LỜI MỞ ĐẦU v 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI: Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rựơu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ nước quả. Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không chưng cất từ các loại nước quả.
Sản xuất rượu trái cây dựa trên cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của hệ enzyme nấm men. Nấm men sử dụng nguồn cơ chất từ nước quả ( nho, mơ, dứa, dâu tằm, … ) có chứa đường glucose, fructose, các chất peptin, các axit hữu cơ ( axit tactaric, malic, sucsinic) và muối của những axit này, các hợp chất màu, hợp chất hương, vitamin, muối khoáng, …vừa để tăng sinh khối, vừa tạo ra sản phẩm rượu, CO2 , glyxerin, axit acetic, axit lactic, … Hiện nay, có hai phương pháp lên men rượu vang: lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết. Phương pháp sản xuất rượu vang từ chủng thuần khiết có rất nhiều ưu điểm: thời gian lên men nhanh, sử dụng triệt để nguồn cơ chất, nồng độ cồn thu được cao hơn lên men tự nhiên là 0,1 – 1o , vang sáng màu nhanh hơn, có hương vị thanh khiết hơn. Trong quá trình sản xuất rượu nấm men thường bị loại bỏ sau khi kết thúc quá trình lên men.
Nấm men sau khi loại bỏ không thể tái sử dụng gây lãng phí. Hơn thế nữa, nấm men phân tán trong dung dịch, nên không thể lọc bỏ hết triệt để, trong quá trình bảo quản phần nấm men còn sót lại sẽ lắng xuống đáy, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm về chỉ tiêu cảm quan. Để giải quyết những vấn đề này, các nhà khoa học đã đề ra biện pháp: sử dụng nấm men cố định vào lên men rượu. Phương pháp này mục tiêu là giữ các tế bào nấm men trên một chất mang, nhằm tăng hệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch.
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp cố định đã được áp dụng. Đối với sản xuất qui mô công nghiệp, người ta lên kế hoạch sản xuất dựa trên chi phí nguyên liệu, và chi phí sản xuất. Vì thế nên xu hướng hiện nay là tận dụng nguyên liệu rẻ tiền hoặc phế phẩm. Điều này đã dẫn đến nhiều cuộc nghiên cứu, nhằm tìm kiếm, những nguyên liệu rẽ tiền thường bị lãng quên, hay cách tận dụng nguồn phế phẩm.
vi Ở nước ta, nghề trồng dâu tằm đã có từ rất lâu. Tuy nhiên, lại có truyền thống là “trồng dâu nuôi tằm”, lấy lá mà không lấy trái. Trái dâu được làm mứt, bánh kẹo, như một nguồn kinh tế phụ. Có thể nói, trái dâu ở nước ta bị xem như là nguồn sản phẩm thứ cấp của ngành nông nghiệp.
Vì hàm lượng đường trong dâu tằm khá cao ( 10%), màu trái dâu rất đậm và có đặc điểm rất riêng để tạo ra vang đỏ. Thế nên, việc ứng dụng dâu trong sản xuất rượu vang mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn mà ta không thể bỏ qua. Như đã nói ở trên, cố định tế bào nấm men là một phương pháp mới, đi đôi với nó là vấn đề chất mang. Tiêu chí kinh tế đặt ra là chất mang càng rẻ, càng dễ tìm, càng tốt.
Dựa vào lý thuyết về yêu cầu chất mang, cũng như nguyên tắc của phương pháp, thì các vật liệu lignocellulose là một chất mang sinh học đã được khám phá, và bã mía đã được áp dụng. Bã mía là nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp sản xuất đường, thường được làm nguyên liệu cho ngành sản xuất thức ăn gia súc và làm nguồn nguyên liệu cho nhà máy. Tuy nhiên, nguồn phế phẩm này rất lớn, và tiềm năng không nhỏ,nên ngày nay đã có nhiều hướng nghiên cứu ứng dụng bã mía. Một trong số đó là nghiên cứu cố định vi sinh vật trên bã mía.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu phương pháp cố định nấm men trên bã mía, và khả năng ứng dụng của nó vào sản xuất rựơu vang. NỘI DUNG NGIÊN CỨU: Để giải quyết những vấn đề trên, ta tiến hành các bước: Khảo sát các yếu tố ành hưởng của quá trình cố định nấm men Khả năng ứng dụng nấm men cố định trên bã mía vào sản xuất. vii CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN viii 2. NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae: Giống Saccharomyces quan trong nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.
Một số chủng nấm men dùng trong công nghiệp sản xuất bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rựơu vang, sản xuất glycerol hoặc enzyme invertase. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men: 2. Hình thái: Tế bào hình cầu, hình ovan, elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy, hoặc đôi khi là hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và diều kiện môi trường xung quanh.
Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µm, chiều dài 8 µm. Trọng lượng riêng của nấm men (1,055 – 1,060 KDa) không khác mấy so với vi khuẩn (1,050 – 1,142 KDa) [5].Cấu tạo: Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào cơ bản giống thực vật. So với vi khuẩn tế bào nấm men tiến hóa hơn về mặt cấu trúc. Cấu tạo tế bào nấm men.(a) Mô hình mặt cắt tế bào[16], (b) Hình mô phỏng các thành phần của tế bào[15 ] ix Vỏ tế bào: Bao quanh nấm men.
Cấu tạo bởi protein, polysaccharide, phosphate và lipid. Trong thành phần poly saccharide có chứa glucan (chủ yếu) và manan ( chiếm 90% chất khô của vỏ). Glucan là thành phần chính của vỏ, là một polyme của glucoza. Nằm phía trong tiếp giáp màng tế bào chất.
Nếu lớp glucan bị phá hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy. Manan có thể kết hợp với protein tạo thành Hình 2. Vỏ tế bào nấm men [16] lớp manoprotein rất khó phá hủy [5]. Màng tế bào chất: Là lớp màng mỏng, dày 0,1 nm dính chặt với tế bào chất.
Chức năng của màng tế bào chất: + Bảo vệ, hàng rào thẩm thấu + Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại. + Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào + Nơi khu trú của một số enzym và bào quan (ribosome) Vận chuyển vật chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu chọn lọc màng tế bào. Đặc tính này phụ thuộc enzyme phospholipase và lipase [5]. Cấu trúc màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)[14] x Tế bào chất: Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp chất khác.
Có độ nhớt cao, chứa các bào quan. Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của nấm men [5]. Ti thể: Dạng hạt nhỏ hoặc hình que, dạng sợi. Hình dáng thay đổi trong quá trình nuôi cấy, hình que, hình sợi đơn hoặc kết chuỗi.
Số lượng ti thể dao động mạnh từ 1 – 50. Trong môi trường có nồng độ glucozse thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40. Hầu hết các phản ứng năng lượng đều xảy ra ở đây. Cấu trúc của ti thể biến đổi khi nấm men chuyển từ điều kiện kỵ khí sang hiếu khí.
Ở môi trường kỵ khí với không có lipid thì ti thể rất đơn giản gồm: hai lớp màng, nhưng không có nếp gấp. Nếu thêm lipid sẽ tạo nếp gấp [5]. Nhân: Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA. Kích thước nhân không đồng nhất ở các chủng nấm men và ngay cả cùng một chủng [5].
Các bào quan khác: không bào, ribosome, mạng lứơi nội chất,thể gogi…Có cấu tạo giống như tế bào thực vật [5].Đặc điểm sinh lý của nấm men: 2.Thành phần hóa học của tế bào nấm men: Nước chiếm 75% khối lượng. Thành phần sinh khối khô là: Chất vô cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 5,25) 30 – 75 Lipit 2–5 Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% chất tro.Dinh dưỡng nấm men: Cacbon: Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp tinh bột, cellulose, hemicellulose. Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose, melibiose. xi Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là axit béo tùy thuộc vào thành phần của các axit này.
Trong đó axit acetic và glucose được sử dụng đồng thời. Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước. Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO 2 trong trao đổi chất của nấm men, vì CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO 2 đều cần thiết cho nấm men, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt acid hữu cơ khác[5].
Nitơ: Nguồn nitơ cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Tuy nhiên nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni sulfat, phosphat, muối axetat, lactat, malat,. Trong môi trường chứa muối amoni, đặc biệt là sulfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit sử dụng sau hoặc làm axit hóa môi trường. Môi trường lỏng ammoniac (NH4+), là môi trường lý tưởng cho nấm men chỉ sau axit amin.
Nấm men sử dụng cả ure và pepton. Nấm men tiêu hóa tốt acid amin tự nhiên, các nucleotide purin, pyrimidin, protein, một số amin, còn pepton kém hớnvà không sử dụng protein. Các acid amin đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon. Nấm men chỉ sử dụng axit amin dạng tự nhiên.
Hàm lượng nitơ phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí, chủng loại nấm men. [5] Chất vô cơ: Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho là được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh, … Phospho chứa trong nhiều hợp chất quan trong của tế bào. Nấm men sử dụng tốt nguồn phosphor vô cơ là ortophosphat.
Thiếu phosphor trong môi trường dẫn đến sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon, nitơ. Chức năng của chất dinh dưỡng [14] xii Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp enzyme, protein. Trong điều kiện kỵ khí, S bị khử thành H2S.