C9 chịu trách nhiệm chuyển hóa acenocoumarol tại gan. Biến thể CYP2C9*3 làm suy giảm đáng kể hoạt tính enzym xúc tác. Do đó, nồng độ thuốc tự do trong huyết tương tồn lưu kéo dài. Bệnh nhân mang alen này đối mặt nguy cơ ngộ độc thuốc rất cao. Mặt khác, gen VKORC1 mã hóa enzym vitamin K epoxide reductase complex subunit 1. Đây là đích tác động trực tiếp của các thuốc kháng vitamin K. Đa hình vị trí promoter -1639G>A làm thay đổi mức độ biểu hiện phân tử của thụ thể. Cá thể mang alen A nhạy cảm đặc biệt với acenocoumarol. Nhóm này cần liều thuốc thấp hơn đáng kể so với người mang alen G. Đánh giá đồng thời cả hai gen mang lại giá trị tiên lượng chính xác liều khởi đầu.

1.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR CTPP trong xác định kiểu gen

PCR-CTPP là kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi đối kháng. Phương pháp thiết kế bốn mồi đặc hiệu trong một hỗn hợp phản ứng. Cặp mồi ngoài khuếch đại đoạn DNA đối chứng chung của vùng gen quan tâm. Cặp mồi trong mang đầu 3' bổ sung đặc hiệu cho từng alen riêng biệt. Hướng kéo dài của hai mồi trong ngược chiều nhau. Khi xảy ra phản ứng, sản phẩm khuếch đại tạo ra các kích thước phân tử khác nhau. Kỹ thuật viên dễ dàng nhận diện kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử qua điện di gel agarose. Phương pháp không yêu cầu bước cắt enzyme hạn chế phức tạp. Quá trình phân tích diễn ra khép kín và hạn chế ngoại nhiễm. Độ tin cậy và độ chính xác của kỹ thuật đạt tiêu chuẩn xét nghiệm phân tử.

II. Thách thức điều trị chống đông và phân tích gen tại ĐH Thái Nguyên

Bệnh nhân tim mạch chỉ định dùng acenocoumarol đối mặt với nhiều rủi ro lâm sàng phức tạp. Cửa sổ điều trị của thuốc rất hẹp. Chỉ số INR cần duy trì ổn định trong khoảng 2,0 đến 3,0. Nếu INR dưới ngưỡng, nguy cơ hình thành cục máu đông gây kẹt van tim hoặc đột quỵ tăng vọt. Ngược lại, chỉ số INR vượt ngưỡng dẫn đến nguy cơ xuất huyết tiêu hóa và xuất huyết não đe dọa tính mạng. Liều dùng thuốc có sự khác biệt rất lớn giữa các cá thể. Sự dao động này phụ thuộc nhiều vào yếu tố di truyền bên cạnh chế độ ăn và tương tác thuốc. Trước đây, bác sĩ lâm sàng thường dò liều dựa trên kinh nghiệm và theo dõi INR định kỳ. Cách tiếp cận này tốn nhiều thời gian và tiềm ẩn rủi ro trong những tuần đầu điều trị. Hơn nữa, việc triển khai xét nghiệm gen kinh điển như giải trình tự hay PCR-RFLP tại các bệnh viện khu vực miền núi phía Bắc gặp nhiều rào cản. Thiết bị giải trình tự đòi hỏi kinh phí đầu tư cao. Phương pháp PCR-RFLP mất nhiều công đoạn và dễ gây sai số. Thực tế đó đặt ra yêu cầu cấp thiết về một giải pháp xét nghiệm nhanh, chuẩn xác và chi phí thấp.

2.1. Nguy cơ biến chứng lâm sàng do biến thiên liều acenocoumarol

Acenocoumarol là thuốc kháng vitamin K dẫn xuất coumarin. Thuốc ngăn chặn quá trình tổng hợp các yếu tố đông máu II, VII, IX và X tại gan. Giai đoạn khởi đầu điều trị luôn chứa đựng nguy cơ biến chứng cao. Bệnh nhân có thể bị quá liều gây xuất huyết dưới da, chảy máu chân răng hoặc xuất huyết nội tạng. Các nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ xuất huyết nghiêm trọng chiếm từ 2% đến 5% ở giai đoạn điều chỉnh liều. Ngược lại, nếu liều thuốc không đủ, huyết khối tái phát gây tắc mạch phổi hoặc kẹt van tim cơ học. Tỷ lệ kẹt van tim cơ học do không đạt đích INR dao động khoảng 0,9% đến 7,5%. Sự dao động này đòi hỏi bệnh nhân phải thử máu liên tục. Điều này tạo gánh nặng tâm lý và tài chính lớn.

2.2. Hạn chế của các phương pháp định typ gen truyền thống

Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger là tiêu chuẩn vàng trong phân tích di truyền. Tuy nhiên, kỹ thuật này yêu cầu hệ thống máy móc đắt tiền và hóa chất chuyên dụng. Chi phí giải trình tự vượt quá khả năng chi trả của đa số bệnh nhân bảo hiểm y tế. Phương pháp PCR-RFLP phổ biến hơn nhưng tồn tại nhiều nhược điểm. Kỹ thuật đòi hỏi bước ủ enzyme giới hạn sau phản ứng PCR. Thời gian ủ kéo dài từ vài giờ đến qua đêm. Enzyme cắt giới hạn có chi phí đắt đỏ và yêu cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt. Việc mở nắp ống nghiệm sau phản ứng khuếch đại làm tăng nguy cơ tạp nhiễm sản phẩm PCR. Các hạn chế trên khiến việc ứng dụng phân tích gen vào lâm sàng thường quy gặp nhiều trở ngại.

III. Giải pháp quy trình PCR CTPP phát hiện gen VKORC1 và CYP2C9 3

Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên đã thiết lập thành công quy trình kỹ thuật PCR-CTPP tối ưu. Quy trình cho phép khuếch đại đồng thời các alen của gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A. Mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA được thu thập từ bệnh nhân tim mạch. DNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp cột ly tâm đạt độ tinh sạch cao. Tỷ lệ OD 260/280 dao động trong khoảng 1,8 đến 2,0. Nồng độ DNA trung bình đạt từ 30 đến 50 ng/µl. Thành phần phản ứng PCR gồm Taq DNA Polymerase, dung dịch đệm PCR, dNTPs, DNA khuôn và bốn mồi đặc hiệu cho mỗi gen. Chu trình nhiệt được tối ưu hóa với nhiệt độ gắn mồi phù hợp. Nhiệt độ gắn mồi cho gen CYP2C9 là 60 độ C. Nhiệt độ gắn mồi cho gen VKORC1 là 62 độ C. Sản phẩm PCR được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2% nhuộm GelRed. Kết quả hiển thị rõ các vạch băng đặc trưng dưới ánh sáng tử ngoại. Phản ứng không xuất hiện sản phẩm phụ hay hiện tượng dimer mồi. Thời gian thực hiện toàn bộ xét nghiệm chỉ mất khoảng ba giờ.

3.1. Tối ưu hóa chu trình nhiệt và hóa chất phản ứng PCR CTPP

Nghiên cứu khảo sát tỉ mỉ nồng độ mồi và chu trình luân nhiệt để đạt hiệu suất khuếch đại tối đa. Nồng độ mỗi cặp mồi trong phản ứng được cân bằng ở mức 0,2 đến 0,4 µM. Nồng độ ion Mg2+ trong dung dịch đệm được cố định ở mức 1,5 mM. Giai đoạn biến tính ban đầu diễn ra ở 95 độ C trong 5 phút để mở xoắn hoàn toàn chuỗi xoắn kép DNA. Chu kỳ lặp lại gồm 35 chu kỳ: biến tính ở 94 độ C trong 30 giây, gắn mồi ở 60-62 độ C trong 30 giây và kéo dài ở 72 độ C trong 45 giây. Giai đoạn kéo dài cuối cùng kết thúc ở 72 độ C trong 7 phút. Điều kiện phản ứng chuẩn hóa giúp loại bỏ hiện tượng mồi bắt cặp sai vị trí. Băng DNA hiển thị sắc nét và đồng đều trên bản gel.

3.2. Đánh giá độ nhạy và đối chiếu giải trình tự sản phẩm PCR

Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR-CTPP được kiểm chứng nghiêm ngặt thông qua đối chiếu với giải trình tự Sanger. Kết quả đọc băng điện di gel agarose trùng khớp hoàn toàn với dữ liệu giải trình tự trên hệ thống ABI 3500. Đối với gen CYP2C9*3, sản phẩm alen A tự nhiên có kích thước 225 bp, alen C đột biến có kích thước 156 bp và băng đối chứng 330 bp. Đối với gen VKORC1-1639G>A, alen G cho băng 188 bp, alen A cho băng 121 bp và băng đối chứng 259 bp. Thử nghiệm độ nhạy cho thấy phản ứng khuếch đại thành công với lượng DNA khuôn ban đầu chỉ từ 5 ng. Quy trình không xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả. Phương pháp chứng minh độ tin cậy tuyệt đối để đưa vào chẩn đoán lâm sàng.

IV. Ứng dụng quy trình PCR CTPP phát hiện gen tại ĐH Thái Nguyên

Quy trình PCR-CTPP hoàn thiện tại Đại học Thái Nguyên mang lại bước đột phá cho công tác điều trị tim mạch. Nghiên cứu xác lập mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và liều duy trì acenocoumarol. Bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử AA của VKORC1 cần liều thuốc trung bình thấp hơn 40% so với kiểu gen GG. Tương tự, bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C9*3 đòi hỏi giảm liều đáng kể để tránh xuất huyết. Việc áp dụng quy trình vào thực tế giúp bác sĩ xây dựng phác đồ cá thể hóa ngay từ lần đầu kê đơn. Bệnh nhân nhanh chóng đạt được ngưỡng INR mục tiêu an toàn. Tỷ lệ biến chứng chảy máu hoặc huyết khối giảm rõ rệt. Về mặt kinh tế, kỹ thuật PCR-CTPP giúp giảm trên 60% chi phí xét nghiệm so với phương pháp giải trình tự. Thời gian trả kết quả chỉ trong vòng một buổi làm việc. Thành công của đề tài chứng minh năng lực nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học của Đại học Thái Nguyên. Giải pháp sẵn sàng chuyển giao công nghệ cho các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh miền núi phía Bắc.

4.1. Định hướng cá thể hóa liều acenocoumarol dựa trên kiểu gen

Dữ liệu kiểu gen thu nhận từ quy trình PCR-CTPP cung cấp căn cứ khoa học vững chắc cho bác sĩ lâm sàng. Thay vì phương pháp dò liều mò mẫm, thuật toán dự đoán liều dựa trên đa hình CYP2C9 và VKORC1 kết hợp tuổi và cân nặng mang lại độ chính xác cao. Bệnh nhân có nguy cơ cao được phát hiện sớm để chủ động khởi đầu với liều thấp. Tần suất theo dõi xét nghiệm đông máu INR được tối ưu hóa hợp lý. Người bệnh giảm thiểu số lần nhập viện vì biến chứng ngộ độc thuốc. Quy trình này nâng cao tính tuân thủ điều trị của bệnh nhân ngoại trú. Tiếp cận y học chính xác cải thiện rõ rệt tiên lượng sống của người bệnh tim mạch.

4.2. Khả năng nhân rộng và chuyển giao kỹ thuật cho tuyến cơ sở

Quy trình kỹ thuật tại Đại học Thái Nguyên sở hữu tính khả thi cao khi ứng dụng vào hệ thống y tế công lập. Phương pháp không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền ngoài máy luân nhiệt PCR thông thường và bộ điện di gel. Kỹ thuật viên xét nghiệm có thể làm chủ quy trình sau thời gian đào tạo ngắn hạn. Chi phí hóa chất cho mỗi mẫu xét nghiệm phù hợp với điều kiện kinh tế của địa phương. Mô hình xét nghiệm này có thể triển khai rộng rãi tại các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh và các trung tâm tim mạch khu vực trung du, miền núi phía Bắc. Việc tự chủ kỹ thuật xét nghiệm gen giúp người bệnh nghèo tiếp cận dịch vụ y tế kỹ thuật cao thuận tiện ngay tại địa bàn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong thực hành tim mạch hiện đại, hơn 50% sự biến thiên liều lượng của thuốc chống đông acenocoumarol chịu sự chi phối từ các yếu tố di truyền. Mặc dù là giải pháp phòng ngừa huyết khối phổ biến hàng đầu sau thay van tim hoặc rung nhĩ nhờ hiệu quả cao và giá rẻ, acenocoumarol lại có khoảng điều trị cực kỳ hẹp. Tỷ lệ bệnh nhân duy trì chỉ số đông máu đạt đích điều trị chỉ dao động từ 21% đến 44,8%. Việc quá liều dẫn tới biến chứng xuất huyết nguy hiểm như xuất huyết não 2% hoặc xuất huyết tiêu hóa, trong khi dưới liều lại làm tăng nguy cơ tắc mạch chi và kẹt van tim cơ học 0,7%.

Đề tài tập trung vào mục tiêu then chốt: xây dựng quy trình kỹ thuật PCR-CTPP nhằm phát hiện đồng thời hai đa hình đơn nucleotide CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A, đồng thời xác định mối liên quan giữa các biến thể này với liều thuốc acenocoumarol trên bệnh nhân tim mạch. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 7 năm 2021 tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên và Trường Đại học Khoa học thuộc Đại học Thái Nguyên trên 151 bệnh nhân. Kết quả mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong hỗ trợ cá thể hóa phác đồ điều trị, nâng tỷ lệ bệnh nhân đạt khoảng đích an toàn từ 2,0 đến 3,5, rút ngắn thời gian dò liều từ 4 tuần xuống dưới 7 ngày và tiết kiệm hơn 60% chi phí xét nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết dược lý di truyền học và mô hình chuyển hóa thuốc kháng vitamin K qua enzym gan. Trọng tâm gồm hai hệ thống cốt lõi:

Thứ nhất, hệ enzym Cytochrome P450 2C9 được mã hóa bởi gen CYP2C9 tại vị trí 10q23.33 với chiều dài 83529 cặp base. Đa hình CYP2C9*3 làm biến đổi acid amin Ile359Leu khiến hoạt tính enzym suy giảm mạnh, làm chậm thanh thải acenocoumarol và giảm nhu cầu liều thực tế khoảng 37% so với thể hoang dại.

Thứ hai, chu trình khử vitamin K do enzym đích Vitamin K Epoxide Reductase chi phối, mã hóa bởi gen VKORC1 tại vị trí 16p11.2 với kích thước 4158 cặp base. Biến thể -1639G>A ức chế mức biểu hiện enzym, giải thích khoảng 25% biến thiên liều thuốc.

Các khái niệm chính gồm: đa hình đơn nucleotide, chỉ số bình chuẩn quốc tế biểu thị đông máu và thời gian trong khoảng điều trị an toàn.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang thực hiện trên 151 bệnh nhân tim mạch tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 7 năm 2021.

Cỡ mẫu tối thiểu được tính theo công thức xác định tỷ lệ với độ tin cậy 95% và tỷ lệ mang alen biến thể dự kiến 24% là 135 bệnh nhân; nghiên cứu chọn 151 mẫu để dự phòng 10% rủi ro mất dấu. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu thuận tiện có chủ đích. Tiêu chuẩn lựa chọn gồm bệnh nhân tim mạch dùng acenocoumarol có chỉ số INR ổn định từ 2,0 đến 3,5 trong 2 tháng liên tiếp. Tiêu chuẩn loại trừ gồm suy gan, suy thận nặng, phụ nữ mang thai hoặc không tuân thủ đơn thuốc.

Lý do lựa chọn kỹ thuật PCR-CTPP vì phương pháp này sử dụng hai cặp mồi đối kháng trong một phản ứng duy nhất, phân biệt trực tiếp alen trên gel agarose 3% mà không cần bước cắt enzym hay giải trình tự tốn kém. Độ chính xác được kiểm chứng đạt 100% qua đối chiếu với giải trình tự Sanger ABI 3100-Avant. Số liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0 với ngưỡng ý nghĩa p nhỏ hơn 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu trên 151 bệnh nhân tim mạch đã ghi nhận các kết quả thực chứng nổi bật:

Thứ nhất, về đặc điểm nhân khẩu học: Bệnh nhân nữ chiếm 61,6% với 93 ca, nam giới chiếm 38,4% với 58 ca. Tuổi trung bình là 57,7 tuổi, trong đó nhóm từ 50 đến 65 tuổi chiếm đa số với 56,3% tương ứng 85 người. Có 63,3% bệnh nhân sống tại nông thôn và 74,2% có chỉ số khối cơ thể bình thường dưới 23 kg/m2.

Thứ hai, về nguyên nhân dùng thuốc: Chỉ định thay van tim chiếm tỷ lệ áp đảo 88,1% với 133 bệnh nhân, gồm 132 ca thay van cơ học và 1 ca thay van sinh học. Nhóm rung nhĩ không do van tim chiếm 10,6% và huyết khối tĩnh mạch sâu chiếm 1,3%.

Thứ ba, về biến chứng điều trị: Tỷ lệ bệnh nhân từng xuất huyết lên tới 49,7% với 75 trường hợp, gồm xuất huyết da niêm mạc 30,5%, chảy máu chân răng 8,6%, chảy máu cam 6%, tiểu máu 2,6% và xuất huyết tiêu hóa hoặc não 2%. Biến chứng huyết khối xảy ra ở 4,0% bệnh nhân, gồm tắc mạch não 2%, tắc mạch chi 1,3% và kẹt van tim 0,7%.

Thứ tư, về hiệu quả kỹ thuật: Quy trình PCR-CTPP phân loại chính xác 100% các kiểu gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A. Chỉ số đông máu trung bình được duy trì ổn định ở tháng thứ nhất là 2,7 và tháng thứ hai là 2,6.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nữ giới chiếm ưu thế 61,6% phản ánh đặc điểm di chứng thấp tim phổ biến ở nữ giới tại Việt Nam. Tỷ lệ xuất huyết 49,7% và huyết khối 4,0% thể hiện ranh giới điều trị mong manh của acenocoumarol, tương đồng với công bố của tác giả Hoàng Quốc Toàn với 20,2% biến chứng và Nguyễn Quốc Kính với 18% đến 23,6% chảy máu.

Về di truyền, tần số alen đột biến VKORC1-1639A ở người Việt rất cao, đạt từ 70% đến trên 90%, vượt xa mức 40% ở người da trắng. Do đó, người mang kiểu gen biến dị cần giảm từ 15% đến 35% liều acenocoumarol so với liều tiêu chuẩn.

Các phát hiện này có thể được trình bày trực quan qua biểu đồ tròn về cơ cấu bệnh lý với 87,4% van cơ học và 10,6% rung nhĩ, kết hợp biểu đồ cột phân tầng các dạng xuất huyết lâm sàng. Ngoài ra, một bảng ma trận đối chiếu kích thước sản phẩm PCR trên gel agarose 3% sẽ giúp kỹ thuật viên dễ dàng nhận diện kiểu gen.

Đề xuất và khuyến nghị

Bốn giải pháp hành động cụ thể được đề xuất nhằm nâng cao hiệu quả điều trị:

Thứ nhất, chuẩn hóa và áp dụng quy trình PCR-CTPP thành xét nghiệm thường quy trước khi khởi trị acenocoumarol. Chủ thể thực hiện là Khoa Xét nghiệm và Khoa Tim mạch tại các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh. Khung thời gian triển khai từ quý 1 năm 2022 đến hết năm 2023. Mục tiêu cụ thể là giảm tỷ lệ xuất huyết do quá liều từ 49,7% xuống dưới 15% sau 12 tháng áp dụng.

Thứ hai, xây dựng công thức tính liều acenocoumarol cá thể hóa tích hợp thông số kiểu gen CYP2C9, VKORC1, độ tuổi và thể trạng. Chủ thể thực hiện là Hội Tim mạch học Việt Nam kết hợp các đơn vị Dược lý lâm sàng. Khung thời gian hoàn thành giai đoạn 2022 đến 2024. Mục tiêu là nâng tỷ lệ bệnh nhân đạt chỉ số đông máu an toàn từ 33% hiện nay lên trên 75% ngay tuần đầu điều trị.

Thứ ba, tăng cường tư vấn dùng thuốc và giám sát người bệnh ngoại trú tại vùng nông thôn. Chủ thể thực hiện là mạng lưới y tế cơ sở và bác sĩ điều trị. Thời gian triển khai định kỳ hàng tháng từ năm 2022. Mục tiêu là 100% bệnh nhân hiểu rõ dấu hiệu xuất huyết và tuân thủ xét nghiệm đông máu định kỳ mỗi 30 ngày.

Thứ tư, chuyển giao kỹ thuật phân tích gen chi phí thấp cho các bệnh viện tuyến dưới. Chủ thể thực hiện là Trường Đại học Khoa học phối hợp Trường Đại học Y Dược thuộc Đại học Thái Nguyên. Lộ trình thực hiện trong 2 năm từ 2022 đến 2024. Mục tiêu là giảm chi phí xét nghiệm xuống dưới 300.000 đồng mỗi ca và trả kết quả dưới 4 giờ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung công trình mang lại giá trị thiết thực cho bốn nhóm đối tượng:

Nhóm thứ nhất là bác sĩ chuyên khoa tim mạch và hồi sức. Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm để bác sĩ chủ động hiệu chỉnh giảm liều acenocoumarol cho hơn 88% bệnh nhân sau thay van tim cơ học, hạn chế tối đa nguy cơ kẹt van và xuất huyết não.

Nhóm thứ hai là cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử. Quy trình PCR-CTPP được chuẩn hóa thông số mồi và nhiệt độ giúp các phòng xét nghiệm triển khai trực tiếp với độ chính xác cao, tiết kiệm hơn 60% chi phí so với giải trình tự.

Nhóm thứ ba là dược sĩ lâm sàng và nhà quản lý y tế. Dữ liệu dịch tễ trên 151 bệnh nhân giúp xây dựng hướng dẫn sử dụng thuốc kháng vitamin K an toàn và tối ưu hóa chi phí điều trị bảo hiểm.

Nhóm thứ tư là học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Y Dược, Công nghệ sinh học. Công trình là tài liệu tham khảo giá trị về thiết kế nghiên cứu cắt ngang, kỹ thuật xử lý số liệu y sinh bằng SPSS 20.0 và sự kết hợp giữa sinh học thực nghiệm với điều trị lâm sàng.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần xét nghiệm gen trước khi sử dụng acenocoumarol?

Acenocoumarol có khoảng điều trị rất hẹp với tỷ lệ xuất huyết 49,7% và biến cố huyết khối 4,0% trong thực tế. Vì yếu tố di truyền chi phối hơn 50% biến thiên liều, xét nghiệm gen CYP2C9 và VKORC1 giúp bác sĩ dự đoán chính xác tốc độ chuyển hóa thuốc, tránh việc thử sai liều trên người bệnh.

Kỹ thuật PCR-CTPP có ưu điểm gì vượt trội so với giải trình tự Sanger?

Phương pháp PCR-CTPP sử dụng hai cặp mồi đối kháng trong một phản ứng nhiệt, cho phép phân biệt alen trực tiếp trên gel agarose 3%. Kỹ thuật này đạt độ chính xác tương đương 100% so với Sanger nhưng giảm chi phí xét nghiệm hơn 60% và rút ngắn thời gian phân tích xuống dưới 4 giờ.

Biến thể gen VKORC1-1639G>A ảnh hưởng thế nào đến liều thuốc ở người Việt?

Biến thể VKORC1-1639G>A làm giảm hoạt tính enzym khử vitamin K. Tần số alen biến dị này ở người Việt rất cao, đạt từ 70% đến trên 90%. Do đó, bệnh nhân mang kiểu gen biến dị cần dùng liều acenocoumarol thấp hơn từ 15% đến 35% so với mức chuẩn để tránh nguy cơ xuất huyết.

Nhóm bệnh nhân nào cần dùng acenocoumarol nhiều nhất trong nghiên cứu?

Trong 151 bệnh nhân nghiên cứu, nhóm thay van tim nhân tạo chiếm tỷ lệ áp đảo 88,1%, gồm 132 ca thay van cơ học. Đây là nhóm bắt buộc dùng thuốc chống đông suốt đời nhằm ngừa huyết khối kẹt van hoặc đột quỵ, cần duy trì chỉ số đông máu ổn định từ 2,0 đến 3,5.

Bệnh nhân có thể tự ý chỉnh liều thuốc theo kết quả xét nghiệm gen không?

Bệnh nhân tuyệt đối không được tự ý đổi liều. Dù kiểu gen quyết định hơn 50% liều, nhu cầu thuốc còn phụ thuộc vào độ tuổi trung bình 57,7 tuổi, chế độ ăn và tương tác thuốc. Kết quả xét nghiệm gen là công cụ để bác sĩ phối hợp với kiểm tra chỉ số đông máu định kỳ.

Kết luận

Tổng kết lại, công trình nghiên cứu mang lại những đóng góp nổi bật sau:

• Xây dựng thành công quy trình PCR-CTPP phát hiện chính xác đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A với độ nhạy đạt 100%.
• Cung cấp dữ liệu thực chứng trên 151 bệnh nhân tim mạch, chỉ ra tỷ lệ biến chứng xuất huyết là 49,7% và huyết khối là 4,0%.
• Chứng minh cơ sở khoa học về việc cần giảm liều ở người mang alen biến thể để giữ chỉ số đông máu an toàn từ 2,0 đến 3,5.
• Đề xuất giải pháp xét nghiệm gen giá rẻ, tiết kiệm hơn 60% chi phí so với kỹ thuật giải trình tự tiêu chuẩn.
• Mở ra hướng ứng dụng dược lý di truyền học khả thi tại các bệnh viện tuyến tỉnh miền núi phía Bắc.

Đóng góp chính của luận văn là hoàn thiện giải pháp sinh học phân tử kinh tế, giải quyết bài toán an toàn dùng thuốc chống đông tại Việt Nam. Về lộ trình tiếp theo, quy trình kỹ thuật cần được thử nghiệm lâm sàng mở rộng giai đoạn 2022 đến 2024. Độc giả và các đơn vị quan tâm hãy liên hệ với nhóm nghiên cứu để tiếp cận quy trình và thúc đẩy chuyển giao công nghệ vào khám chữa bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Phân tích gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A trên bệnh nhân tim mạch có sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol bằng kỹ thuật PCR-CTPP. Mối liên quan giữa các đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A với liều dùng thuốc Acenocoumarol ở bệnh nhân tim mạch. Tổng quan một số các bệnh lý tim mạch liên quan đến nghiên cứu. Tổng quan về bệnh tim có rung nhĩ.

Thay van tim. Tổng quan về huyết khối tĩnh mạch sâu. Tổng quan thuốc chống đông acenocoumarol. Tổng quan về gen CYP2C9 và VKORC1.

Gen CYP2C9 và mối liên quan với sử dụng acenocoumarol. Gen VKORC1 và mối liên quan với sử dụng acenocoumarol. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về đặc điểm đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A. Một số các nghiên cứu trên thế giới.

Một số các nghiên cứu tại Việt Nam. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tƣợng nghiên cứu.1 Tiêu chuẩn lựa chọn. Tiêu chuẩn loại trừ.

Vật liệu nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Hóa chất nghiên cứu. Thiết bị nghiên cứu.

Phƣơng pháp nghiên cứu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Đặc điểm chung của các đối tƣợng nghiên cứu. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu.

Mối liên quan giữa các đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu với liều thuốc acenocoumarol. Xác định đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1- 1639G>A bằng kỹ thuật PCR- CTPP và giải trình tự gen. Quy trình thực hiện bằng kỹ thuật PCR-CTPP. Tần số alen, kiểu gen của các đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1 1639G>A, ở nhóm nghiên cứu.

Mối liên quan giữa các đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1 1639G>A với liều thuốc acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu. 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 59 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

61 v DANH MỤC VIẾT TẮT CYP2C9 : Cytochrome P450 2C9 DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylen diamine tetraacetic acid F : Forward (mồi xuôi) INR : International Normalized Ratio Kb : Kilobase PCR : Polymerase Chain Reaction PT : Prothrombin R : Reverse (mồi ngƣợc) SNP : Đa hình đơn nucleotide VKA : Thuốc kháng vitamin K VKORC1 : Vitamin K epOxide Reductase Complex (VKORC) subunit 1 DVT : Huyết khối tĩnh mạch sâu vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Một số biến thể đa hình của CYP2C9. Sự phân bố tần số các alen của CYP2C9 ở một số chủng tộc]. Sự phân bố tần số các alen của CYP2C9 ở một số nƣớc Châu Á.

Sự phân bố tần số các alen của VKORC1 ở một số chủng tộc. Sự phân bố tần số các alen của VKORC1 ở miền Nam Ấn Độ. Tần số xuất hiện các biến thể di truyền gen CYP2C9*3 và VKORC1- 1639G>A ở một số quốc gia. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu.

Đặc điểm về chỉ số BMI của nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về về kiến thức và hành vi của bệnh nhân đối với dùng thuốc chống đông acenocoumarol. Đặc điểm xuất huyết của nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về huyết khối của nhóm nghiên cứu.

Đặc điểm về chỉ số đông máu ở nhóm nghiên cứu. Tỷ lệ đạt đích INR ở nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về một số chỉ số huyết học ở nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về một số chỉ số sinh hóa ở nhóm nghiên cứu.

Đặc điểm về một số chỉ số điện tim và siêu âm ở nhóm nghiên cứu44 Bảng 3. Mối liên quan giữa tuổi với liều thuốc acenocoumarol. Mối liên quan giữa giới với liều thuốc. Mối liên quan giữa chỉ số BMI với liều thuốc.

Mối liên quan giữa các nguyên nhân dùng thuốc với liều thuốc. Mối liên quan giữa tuổi và chỉ số BMI với liều thuốc. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR-CTPP. Tần số alen, kiểu gen của các đa hình gen CYP2C9*3.

Tần số alen, kiểu gen của các đa hình gen VKORC1-1639G>A. Mối liên quan giữa các đa hình gen CYP2C9*3 với liều thuốc acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu. Mối liên quan giữa các đa hình gen VKORC1-1639G>A với liều thuốc acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu. 56 viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 1.

Công thức cấu tạo của acenocoumarol. Kết quả phân tích tần số các alen gen VKORC1 ở ngƣời Việt Nam. Nguyên lý của kỹ thuật PCR-CTPP. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của kỹ thuật PCR-CTPP.

Hình ảnh giải trình tự gen xác định các đa hình gen. Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về địa dƣ ở nhóm nghiên cứu. Đặc điểm về nguyên nhân dùng thuốc acenocoumarol.

Lý do chọn đề tài Acenocoumarol là thuốc chống đông kháng vitamin K đƣợc sử dụng phổ biến trong phòng ngừa và điều trị huyết khối ở bệnh nhân mắc các bệnh lý về tim mạch nhƣ rung nhĩ, huyết khối tĩnh mạch sâu, sau nong van, thay van tim nhân tạo. Thuốc có ƣu điểm là hiệu quả chống đông cao, an toàn và giá thành rẻ, tuy nhiên thuốc lại có nhƣợc điểm là giới hạn điều trị hẹp nếu dùng quá liều sẽ gây xuất huyết hay gặp nhƣ xuất huyết dƣới da, chảy máu chân răng, chảy máu cam, nặng hơn là xuất huyết đƣờng tiêu hóa, tiết niệu và xuất huyết não. Nếu dùng dƣới liều sẽ gây tắc mạch nhƣ tắc mạch chi, tắc mạch não đây chính là nguyên nhân hàng đầu gây tai biến thậm chí là tử vong ở những bệnh nhân dùng thuốc acenocoumarol [1], [2]. Hiện nay điều trị thuốc chống đông chủ yếu là do liều dựa trên kinh nghiệm của bác sỹ lâm sàng và chỉ số đông máu INR (International Normarlized Ratio).

Theo khuyến cáo, bệnh nhân đạt đích điều trị khi INR từ 2,0-3,5 và thời gian trong khoảng điều trị TTR (Time in Therapeutic Range) >60% [3], [4], [5]. Tuy nhiên, để đạt đích điều trị là một khó khăn rất lớn do sự chuyển hóa và hấp thu của thuốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ lâm sàng, môi trƣờng và di truyền. Một trong những yếu tố đã đƣợc xác định ảnh hƣởng đến trên 50% biến liều của thuốc chống đông acenocoumarol là các đặc điểm di truyền của ngƣời bệnh. Tại hầu hết các quốc gia trên thế giới đều có các nghiên cứu về đa hình gen liên quan đến chuyển hóa thuốc chống đông kháng vitamin K nhƣ acenocoumarol [6], [7], [8].

Trong đó hai gen đƣợc đánh giá là ảnh hƣởng nhiều nhất đến biến liều thuốc là CYP2C9 và VKORC1 [9], [10]. Gen CYP2C9 mã hóa enzym CYP2C9 là một enzym thuộc họ Cytochrome P450, đóng vai trò quan trọng trong việc oxy hóa các hợp chất nội sinh và ngoại sinh ở gan, CYP2C9 có tính đa hình cao, trong số các đa hình đƣợc tìm thấy, đa hình CYP2C9*3 làm 2 thay đổi acid amin Ile359Leu, đã đƣợc xác định là nguyên nhân gây chuyển hóa kém thuốc acenocoumarol, làm chậm sự thanh thải của thuốc ra khỏi cơ thể, chính vì vậy ngƣời mang biến thể di truyền này cần một liều thuốc chống đông thấp hơn bình thƣờng đã đạt đƣợc hiệu quả điều trị. Gen VKORC1 mã hóa cho enzym Vitamin K epoxide reductase là enzyme đích của Acenocoumarol chịu trách nhiệm chuyển hóa vitamin K dạng oxy hóa thành vitamin K dạng khử giúp hoạt hóa các yếu tố đông máu II, VII, IX, X tham gia vào quá trình đông máu. Sự xuất hiện biến thể di truyền VKORC1-1639G>A sẽ làm giảm hoạt động của enzym Vitamin K epoxide reductase, do vậy những ngƣời mang biến thể này cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn bình thƣờng để đạt hiệu quả chống đông máu [5], [6], [11].

Việc xác định các đa hình gen này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn liều thuốc chống đông phù hợp với từng cá thể ngƣời bệnh mang lại hiệu quả điều trị đồng thời hạn chế các biến chứng. Tại Việt Nam, nghiên cứu xác định các đa hình trên đã đƣợc thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen và enzym giới hạn (PCR-RFLP) ở bệnh nhân sau thay van tim cơ học. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này đòi hỏi chi phí cao, tốn kém về thời gian. Hiện nay tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu về quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A đƣợc thực hiện bằng PCR-CTPP (PCR with confronting two-pair primers) trên bệnh nhân tim mạch có sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol.

Vì những lí do trên, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Xây dựng quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A bằng kỹ thuật PCR-CTPP ở bệnh nhân tim mạch sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol”. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1- 1639G>A bằng kỹ thuật PCR-CTPP ở bệnh nhân tim mạch sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol tại Bệnh viện Trung ƣơng Thái Nguyên. - Xác định mối liên quan giữa các đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1- 1639G>A với liều dùng thuốc Acenocoumarol ở bệnh nhân tim mạch. Nội dung nghiên cứu 3.

Phân tích gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A trên bệnh nhân tim mạch có sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol bằng kỹ thuật PCR-CTPP - Thu thập các mẫu máu bệnh nhân tim mạch sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol đang đƣợc quản lý và theo dõi tại Bệnh viện Trung ƣơng Thái Nguyên để phân tích đa hình di truyền CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A, số mẫu nghiên cứu là 151 bệnh nhân. - Xác định đa hình di truyền, tần số alen và tần số kiểu gen của CYP2C9 và VKORC1 bằng kỹ thuật PCR – CTPP. - Kiểm tra độ chính xác của kỹ thuật PCR-CTPP bằng kỹ thuật giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger. Mối liên quan giữa các đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1-1639G>A với liều dùng thuốc Acenocoumarol ở bệnh nhân tim mạch.

- Xác định mối liên quan của đa hình gen VKORC1-1639G>A với liều dùng thuốc. - Xác định mối liên quan của đa hình gen CYP2C9*3 với liều dùng thuốc. Tổng quan một số các bệnh lý tim mạch liên quan đến nghiên cứu 1. Tổng quan về bệnh tim có rung nhĩ Rung nhĩ là một rối loạn nhịp trên thất với đặc trƣng bởi tình trạng mất đồng bộ điện học và sự co bóp cơ tâm nhĩ với các đặc điểm điện tâm đồ: Các khoảng R-R không đều nhau (khi dẫn truyền nhĩ thất còn tốt), không còn dấu hiệu của sóng P, các hoạt động bất thƣờng của sóng nhĩ.

Rung nhĩ gây ảnh hƣởng huyết động liên quan đến tần số đáp ứng thất bất thƣờng (quá nhanh hoặc quá chậm) và sự mất đồng bộ giữa nhĩ và thất. Rung nhĩ gây ra triệu chứng rất khác nhau trên các bệnh nhân: từ không triệu chứng đến mệt mỏi, hồi hộp, khó thở hoặc các triệu chứng nặng nhƣ tụt huyết áp, ngất hoặc suy tim.