Đồ án nghiên cứu: Cố định nấm men trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm

Nghiên cứu quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên giá thể bã mía, ứng dụng vào công nghệ sản xuất rượu dâu tằm để nâng cao hiệu suất.

• Tác giả: Phan Ngoc My Hoa
• Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyen Duc Luong
• Trường học: Trường Đại học Bách khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm
• Loại tài liệu: Đồ án môn học chuyên ngành
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và vai trò trong sản xuất rượu

Nấm men Saccharomyces cerevisiae là chủng vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất rượu dâu tằm. Loài nấm men này có khả năng chuyển hóa đường thành ethanol và CO2 thông qua quá trình lên men. Nấm men sử dụng nguồn cơ chất từ nước quả dâu tằm chứa glucose, fructose, và các chất hữu cơ khác để tăng sinh khối và tạo ra sản phẩm rượu. Phương pháp sản xuất rượu từ chủng nấm men thuần khiết có nhiều ưu điểm: thời gian lên men nhanh hơn, sử dụng triệt để cơ chất, nồng độ cồn cao hơn 0,1-1%, vang sáng màu nhanh hơn, và có hương vị thanh khiết. Đặc điểm sinh lý của nấm men cho phép nó hoạt động hiệu quả trong điều kiện khác nhau, tạo nên sản phẩm rượu chất lượng cao.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có cấu trúc tế bào đơn bào, bao gồm vỏ tế bào, màng sinh chất, nhân, ty thể và các bào quan khác. Vỏ tế bào được cấu tạo chủ yếu từ polysaccharide như mannose và glucan. Tế bào nấm men có kích thước từ 5-10 micromet, hình dạng tròn hoặc hình bầu dục. Cấu trúc này cho phép nấm men cố định trên bã mía một cách hiệu quả, tạo bề mặt tiếp xúc lớn với chất mang.

1.2. Đặc điểm sinh lý và quá trình chuyển hóa

Nấm men sử dụng đường thông qua con đường đường phân (glycolysis) và chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol. Quá trình này xảy ra trong điều kiện yếm khí và aerobic. Saccharomyces cerevisiae có khả năng chịu được nồng độ cồn cao, axit pH thấp, và nhiệt độ thay đổi. Những đặc tính này làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho sản xuất rượu dâu tằm với hiệu suất cao và ổn định.

II. Kỹ thuật cố định nấm men trên bã mía

Cố định nấm men là phương pháp giữ các tế bào vi sinh vật trên một chất mang vật lý hoặc hóa học. Bã mía được lựa chọn làm chất mang chính vì nó có cấu trúc lỗ xốp, diện tích bề mặt lớn, chi phí thấp, và dễ tiếp cận. Bã mía chủ yếu chứa cellulose, hemicellulose và lignin (lignocellulose), tạo nên ma trận lý tưởng để nấm men bám dính. Phương pháp cố định này giúp tăng hệ số khối lượng tế bào, cải thiện hiệu suất lên men, và cho phép tái sử dụng nấm men nhiều lần. Quá trình lên men liên tục trên nấm men cố định giúp giảm chi phí sản xuất, tăng năng suất rượu, và cải thiện chất lượng sản phẩm cuối cùng.

2.1. Cấu trúc và thành phần hóa học của bã mía

Bã mía là phụ phẩm của ngành công nghiệp đường, chứa các thành phần hữu cơ chính là cellulose, hemicellulose và lignin. Cellulose tạo thành cấu trúc chính, hemicellulose bao quanh các sợi cellulose, còn lignin tạo nên tính cứng và bền của bã. Cấu trúc lỗ xốp của bã mía cho phép nước và các chất dinh dưỡng thấm qua, tạo môi trường lý tưởng cho nấm men phát triển.

2.2. Quy trình cố định tế bào nấm men

Quy trình cố định nấm men bao gồm các bước: chuẩn bị bã mía (rửa sạch, sấy), khử trùng, cấy nấm men lên bã mía, nuôi cấy trong điều kiện kiểm soát (nhiệt độ 25-30°C, độ ẩm thích hợp). Nấm men từng bước thâm nhập vào cấu trúc của bã và phát triển trên bề mặt. Quá trình này tạo ra nấm men cố định có khối lượng tế bào cao, sẵn sàng cho quá trình lên men rượu dâu tằm.

III. Quá trình sản xuất rượu dâu tằm với nấm men cố định

Sản xuất rượu dâu tằm sử dụng nấm men cố định trên bã mía là phương pháp hiệu quả và bền vững. Dâu tằm Đà Lạt có hàm lượng đường cao, axit hữu cơ phong phú (axit tartaric, malic, succinic), và chứa nhiều vitamin và chất chống oxy hóa. Những thành phần này tạo nên điều kiện hoàn hảo cho nấm men lên men. Quá trình lên men rượu bao gồm các giai đoạn: lên men chính (tạo ra ethanol), lên men thứ cấp (cấu hình hương vị), và lắng đục (loại bỏ cặn). Ưu điểm của nấm men cố định là nó không bị phân tán trong dung dịch, dễ lọc bỏ sau khi hoàn thành, và có thể tái sử dụng được nhiều lần trong các chu kỳ lên men tiếp theo.

3.1. Bản chất của quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu là phản ứng hóa sinh mà nấm men chuyển hóa đường thành ethanol, CO2, glycerol, và các sản phẩm phụ. Nấm men sử dụng đường từ dâu tằm qua con đường glycolysis, sau đó chuyển hóa thành ethanol dưới điều kiện yếm khí. Quá trình này tạo ra năng lượng (ATP) cho nấm men phát triển. Sản phẩm chính là ethanol (cồn) và CO2, song cũng tạo ra các hợp chất hương, axit hữu cơ, và chất thơm khác tạo nên hương vị độc đáo của rượu.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lên men

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: nhiệt độ (tối ưu 25-30°C), pH (2,8-3,5), nồng độ đường ban đầu, hàm lượng oxy, và khối lượng nấm men cố định sử dụng. Sự kiểm soát tốt các yếu tố này giúp sản xuất rượu dâu tằm đạt chất lượng cao, giảm thời gian lên men, và tối đa hóa hiệu suất chuyển hóa đường thành cồn.

IV. Lợi ích và ứng dụng của công nghệ cố định nấm men

Công nghệ cố định nấm men mang lại nhiều lợi ích trong sản xuất rượu dâu tằm ở quy mô công nghiệp. Thứ nhất, giảm chi phí vì nấm men có thể tái sử dụng được nhiều lần mà không mất hiệu suất. Thứ hai, cải thiện chất lượng sản phẩm bằng cách loại bỏ triệt để cặn nấm men sau lên men, giúp rượu sáng màu, trong suốt, và ổn định khi bảo quản. Thứ ba, tăng năng suất lên men liên tục, cho phép sản xuất rượu một cách hiệu quả hơn. Thứ tư, giảm ảnh hưởng lên môi trường thông qua tái sử dụng bã mía. Phương pháp này đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên thế giới, đặc biệt trong các quốc gia có truyền thống sản xuất rượu vang.

4.1. Ưu điểm của nấm men cố định trong lên men liên tục

Nấm men cố định cho phép lên men liên tục với nhiều ưu điểm: thời gian lên men rút ngắn từ 15-30 ngày xuống còn 5-10 ngày, nồng độ cồn tăng lên, và hương vị thanh khiết hơn. Vì nấm men được giữ cố định trên bã mía, không bị cuốn trôi trong dung dịch, nên hiệu suất sử dụng chất mang cao. Điều này cho phép xây dựng hệ thống sản xuất rượu semi-liên tục hoặc liên tục hoàn toàn, tăng đáng kể năng suất nhà máy.

4.2. Ứng dụng thực tiễn và triển vọng phát triển

Công nghệ cố định nấm men có thể ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại rượu trái cây khác nhau, không chỉ riêng rượu dâu tằm. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, có thể cải tiến hơn nữa phương pháp cố định bằng cách sử dụng các chất mang nhân tạo bổ sung hoặc nâng cấp. Việc ứng dụng này góp phần phát triển ngành công nghiệp rượu vang ở Việt Nam, đặc biệt là ở các vùng trồng dâu tằm như Đà Lạt.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU v 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI: Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rựơu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ nước quả. Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không chưng cất từ các loại nước quả.

Sản xuất rượu trái cây dựa trên cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của hệ enzyme nấm men. Nấm men sử dụng nguồn cơ chất từ nước quả ( nho, mơ, dứa, dâu tằm, … ) có chứa đường glucose, fructose, các chất peptin, các axit hữu cơ ( axit tactaric, malic, sucsinic) và muối của những axit này, các hợp chất màu, hợp chất hương, vitamin, muối khoáng, …vừa để tăng sinh khối, vừa tạo ra sản phẩm rượu, CO2 , glyxerin, axit acetic, axit lactic, … Hiện nay, có hai phương pháp lên men rượu vang: lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết. Phương pháp sản xuất rượu vang từ chủng thuần khiết có rất nhiều ưu điểm: thời gian lên men nhanh, sử dụng triệt để nguồn cơ chất, nồng độ cồn thu được cao hơn lên men tự nhiên là 0,1 – 1o , vang sáng màu nhanh hơn, có hương vị thanh khiết hơn. Trong quá trình sản xuất rượu nấm men thường bị loại bỏ sau khi kết thúc quá trình lên men.

Nấm men sau khi loại bỏ không thể tái sử dụng gây lãng phí. Hơn thế nữa, nấm men phân tán trong dung dịch, nên không thể lọc bỏ hết triệt để, trong quá trình bảo quản phần nấm men còn sót lại sẽ lắng xuống đáy, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm về chỉ tiêu cảm quan. Để giải quyết những vấn đề này, các nhà khoa học đã đề ra biện pháp: sử dụng nấm men cố định vào lên men rượu. Phương pháp này mục tiêu là giữ các tế bào nấm men trên một chất mang, nhằm tăng hệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch.

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp cố định đã được áp dụng. Đối với sản xuất qui mô công nghiệp, người ta lên kế hoạch sản xuất dựa trên chi phí nguyên liệu, và chi phí sản xuất. Vì thế nên xu hướng hiện nay là tận dụng nguyên liệu rẻ tiền hoặc phế phẩm. Điều này đã dẫn đến nhiều cuộc nghiên cứu, nhằm tìm kiếm, những nguyên liệu rẽ tiền thường bị lãng quên, hay cách tận dụng nguồn phế phẩm.

vi Ở nước ta, nghề trồng dâu tằm đã có từ rất lâu. Tuy nhiên, lại có truyền thống là “trồng dâu nuôi tằm”, lấy lá mà không lấy trái. Trái dâu được làm mứt, bánh kẹo, như một nguồn kinh tế phụ. Có thể nói, trái dâu ở nước ta bị xem như là nguồn sản phẩm thứ cấp của ngành nông nghiệp.

Vì hàm lượng đường trong dâu tằm khá cao ( 10%), màu trái dâu rất đậm và có đặc điểm rất riêng để tạo ra vang đỏ. Thế nên, việc ứng dụng dâu trong sản xuất rượu vang mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn mà ta không thể bỏ qua. Như đã nói ở trên, cố định tế bào nấm men là một phương pháp mới, đi đôi với nó là vấn đề chất mang. Tiêu chí kinh tế đặt ra là chất mang càng rẻ, càng dễ tìm, càng tốt.

Dựa vào lý thuyết về yêu cầu chất mang, cũng như nguyên tắc của phương pháp, thì các vật liệu lignocellulose là một chất mang sinh học đã được khám phá, và bã mía đã được áp dụng. Bã mía là nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp sản xuất đường, thường được làm nguyên liệu cho ngành sản xuất thức ăn gia súc và làm nguồn nguyên liệu cho nhà máy. Tuy nhiên, nguồn phế phẩm này rất lớn, và tiềm năng không nhỏ,nên ngày nay đã có nhiều hướng nghiên cứu ứng dụng bã mía. Một trong số đó là nghiên cứu cố định vi sinh vật trên bã mía.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI: Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu phương pháp cố định nấm men trên bã mía, và khả năng ứng dụng của nó vào sản xuất rựơu vang. NỘI DUNG NGIÊN CỨU: Để giải quyết những vấn đề trên, ta tiến hành các bước: Khảo sát các yếu tố ành hưởng của quá trình cố định nấm men Khả năng ứng dụng nấm men cố định trên bã mía vào sản xuất. vii CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN viii 2. NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae: Giống Saccharomyces quan trong nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.

Một số chủng nấm men dùng trong công nghiệp sản xuất bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rựơu vang, sản xuất glycerol hoặc enzyme invertase. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men: 2. Hình thái: Tế bào hình cầu, hình ovan, elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy, hoặc đôi khi là hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và diều kiện môi trường xung quanh.

Tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µm, chiều dài 8 µm. Trọng lượng riêng của nấm men (1,055 – 1,060 KDa) không khác mấy so với vi khuẩn (1,050 – 1,142 KDa) [5].Cấu tạo: Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào cơ bản giống thực vật. So với vi khuẩn tế bào nấm men tiến hóa hơn về mặt cấu trúc. Cấu tạo tế bào nấm men.(a) Mô hình mặt cắt tế bào[16], (b) Hình mô phỏng các thành phần của tế bào[15 ] ix  Vỏ tế bào: Bao quanh nấm men.

Cấu tạo bởi protein, polysaccharide, phosphate và lipid. Trong thành phần poly saccharide có chứa glucan (chủ yếu) và manan ( chiếm 90% chất khô của vỏ). Glucan là thành phần chính của vỏ, là một polyme của glucoza. Nằm phía trong tiếp giáp màng tế bào chất.

Nếu lớp glucan bị phá hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy. Manan có thể kết hợp với protein tạo thành Hình 2. Vỏ tế bào nấm men [16] lớp manoprotein rất khó phá hủy [5].  Màng tế bào chất: Là lớp màng mỏng, dày 0,1 nm dính chặt với tế bào chất.

Chức năng của màng tế bào chất: + Bảo vệ, hàng rào thẩm thấu + Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại. + Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào + Nơi khu trú của một số enzym và bào quan (ribosome) Vận chuyển vật chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu chọn lọc màng tế bào. Đặc tính này phụ thuộc enzyme phospholipase và lipase [5]. Cấu trúc màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)[14] x  Tế bào chất: Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp chất khác.

Có độ nhớt cao, chứa các bào quan. Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của nấm men [5].  Ti thể: Dạng hạt nhỏ hoặc hình que, dạng sợi. Hình dáng thay đổi trong quá trình nuôi cấy, hình que, hình sợi đơn hoặc kết chuỗi.

Số lượng ti thể dao động mạnh từ 1 – 50. Trong môi trường có nồng độ glucozse thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40. Hầu hết các phản ứng năng lượng đều xảy ra ở đây. Cấu trúc của ti thể biến đổi khi nấm men chuyển từ điều kiện kỵ khí sang hiếu khí.

Ở môi trường kỵ khí với không có lipid thì ti thể rất đơn giản gồm: hai lớp màng, nhưng không có nếp gấp. Nếu thêm lipid sẽ tạo nếp gấp [5].  Nhân: Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA. Kích thước nhân không đồng nhất ở các chủng nấm men và ngay cả cùng một chủng [5].

 Các bào quan khác: không bào, ribosome, mạng lứơi nội chất,thể gogi…Có cấu tạo giống như tế bào thực vật [5].Đặc điểm sinh lý của nấm men: 2.Thành phần hóa học của tế bào nấm men: Nước chiếm 75% khối lượng. Thành phần sinh khối khô là: Chất vô cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 5,25) 30 – 75 Lipit 2–5 Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% chất tro.Dinh dưỡng nấm men:  Cacbon: Nấm men có thể sử dụng đường làm nguồn cacbon, không sử dụng trực tiếp tinh bột, cellulose, hemicellulose. Nấm men Saccharomyces sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose, galactose, không sử dụng được pentose, lactose, melibiose. xi Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp là axit béo tùy thuộc vào thành phần của các axit này.

Trong đó axit acetic và glucose được sử dụng đồng thời. Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước. Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO 2 trong trao đổi chất của nấm men, vì CO2 là chất hoạt động sinh học. Những dạng liên kết với CO 2 đều cần thiết cho nấm men, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt acid hữu cơ khác[5].

 Nitơ: Nguồn nitơ cần thiết cho việc tổng hợp các cấu tử trong tế bào, là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Tuy nhiên nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni sulfat, phosphat, muối axetat, lactat, malat,. Trong môi trường chứa muối amoni, đặc biệt là sulfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc axit sử dụng sau hoặc làm axit hóa môi trường. Môi trường lỏng ammoniac (NH4+), là môi trường lý tưởng cho nấm men chỉ sau axit amin.

Nấm men sử dụng cả ure và pepton. Nấm men tiêu hóa tốt acid amin tự nhiên, các nucleotide purin, pyrimidin, protein, một số amin, còn pepton kém hớnvà không sử dụng protein. Các acid amin đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon. Nấm men chỉ sử dụng axit amin dạng tự nhiên.

Hàm lượng nitơ phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện hiếu khí, chủng loại nấm men. [5]  Chất vô cơ: Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho là được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh, … Phospho chứa trong nhiều hợp chất quan trong của tế bào. Nấm men sử dụng tốt nguồn phosphor vô cơ là ortophosphat.

Thiếu phosphor trong môi trường dẫn đến sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon, nitơ. Chức năng của chất dinh dưỡng [14] xii Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ phá hỏng sự trao đổi chất và tổng hợp enzyme, protein. Trong điều kiện kỵ khí, S bị khử thành H2S.