ĐẶT VẤN ĐỀ Aflatoxin B1 (AFB1) là một trong những độc tố vi nấm nguy hiểm nhất, được tạo ra chủ yếu bởi các loài nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. AFB1 có độc tính cao và đã được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 1 – nhóm các chất gây ung thư cho người [1]. Độc tố này thường hiện diện trong các loại nông sản như ngô, lạc, hạt hướng dương, ớt khô và các loại ngũ cốc khác. Sau khi vào cơ thể, AFB1 có thể được chuyển hóa tại gan thành dạng epoxide (AFB₁-8,9-epoxide) – chất có khả năng gắn với acid deoxyribonucleic và gây đột biến, làm tăng nguy cơ ung thư gan [2].
Do tính chất độc hại và phổ biến của AFB1 trong thực phẩm, nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam, đã ban hành quy định nghiêm ngặt về giới hạn tối đa cho phép trong thực phẩm. Đối với lạc và các loại hạt có dầu được sử dụng làm thực phẩm hoặc làm nguyên liệu thực phẩm (trừ các loại dùng để sản xuất dầu thực vật), giới hạn tối đa cho phép của Aflatoxin B1 không vượt quá 8 µg/kg và tổng Aflatoxin không vượt quá 15 µg/kg nếu sản phẩm cần sơ chế trước khi sử dụng và giới hạn tương ứng là 2 µg/kg đối với Aflatoxin B1 và 4 µg/kg đối với tổng Aflatoxin trong trường hợp sản phẩm được dùng trực tiếp, không qua sơ chế [3]. Ở Châu Âu, Quy định của Ủy ban Châu Âu (EC) số 1881/2006 và 401/2006 đã đưa ra mức giới hạn đối với lạc, quả hạch và các sản phẩm chế biến của chúng là 2 µg/kg với AFB1 và Aflatoxin tổng gồm (B1, B2, G1, G2) là 4 µg/kg. Đặc biệt, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có điều kiện khí hậu nóng ẩm như Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, khiến việc kiểm soát AFB1 trong chuỗi cung ứng thực phẩm trở nên vô cùng cấp thiết [4], [5], [6].
Hiện nay, AFB1 được sử dụng làm chất chuẩn trong phân tích và kiểm nghiệm chủ yếu là hàng nhập khẩu với giá thành cao (khoảng 77$ cho 1 mg chuẩn Aflatoxin B1 của hãng Sig-ma), trong khi tại Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất được chất chuẩn này. Trên thế giới, AFB1 thường được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy A. flavus trên môi trường thích hợp, sau đó chiết tách và tinh chế [7]. Tuy nhiên, quy trình này tồn tại một số hạn chế như thời gian dài, nguy cơ nhiễm tạp vi sinh và yêu cầu khắt khe về an toàn do độc tính cao của AFB1.
Trước thực tiễn đó, việc xây dựng quy trình sản xuất chất chuẩn AFB1 từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước không chỉ mang ý nghĩa khoa học, mà còn mang lại lợi ích kinh tế thông qua việc giảm phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu, đồng thời hỗ trợ hiệu quả cho công tác kiểm soát an toàn thực phẩm để đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo dung dịch chuẩn Aflatoxin B1 từ lạc” với mục tiêu là: 1. Xây dựng quy trình tạo dung dịch chuẩn Aflatoxin B1 từ lạc. Ứng dụng quy trình để tạo ra 100 ml dung dịch chất chuẩn Aflatoxin B1 có hàm lượng tối thiểu 0,1 µg/ml.
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1. Giới thiệu chung Aflatoxin B1 là một sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus khi các yếu tố môi trường thuận lợi. AFB1 là loại Aflatoxin mạnh nhất và phổ biến nhất, gây hại cho sức khỏe của con người trên toàn cầu [8]. Aspergillus flavus được tìm thấy phổ biến trong đất và có thể gây ô nhiễm nhiều loại cây trồng như lúa, ngô, khoai, lạc, … Khi xâm nhập vào các nguồn thực phẩm này, nấm A.
flavus sản xuất Aflatoxin, bao gồm AFB1. Ngoài ra, nhiệt độ và độ ẩm cao cũng là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm, nên các khu vực châu Phi cận Sahara và Đông Nam Á thường bị nhiễm Aflatoxin nghiêm trọng hơn [4], [5], [6]. Trong nhóm Aflatoxin, AFB1 là hợp chất có tính gây ung thư mạnh nhất, được ghi nhận là tác nhân chính gây ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), đồng thời còn gây ức chế tăng trưởng, suy giảm hệ miễn dịch và suy dinh dưỡng [1]. Công thức phân tử: C₁₇H₁₂O₆.
Cấu trúc hóa học của Aflatoxin B1 Danh pháp IUPAC: (6aR,9aS)-2,3,6a,9a-Tetrahydro-4-methoxycyclopenta[c]furo [3′,2′:4,5]furo[2,3-h][1]benzopyran-1,11-dione. Tính chất vật lý AFB1 tồn tại dưới dạng tinh thể không màu đến vàng nhạt hoặc bột trắng, không mùi, không vị và khó phát hiện bằng cảm quan. AFB1 thể hiện huỳnh quang màu xanh lam với phổ phát xạ huỳnh quang cực đại là 425 nm và có giá trị hấp thụ UV cực đại ở 223, 265 và 362 nm. AFB1 rất ít tan trong nước (chỉ khoảng 10–30 μg/ml), nhưng lại tan tốt trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực trung bình như chloroform và methanol, đặc biệt tan mạnh trong dimethyl sulfoxit, trong khi hoàn toàn không tan trong các dung môi không phân cực [8], [9].
Tính chất hóa học AFB1 ổn định ở nhiệt độ cao, nhiệt để phá hủy được AFB1 khoảng trên 180 độ C [10]. Tuy nhiên, AFB1 là một hợp chất không bền dưới ánh sáng, đặc biệt là tia UV và trong môi trường có oxy. AFB1 không bền trong môi trường có pH < 3 hoặc pH > 10 [8]. Vòng lacton trong cấu trúc của nó khiến AFB1 dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm như amoniac hoặc hypochlorit.
Mặc dù vậy, quá trình acid hóa có thể đảo ngược phản ứng, trả lại chất ban đầu. Trong môi trường acid, AFB1 bị chuyển thành Aflatoxin B2α do phản ứng cộng nước vào liên kết đôi trên vòng furan dưới xúc tác acid. AFB1 cũng dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân oxy hóa như hydrogen peroxide và ozon, dẫn đến mất huỳnh quang [8]. Hoạt tính sinh học AFB1 sau khi xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa được chuyển hóa chủ yếu ở gan bởi các enzym cytochrome P450 (CYP450).
Quá trình này tạo ra chất chuyển hóa chính là AFB1-8,9-epoxide gồm hai dạng exo và endo, trong đó exo-epoxide có ái lực cao với acid deoxyribonucleic và gây đột biến gen [9], [11]. Trong đó, exo-8,9-epoxide có ái lực cao với acid deoxyribonucleic và tạo ra phức hợp 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroxy-AFB1 (AFB1-N7-Gua), gây ra các đột biến acid deoxyribonucleic [9], [11]. Dạng epoxide này còn tham gia vào nhiều con đường chuyển hóa khác như: - Liên hợp với glutathione (GSH), quá trình được xúc tác bởi enzym Glutathione-S- Transferase (GST), tạo thành AFB1-marcapturate và được bài tiết ra ngoài – đây là một cơ chế giải độc quan trọng, mặc dù việc giảm nồng độ GSH có thể làm gia tăng các loài oxy phản ứng (ROS), dẫn đến tổn thương oxy hóa. - Chuyển đổi thành AFB1-8,9-dihydroxydiol, sau đó có thể bị chuyển hóa tiếp thành dialdehyde.
Dạng dialdehyde này hoặc sẽ bị khử thành dialcohol và thải qua nước tiểu dưới tác động của enzym aflatoxin aldehyde reductase (AFAR), hoặc sẽ liên kết với protein như albumin. - Liên kết với các đại phân tử như protein hoặc acid ribonucleic, làm rối loạn chức năng tế bào bình thường, đồng thời ức chế tổng hợp protein acid nucleic. Ngoài ra, AFB1 còn được hydroxyl hóa thành các chất ít độc hơn như AFM1 và AFQ1 [9]. Độc tính Aflatoxin B1 là một chất gây ung thư mạnh, được chứng minh qua nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro, có khả năng gây ung thư cho cả động vật và con người, được phân loại vào nhóm 1 – chất gây ung thư cho người [1].
AFB1 có thể gây đột biến mạnh và liên kết với acid nucleic, cũng như protein trong gan, gây đột biến từ G thành T. Aflatoxins đóng góp vào 5-28% trường hợp ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) trên toàn 3 cầu, và các cơ chế độc tính của AFB1 bao gồm việc tạo ra các gốc oxy phản ứng, dẫn đến tổn thương tế bào và oxy hóa, gây độc cho gan. AFB1 còn có khả năng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) qua con đường tín hiệu ty thể, làm suy giảm chức năng gan [8]. Aflatoxins có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường, bao gồm tiêu hóa, hít phải và tiếp xúc trực tiếp [8], [12].
Aflatoxicosis là thuật ngữ y học dùng để chỉ ngộ độc do aflatoxins. Khi vào cơ thể, AFB1 được hấp thụ qua đường tiêu hóa và vận chuyển đến gan, nơi nó liên kết với protein và acid deoxyribonucleic, gây tổn thương tế bào. Aflatoxicosis mãn tính, do tiếp xúc lâu dài với AFB1 ở mức độ thấp đến trung bình, có thể không có triệu chứng rõ rệt nhưng vẫn góp phần vào việc phát triển ung thư gan, trong khi ngộ độc cấp tính, với liều cao, có thể gây tổn thương gan nghiêm trọng, xuất huyết và dẫn đến tử vong. Liều gây chết trung bình của aflatoxin B1 là 0,36 mg/kg trọng lượng cơ thể, đây là một chất độc mạnh, có khả năng gây ung thư mạnh gấp nhiều lần so với các chất gây ung thư khác [12].
Triệu chứng khi ngộ độc Aflatoxin B1 khi tiếp xúc với liều cao bao gồm chán ăn, sốt, viêm gan, đau bụng, nôn mửa và trong trường hợp nghiêm trọng, có thể dẫn đến tử vong. Ngoài tác động đến gan, aflatoxin B1 còn ảnh hưởng đến các cơ quan khác như thận, phổi và dạ dày, đồng thời suy giảm hệ miễn dịch và gây các tác động quái thai. Aflatoxin B1 có thể truyền sang thai nhi qua sữa mẹ hoặc máu dây rốn, gây nguy cơ tác động nghiêm trọng đối với sức khỏe của trẻ sơ sinh [8], [13]. AFB1 có thể được tiêu thụ qua thực phẩm bị ô nhiễm hoặc qua thức ăn chăn nuôi, ảnh hưởng đến sức khỏe con người qua sữa và các sản phẩm từ sữa.
Aflatoxin M1, sản phẩm chuyển hóa của AFB1, chủ yếu có mặt trong sữa và các sản phẩm từ sữa như phô mai, sữa bột. Sự tiếp xúc lâu dài với aflatoxin có thể gây xơ gan ở trẻ em, đặc biệt là trẻ em suy dinh dưỡng hoặc tiếp xúc với aflatoxin qua sữa mẹ [12], [13]. Ngộ độc aflatoxin B1 chủ yếu xảy ra do con người ăn thực phẩm bị ô nhiễm, điều này rất khó kiểm soát vì nấm mốc trong thực phẩm rất phổ biến. Các nghiên cứu cho thấy việc tiêu thụ thực phẩm có nồng độ aflatoxin B1 thấp trong thời gian dài là nguyên nhân chính gây ung thư gan, ung thư dạ dày và các bệnh khác.
Tổng quan về đối tượng mẫu Lạc (Arachis hypogaea L.) là một trong những cây trồng hạt dầu quan trọng nhất và là thực phẩm ăn nhẹ phổ biến trên thị trường thực phẩm toàn cầu. Hàm lượng protein trong lạc dao động từ 16 đến 36% và chứa các acid amin thiết yếu cần thiết cho quá trình xây dựng cơ và chức năng tổng thể của cơ thể [14].
