Luận văn ThS: Nghiên cứu quy trình nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ nghiên cứu quy trình nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi, rễ.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Trọng Tuấn
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây xạ đen và ý nghĩa của vi nhân giống in vitro

Cây xạ đen (Ehretia asperula) là một loài thực vật quý hiếm có giá trị cao trong lĩnh vực dược liệu và công nghệ sinh học. Cây này chứa hàm lượng lớn các chất hoạt tính sinh học, đặc biệt là rosmarinic acid, một hợp chất có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa mạnh. Quy trình nhân giống in vitro cây xạ đen là phương pháp hiện đại giúp sản xuất hàng loạt cây con từ một mẫu mẹ, đảm bảo tính đồng nhất di truyền. Phương pháp này vượt trội hơn nhân giống truyền thống vì cho phép tái sinh nhanh chóng, tiết kiệm không gian và thời gian. Nghiên cứu này nhằm thiết lập quy trình vi nhân giống in vitro hoàn chỉnh, từ khử trùng mẫu cấy cho đến tạo rễ, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen cây xạ đen tại Việt Nam.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây xạ đen

Cây xạ đen là một loài thực vật lâu năm, thuộc họ Boraginaceae. Cây có chiều cao 1-3 mét, lá xơ ráp, hoa nhỏ màu trắng hoặc xanh nhạt. Cây phát triển tốt ở các vùng nhiệt đới, chịu được điều kiện khô hạn. Thành phần hóa học của cây xạ đen rất phong phú, bao gồm alkaloid, flavonoid, axit hữu cơ và đặc biệt là rosmarinic acid - một axit phenolic quan trọng.

1.2. Tầm quan trọng của công nghệ nuôi cấy mô

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã mở ra cơ hội mới trong bảo tồn và nhân giống các loài thực vật quý hiếm. Phương pháp in vitro cho phép tạo ra hàng nghìn cây con từ một mẫu mẹ trong thời gian ngắn, giảm áp lực lên quần thể tự nhiên và tạo điều kiện bền vững cho khai thác tài nguyên.

II. Quy trình khử trùng và khởi tạo nuôi cấy

Bước đầu tiên trong quy trình nhân giống in vitro cây xạ đen là khử trùng mẫu cấy. Mẫu cấy thường được lấy từ các mô non như chồi, lá hoặc thân non của cây xạ đen. Trước tiên, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và xà phòng để loại bỏ bụi bẩn. Sau đó, mẫu được ngâm trong dung dịch ethanol 70% trong 30-60 giây, tiếp theo là xử lý với nước tẩy Clorox 10-20% trong 10-15 phút để diệt các vi khuẩn và nấm. Cuối cùng, mẫu được rửa lại bằng nước cất tiệt trùng 3-4 lần. Thời gian khử trùng ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống sót của mẫu cấy - quá lâu sẽ làm chết mô, quá ngắn sẽ không khử hết vi khuẩn. Sau khử trùng, mẫu được chuyển sang môi trường MS (Murashige và Skoog) có bổ sung hormone khởi tạo chồi.

2.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Khử trùng mẫu cấy là bước quan trọng quyết định thành công của toàn bộ quy trình. Mẫu cấy xạ đen được xử lý tuần tự: rửa nước cất, ngâm ethanol 70% 30-60 giây, xử lý Clorox 10-20% 10-15 phút, rửa nước cất tiệt trùng. Tỷ lệ khử trùng hiệu quả đạt 80-90% khi thời gian xử lý hợp lý.

2.2. Khởi tạo chồi in vitro

Sau khử trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung KIN (Kinetin). KIN là cytokinin tự nhiên kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Nồng độ KIN tối ưu từ 0.5-2.0 mg/L giúp cảm ứng phát sinh chồi hiệu quả. Chồi xuất hiện sau 2-3 tuần nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ thích hợp.

III. Giai đoạn sinh trưởng chồi và tạo rễ

Sau khi khởi tạo chồi thành công, bước tiếp theo là khuyến thúc sinh trưởng chồi bằng cách sử dụng các hormone điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV). BA (6-benzylaminopurine) và 2-ip (N6-(2-isopentenyl)adenine) là những chất điều hòa thuộc nhóm cytokinin hiệu quả. Nồng độ BA tối ưu thường dao động từ 1.0-3.0 mg/L, giúp tạo ra chồi dài, khỏe mạnh. 2-ip với nồng độ 0.5-2.0 mg/L cũng cho kết quả tốt. Sau giai đoạn sinh trưởng chồi, cây xạ đen in vitro cần được tạo rễ để phát triển thành cây hoàn chỉnh. NAA (α-napththalene acetic acid) và IBA (Indole-3-butyric acid) là các auxin phổ biến dùng trong cảm ứng rễ. Nồng độ NAA 0.5-2.0 mg/L hoặc IBA 0.5-1.5 mg/L trên môi trường MS giảm một nửa thường cho tỷ lệ rễ hóa cao nhất. Chồi có rễ sau 2-3 tuần là cây xanh hoàn chỉnh sẵn sàng để cây ngoài cũi.

3.1. Ảnh hưởng của BA và 2 ip đến sinh trưởng chồi

BA (6-benzylaminopurine) và 2-ip là các cytokinin mạnh kích thích phân chia tế bào. Nồng độ BA 2.0-3.0 mg/L cho số chồi nhiều nhất trên cây xạ đen in vitro. 2-ip nồng độ 1.0-2.0 mg/L tạo ra chồi dài, chiều cao hơn. Sự kết hợp cân bằng giữa BA và IAA tạo tỷ lệ chồi/rễ tối ưu cho phát triển plant growth regulators.

3.2. Cảm ứng tạo rễ bằng NAA và IBA

NAA (α-napththalene acetic acid) và IBA (Indole-3-butyric acid) là các auxin hiệu quả để cảm ứng rễ trên chồi xạ đen in vitro. IBA 1.0 mg/L trên nền MS nửa đơn vị cho tỷ lệ rễ hóa cao nhất (>90%), với chiều dài rễ 2-3 cm sau 2-3 tuần. Chồi có rễ phát triển là cây hoàn chỉnh sẵn sàng ươm.

IV. Đánh giá chất lượng và ổn định di truyền của cây con

Quy trình nhân giống in vitro cây xạ đen đòi hỏi kiểm tra chất lượng và ổn định di truyền của các cây con sinh ra. Định lượng rosmarinic acid (RA) bằng phương pháp HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là bước quan trọng để đánh giá chất lượng. Các cây con in vitro cần chứa hàm lượng RA tương tự cây mẹ, thường đạt 5-10 mg/100g trọng lượng khô. Đánh giá ổn định di truyền được thực hiện bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) sử dụng các mồi ITS (Internal Transcribed Spacer). So sánh DNA của cây con với cây mẹ xác nhận tính đồng nhất di truyền. Ngoài ra, kiểm tra hình thái các đặc điểm như số lá, chiều cao, màu sắc cũng giúp phát hiện các dị hình. Các cây con đạt tiêu chuẩn được giữ lại để ươm trồng ngoài cũi trong điều kiện kiểm soát trước khi đưa về môi trường tự nhiên. Quá trình này đảm bảo cây con có chất lượng cao, giống hệt cây mẹ và sẵn sàng cho nhân rộng thương mại.

4.1. Định lượng rosmarinic acid và đánh giá chất lượng

Rosmarinic acid (RA) là chất chính hoạt có giá trị dược liệu cao ở cây xạ đen in vitro. Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng RA chính xác. Các cây con in vitro thường chứa hàm lượng RA bằng hoặc cao hơn cây tự nhiên, điều này cho thấy nuôi cấy in vitro không ảnh hưởng tiêu cực đến tích lũy chất hoạt tính. Nồng độ RA tối ưu trong mẫu cây xạ đen in vitro đạt 8-10 mg/100g khô.

4.2. Đánh giá ổn định di truyền bằng kỹ thuật PCR

Ổn định di truyền của cây xạ đen in vitro được xác minh bằng kỹ thuật PCR sử dụng mồi ITS. So sánh DNA sequence giữa cây con và cây mẹ phải giống hệt (>99% đồng nhất) để xác nhận không có biến dị di truyền. Kiểm tra ổn định di truyền từng dòng cây đảm bảo độ tin cậy cao cho ứng dụng trong nhân rộng thương mại và bảo tồn loài cây này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU ❖ Lý do chọn đề tài Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số tại các quốc gia đang phát triển chăm sóc sức khỏe bằng các thuốc y học cổ truyền. Cây dược liệu có giá trị kinh tế lớn hơn so với cây lương thực và thực phẩm. Chính vì vậy, cây dược liệu đã và đang mang lại nguồn lợi lớn cho nền kinh tế ngoài việc cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc. Hiện nay, Việt Nam là một trong 10 trung tâm đa dạng sinh học phong phú nhất thế giới và được xếp hạng 16 trên thế giới về đa dạng nguồn gen.

Trong đó, có rất nhiều nguồn gen được ứng dụng làm thuốc phòng và chữa bệnh.830 loài cây dược liệu dùng làm thuốc, chiếm khoảng 36% trong số 10.500 loài thực vật bậc cao có mạch.000 loài cây làm thuốc trên toàn thế giới, số loài cây thuốc Việt Nam được biết đến chiếm khoảng 11%. Với mục tiêu quản lý, khai thác và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên cây thuốc phục vụ công tác chăm sóc sức khoẻ, góp phần phát triển kinh tế - xã hội và bảo tồn đa dạng sinh học, công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được thực hiện thường xuyên trong nhiều năm qua. Chính vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô đã mở ra hướng ứng dụng cho phép đưa các loài cây này vào điều kiện nuôi cấy in vitro, từ đó có những nghiên cứu sâu hơn nhằm kiểm soát và chủ động sản xuất với số lượng lớn sinh khối tế bào sẽ được sử dụng là nguyên liệu cho các sản phẩm dược phẩm. Điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa và địa hình đa dạng của Việt Nam, là một trong những quốc gia sở hữu nhiều loại dược liệu quý.

Trong đó, có nhiều loài dược liệu chứa các hợp chất quý như sâm Ngọc Linh, cây bá bệnh, cây ba kích và đặc biệt là cây xạ đen, đã được ứng dụng trong y học cổ truyền để điều trị và phòng ngừa nhiều bệnh tật. Cây xạ đen (E. asperula) là một loại dược liệu quý chứa hợp chất alkloid, polyphenols, polysacharide… và hợp chất chính rosmarinic acid. Cây xạ đen từ lâu đã được biết đến, nghiên cứu và sử dụng để ức chế sự phát triển của khối u ác tính, giảm quá trình oxy hóa, tăng cường sức đề kháng.

Loài cây này còn được người dân ở Hòa Bình gọi là cây ung thư trong tiếng Mường. Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh xạ đen có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, ức chế sự phát triển của các khối u ác tính. Mặc dù được sử dụng rộng rãi nhưng việc sử dụng loại dược liệu này vẫn rất hạn chế do nguồn khai thác chủ yếu từ cây trồng hoặc cây hoang dại và chất lượng không đồng đều, trữ lượng có giới hạn. Do đó, việc tìm kiếm một phương pháp khác để có thể sử dụng hiệu quả loài cây thuốc này cũng được quan tâm.

Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng như là một phương pháp thay thế hiệu quả cho 2 các phương pháp trên. Bên cạnh đó, việc bảo tồn nguồn gen quý này cũng cần được thực hiện. Điều kiện in vitro là một trọng những điều kiện thuận lợi cho việc bảo tồn các loài thực vật nói chung và loài xạ đen này. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu quy trình nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro” đã được đề xuất với mong muốn tạo được cây giống xạ đen với số lượng lớn, đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho y học và tạo tiền đề thực hiện những nghiên cứu sau này.

❖ Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula). ❖ Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng lên mẫu cấy - Khảo sát ảnh hưởng của KIN đến quá trình khởi tạo chồi cây xạ đen in vitro - Khảo sát sự ảnh hưởng của 2-ip lên khả năng sinh trưởng chồi cây xạ đen in vitro - Khảo sát sự ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây xạ đen in vitro - Khảo sát sự ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây xạ đen in vitro - Định lượng rosmarinic acid trong mẫu cây xạ đen in vitro - Đánh giá ổn định di truyền của cây xạ đen in vitro ❖ Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài Cây xạ đen (Ehretia asperula) là một loại dược liệu quý chứa hợp chất triterpen, polyphenols, polysacharide… và đặc biệt là rosmarinic acid. Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã nghiên cứu và chứng minh cây xạ đen có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, ức chế sự phát triển của các khối u ác tính. Do đó, nhu cầu về loài cây này trên thị trường là rất lớn trong khi số lượng cá thể trong tự nhiên đang bị giảm sút nghiêm trọng và khả năng tái sinh trong tự nhiên của chúng lại rất thấp.

Chúng ta cần nghiên cứu giải pháp nhanh chóng và kịp thời nhằm đáp ứng tình hình thực tế. Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng như là một phương pháp thay thế hiệu quả cho các vấn đề trên. Bên cạnh đó, việc bảo tồn nguồn gen quý này cũng cần được thực hiện. Điều kiện in vitro là một trong những điều kiện thuận lợi cho việc bảo tồn loài xạ đen này.

Vì vậy đề tài “Nghiên cứu quy trình nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro” có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 3 ❖ Những đóng góp của luận văn Đề tài được đề xuất với mong muốn hoàn thiện quy trình nhân giống cây xạ đen để tạo được cây giống xạ đen với số lượng lớn, đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho y học và tạo tiền đề thực hiện những nghiên cứu sau này. Xác định được nồng độ KIN thích hợp cho khả năng khởi tạo chồi cây xạ đen trong in vitro. Xác định được nồng độ BA và 2-ip thích hợp cho khả năng nhân chồi của cây xạ đen in vitro.

Xác định nồng độ NAA và IBA thích hợp ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ của cây xạ đen in vitro nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đưa ra vườn ươm. Định lượng acid rosmarinic có trong mẫu cây xạ đen in vitro. Đánh giá ổn định di truyền của cây xạ đen in vitro. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.

GIỚI THIỆU VỀ CÂY XẠ ĐEN Giới thiệu về cây xạ đen (Ehretia asperula) Giới : Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Solanales Họ : Boraginaceae Chi : Ehretia Loài : Ehretia asperula Zoll. Hình thái cây xạ đen 2 năm tuổi tại vườn ươm phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới; a) Cây xạ đen; b) Hoa xạ đen; c) Lá xạ đen; d)Trái xạ đen. 5 Trước đây, cây xạ đen được phân loại khoa học với tên gọi Celastrus hindsii, thuộc họ Celastraceae. Tuy nhiên, trong nghiên cứu năm 2009 của Hoa và cộng sự đã xác định lại danh pháp khoa học chính xác của xạ đen là Ehretia asperula Zoll., thuộc họ Boraginaceae [1].

Cây xạ đen phân bố ở các nước châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Myanmar, Thái Lan. Ở Trung Quốc, cây thường mọc ở vùng núi cao từ 1000 - 1500 m. Tại Việt Nam, xạ đen phân bố tự nhiên ở nhiều tỉnh như Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, đặc biệt là các vườn quốc gia như Cúc Phương, Ba Vì… loài cây này mọc tự nhiên trong rừng nhờ khả năng thích nghi tốt. Đặc điểm hình thái Cây xạ đen là một trong những cây dược liệu nổi tiếng với nhiều công dụng chữa bệnh.

Đây là loài cây mọc tự nhiên trong các khu rừng của nước ta như Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Quảng Bình… Cây xạ đen có thân bụi trườn, cao 3 - 5 m; cành màu nâu xám, cứng cáp, không có lông; cành non màu nâu hoặc nâu nhạt. Lá đơn, mọc so le; cuống lá dài 0,6 - 1,5 cm; phiến lá hình ê-líp đến thuôn, kích thước 3 - 12 x 2 - 6 cm, gốc lá tròn, mép thường nguyên. Cụm hoa dạng xim nổi bật, ở đỉnh nhánh, đỉnh cụm hoa phẳng, rộng khoảng 4 - 6 cm, có lông tơ; lá bắc có kích thước 3 - 10 mm, đôi khi dạng cong, dai. Cuống hoa dài 1,5 - 3,0 mm.

Đài hoa màu nâu, kích thước 1,5 - 2,5 mm, có lông tơ. Tràng hoa màu trắng, dạng phễu, kích thước 3,5 - 4,0 mm. Chỉ nhị dài 3,5 - 4,0 mm; bao phấn dài. Vòi nhụy dài 3 - 4 mm.

Ra hoa từ tháng 3 - 5, ra quả tháng 8 - 12. Quả hạch màu đỏ hoặc cam khi chín, đường kính 3 - 4 mm. Cây ưa sáng, ưa đất ẩm. Mùa hoa vào tháng 7 - 11, mùa quả vào tháng 1 - 2 năm sau.

Thành phần hóa học Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây xạ đen chứa nhiều hợp chất như sesquiterpenes, alkaloids, flavonoids, terpenoids, triterpenes, các polyphenol, tannin, acid amin, đường khử và cyanoglycosid. Hai hợp chất chính trong lá xạ đen là rosmarinic acid và lithospermic acid B [2, 3, 4, 5, 6, 7]. Thành phần cụ thể có thể thay đổi tùy thuộc vào thời điểm thu hái và phương pháp chiết xuất [8]. Trong cây xạ đen, hàm lượng lớn các hợp chất phenolic và đặc biệt là RA [9], [10].

Các nghiên cứu cho thấy RA trong lá xạ đen có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn cả vitamin E (α-tocopherol) [9]. Năm 2016, Ly đã thành công trong việc chiết xuất RA từ lá xạ đen khô [11]. Thêm vào đó, nghiên cứu gần đây của Lê và cộng sự (2021) đã chỉ ra rằng RA và hợp chất methyl rosmarinate, có khả năng bảo vệ tế bào võng mạc khỏi tổn thương do stress oxy hóa và các tác nhân gây hại khác [12]. RA 6 là một hợp chất phenolic phổ biến trong các loài thực vật thuộc họ Boraginaceae và Lamiaceae [13].

Tác dụng dược lý Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng, điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc và đặc biệt là trong việc chữa trị ung thư, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ngoài ra, cây còn có tác dụng thông kinh, lợi niệu, và được sử dụng trong điều trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, và bệnh lậu. Ngày nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây xạ đen chứa các hoạt chất chống ung thư rất hiệu quả và được xem là mạnh nhất trong các loại dược liệu có hoạt chất chống ung thư.