Khóa luận Dược sĩ: Nghiên cứu quy trình chiết xuất Triterpenoid từ Rau Má

Khóa luận trình bày quy trình chiết xuất triterpenoid từ rau má (Centella asiatica), khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tối ưu hóa hiệu suất.

• Tác giả: Nguyễn Hà Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Hiền
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Chiết Xuất Triterpenoid Từ Rau Má (Centella Asiatica (L.))
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Cây Rau Má Và Thành Phần Triterpenoid

Rau má (Centella asiatica (L.)) là một cây dược liệu quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và y học hiện đại. Cây này chứa nhiều hoạt chất sinh học quan trọng, đặc biệt là các hợp chất triterpenoid saponin. Các thành phần chính bao gồm asiaticosid, madecassosid, asiatic acid và madecassic acid, có tác dụng mạnh mẽ trong việc tăng cường miễn dịch, chống viêm và tái tạo mô. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất triterpenoid từ rau má là một bước quan trọng để nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn dược liệu quý báu này, đồng thời đáp ứng nhu cầu ngành dược phẩm hiện đại.

1.1. Đặc Điểm Thực Vật Và Phân Bố Của Centella Asiatica

Centella asiatica là loài thực vật thuộc họ Apiaceae, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây này mọc tự nhiên ở nhiều địa phương, đặc biệt là các vùng ẩm ướt như miền Bắc và miền Trung. Rau má có lá hình tròn, dày, chứa nhiều chất nhớt, được sử dụng làm thực phẩm chức năng và dược liệu chữa bệnh từ lâu đời.

1.2. Các Hợp Chất Triterpenoid Chính Trong Rau Má

Thành phần triterpenoid chính trong rau má bao gồm asiaticosid (45-60%), madecassosid (20-30%), asiatic acid và madecassic acid. Những hợp chất này là những saponin triterpenoid có khả năng kích thích tổng hợp collagen, chống oxy hóa và giảm viêm mô. Chính vì vậy, việc tối ưu hóa quá trình chiết xuất để thu được hàm lượng cao các triterpenoid này là mục tiêu chính của các nghiên cứu.

II. Phương Pháp Chiết Xuất Triterpenoid Tối Ưu

Để đạt được hiệu quả chiết xuất triterpenoid từ rau má cao nhất, cần phải khảo sát và tối ưu hóa nhiều yếu tố quan trọng như nồng độ dung môi, thời gian chiết, nhiệt độ, tỉ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết. Các phương pháp chiết xuất thường được sử dụng bao gồm chiết xuất bằng ethanol, chiết xuất siêu âm và chiết xuất ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng ethanol 70-80% là dung môi tối ưu nhất để chiết xuất các hợp chất saponin triterpenoid, giúp tối đa hóa hiệu suất chiết xuất mà vẫn đảm bảo tính ổn định của các hợp chất này.

2.1. Khảo Sát Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hiệu Suất Chiết Xuất

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất triterpenoid bao gồm: nồng độ ethanol (nên trong khoảng 70-80%), thời gian chiết (thường 30-60 phút), nhiệt độ chiết (khoảng 50-70°C), tỉ lệ dung môi/dược liệu (1:10 hoặc 1:15), và số lần chiết (2-3 lần). Mỗi yếu tố cần được khảo sát một cách cẩn thận để xác định điều kiện tối ưu.

2.2. Lựa Chọn Dung Môi Và Điều Kiện Chiết Xuất

Ethanol là lựa chọn hàng đầu cho chiết xuất triterpenoid saponin vì khả năng hòa tan cao và an toàn sinh học. Nồng độ 70% ethanol cho kết quả tốt nhất với hiệu suất chiết xuất cao hơn 80%. Thời gian chiết tối ưu là 45 phút ở nhiệt độ 60°C, kết hợp với tỉ lệ dung môi/dược liệu 1:10 sẽ cho hàm lượng triterpenoid cao nhất.

III. Định Lượng Và Thẩm Định Chất Lượng Triterpenoid

Để đảm bảo chất lượng của chiết xuất triterpenoid, cần thiết lập phương pháp định lượng chính xác và nhạy cảm. HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) là phương pháp được lựa chọn phổ biến nhất để định lượng saponin triterpenoid trong rau má. Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng asiaticosid và madecassosid một cách chính xác, có độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 5% và độ phục hồi (Recovery) 95-105%, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn AOAC (Association of Official Analytical Chemists).

3.1. Thiết Lập Phương Pháp HPTLC Để Định Lượng Triterpenoid

Phương pháp HPTLC bao gồm các bước: chuẩn bị mẫu thử từ chiết xuất rau má, lựa chọn pha động thích hợp (thường là hỗn hợp ethyl acetate:methanol:nước), chấm mẫu lên bản HPTLC và so sánh với chất chuẩn asiaticosid và madecassosid. Phát hiện bằng tia UV ở bước sóng 214nm để xác định các hợp chất triterpenoid.

3.2. Thẩm Định Và Đánh Giá Độ Ổn Định Quy Trình

Quá trình thẩm định phương pháp cần kiểm tra độ chính xác, độ chuyên một, tuyến tính, khoảng xác định và độ bền của phương pháp. Độ ổn định quy trình được đánh giá qua hàm lượng triterpenoid thu được từ các lô sản xuất khác nhau, với biến động < 10% được coi là ổn định chấp nhận được.

IV. Quy Trình Chiết Xuất Tối Ưu Quy Mô Phòng Thí Nghiệm

Dựa trên kết quả nghiên cứu, quy trình chiết xuất triterpenoid tối ưu từ rau má quy mô phòng thí nghiệm được xây dựng như sau: sử dụng rau má tươi hoặc khô, cắt nhỏ, sau đó ngâm với ethanol 70% với tỉ lệ 1:10 (w/v), ở nhiệt độ 60°C trong 45 phút. Thực hiện 3 lần chiết liên tiếp để tối đa hóa hiệu suất. Gộp các dịch chiết, lọc bằng giấy lọc, sau đó cư quá ngưng đông lấy cao khô hoặc tập trung bằng máy chuân hóa chân không. Quy trình này cho hàm lượng triterpenoid đạt 45-60%, đủ đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng dược phẩm.

4.1. Các Bước Thực Hiện Quy Trình Chiết Xuất Chi Tiết

Bước 1: Chuẩn bị dược liệu (rau má khô, cắt nhỏ). Bước 2: Cân chính xác dược liệu theo công thức. Bước 3: Chuẩn bị ethanol 70% với thể tích gấp 10 lần khối lượng dược liệu. Bước 4: Thực hiện chiết xuất ở 60°C trong 45 phút, lặp lại 3 lần. Bước 5: Lọc dịch chiết, gộp chung. Bước 6: Cư quá ngưng đông ở 40-50°C để lấy cao chiết xuất.

4.2. Đánh Giá Độ Ổn Định Và Hiệu Quả Quy Trình

Hiệu suất chiết xuất được tính toán dựa trên khối lượng cao khô thu được và hàm lượng triterpenoid xác định bằng HPTLC. Mục tiêu là hiệu suất ≥ 20% (cao khô) với hàm lượng triterpenoid ≥ 45%. Độ ổn định được kiểm tra qua 3 lô sản xuất liên tiếp, với biến động < 8% được coi là ổn định, phù hợp cho công nghiệp hóa quy trình.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cây rau má (Centella asiatica (L. Vị trí phân loại của Centella Asiatica Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [4], cây Rau má thuộc chi Centella (L.) Urban, một chi nằm trong họ Hoa tán (Apiaceae). Vị trí phân loại của loài Centella asiatica (L.) Urb trong hệ thống phân loại thực vật có thể tóm tắt như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Thù du (Cornidae) Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales) Họ Hoa tán (Apiaceae) Chi Centella (L.

Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái Đặc điểm thực vật Hình 1. Đặc điểm thực vật cây Rau má [5] Rau má là cây thảo nhỏ mọc bò, bén rễ ở các mấu, thân gầy, nhẵn, hơi có lông khi còn non. Lá hình thận hoặc gần tròn, khía tai bèo, phiến nhẵn, rộng 2 – 4 cm, thường mọc thành chùm 2 - 5 cái ở một mấu, so le; cuống lá mảnh, dài 3 - 5 cm, có khi 7 - 8 cm [6], [7]. 2 Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2 – 5 cái ở kẽ lá , gồm 1 – 5 hoa (thường là 3), hoa giữa gần như không có cuống, có màu trắng hoặc phớt đỏ; tổng bao có 2 – 3 mảnh hình trái xoan, lõm, dạng màng; cánh hoa hình tam giác hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [6], [7].

Quả rủ mọc đôi, dẹt, tròn, màu nâu đen, rộng 3 mm đến 5 mm, đỉnh lõm, có 7- 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có vân mạng, Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6 [6], [7], [8]. Phân bố Rau má được tìm thấy nhiều ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á, các tỉnh Nam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam, phân bố đến độ cao 2500m [6], [7]. Ở Việt Nam và các nước vùng nhiệt đới như Lào, Camphuchia, Indonesia, Ấn Độ,…, Rau má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi, độ cao dưới 1800m.

Cây ưa ẩm, hơi chịu bóng; thường mọc thành đám ở vườn, bãi sông suối, nương rẫy, bờ ruộng cao và ven rừng. Sinh thái Rau má thường phân bố tại những khu vực nhiều nắng hoặc hơi râm mát, khí hậu ẩm ướt và đất đai màu mỡ — đặc biệt là các loại đất pha cát giàu chất hữu cơ. Cây này thường mọc dọc theo bờ suối, ven các lối mòn, sát tường, hoặc trong các bãi cỏ ẩm ướt và thoáng đãng, từ độ cao mực nước biển cho đến khoảng 2500 m [9]. Thành phần hóa học Rau má chứa những hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau: saponin triterpenoid, alcaloid, flavonoid, tinh dầu, acid béo, các vitamin B, C và một số acid amin khác Hợp chất saponin triterpenoid: là thành phần chính và có vai trò quan trọng nhất của Rau má, được dùng làm chất đối chiếu hay “dấu vân tay” của rau má trong lĩnh vực kiểm nghiệm.

Các triterpenoid thu được từ Rau má chủ yếu là acid pentacyclic triterpenic và các dẫn xuất glycosid tương ứng [10]. Hợp chất flavonoid: bên cạnh nhóm chất chính saponin triterpenoid thì Rau má cũng chứa một lượng lớn flavonoid. Zainol và cộng sự (2003) đã phân lập được các flavonoid sau từ Rau má [11].1: Một số flavonoid trong Rau má [11] Quercetin Kaempferol Catechin Rutin Naringin Apigenin Thành phần tinh dầu: Theo Quin và cộng sự, thành phần tinh dầu của Rau má tương tự như những loài thuộc chi Hydrocotyle (họ Apiaceae). Bằng phương pháp GC- MS, đã xác định được 45 thành phần từ tinh dầu Rau má, trong dó caryophyllen, farnesol, và elemen là các cấu tử chính [12].

Hợp chất acid amin: Ngoài ra trong Rau má có chứa một số acid amin như alanin, arginin, serin, acid aspartic, acid glutamic,…. Trong đó alanin và serin chiếm chủ yếu [13], [14]. Các thành phần khác: Rau má còn có một số thành phần khác như alcaloid, tannin, steroid, phenolic, carbohydrat, vitamin, chất khoáng. Tác dụng dược lý Rau má là dược liệu quan trọng trong y học cổ truyền, đặc biệt ở châu Á, và ngày càng được chú ý trong y học hiện đại nhờ các tác dụng dược lý đa dạng mang lại tiềm năng lớn trong phát triển dược phẩm và mỹ phẩm.

Thông qua các nghiên cứu đã được thực hiện, sau đây là một số tác dụng dược lý nổi bật của Rau má.2: Một số tác dụng dược lý của Rau má Tác dụng Chi tiết TLTK Làm lành vết loét Ngăn chặn ổ loét dạ dày do gò bó và hạ nhiệt hoặc [15], [16], dạ dày tác nhân acid acetic, bảo vệ niêm mạc dưới tác động [17] của ethanol và gốc tự do 4 Tác dụng Chi tiết TLTK Làm lành vết Thúc đẩy quá trình lành vết thương thông qua tăng [18], [19] thương trên da sinh tế bào, tổng hợp collagen I, FGF, VEGF, và hình thành mạch máu Điều hòa miễn Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà không [20], [21], dịch, chống ung gây độc đối với tế bào lympho, làm chậm phát triển [22] bướu và gây độc khối u rắn và cổ trướng, phòng ngừa ung thư đại tế bào tràng, ung thư da và điều hòa yếu tố hoại tử khối u Tác dụng trên tim Cải thiện tình trạng phù, cải thiện vi tuần hoàn, tăng [23], [24], mạch hiệu quả lọc ở mao mạch, bảo vệ tế bào cơ tim khỏi [25], [26] tác nhân gây tổn thương (Adriamycin), cải thiện tình trạng tái tưới máu và thiếu máu cục bộ cơ tim Bảo vệ gan Chống ung thư gan, cải thiện các tổn thương xơ hóa [27], [28] gan và điều hòa chức năng gan thông qua phục hồi sản xuất cytokin Kháng khuẩn và Có hoạt tính kháng khuẩn đối với Bacillus cereus và [29], [30], chống oxy hóa Listeria monocytogenes trong điều kiện bình thường [31], [32], và pH thấp, hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn [33], [34] đường ruột, hoạt tính chống oxy hóa cao, trung hòa gốc tự do DPPH và khử ion sắt (III) Các tác dụng khác Tác dụng tăng đồng hóa, chống lao và phong, chống [35], [36] vảy nến, chống giun sán và đơn bào, chống virus, chống co thắt, ức chế sinh sản quá nhanh ở chuột 1. Công dụng Hầu hết các tác dụng của Rau má đều được ứng dụng để chữa bệnh. Hiện nay loại cây thảo quý này được dùng cá theo phương pháp Y học dân gian và Y học hiện đại. Tại Việt Nam, rau má được dùng làm nước giải khát và hỗ trợ điều trị lao, phong.

Ở Trung Quốc, rau má chữa các bệnh cảm mạo, đau đầu, viêm họng, viêm tiết niệu, eczema và mẩn ngứa. Y học Ấn Độ dùng rau má trị rối loạn thần kinh và hỗ trợ tiêu hóa. Tại Madagascar, Nepal, Thái Lan và Indonesia, rau má được ứng dụng trong chữa phong, loét dạ dày, tiêu hóa, và làm thuốc lợi sữa [6], [7]. Trong Y học dân gian ở các nước trên thế giới.

Rau má được dùng rộng rãi làm thuốc chữa các bệnh ngoài da như rôm sảy, mẩn ngứa, làm thuốc liền sẹo; đắp ngoài chữa các vết thương do ngã, gãy xương, bong gân và làm tan ung nhọt. Rau má còn được sử dụng đơn lẻ hay phối hợp với các vị thuốc khác theo đường toàn thân, chữa các 5 bệnh về gan, chữa loét dạ dày, sốt, cảm mạo, đau đầu, thổ huyết, kiết lỵ, viêm amidan, viêm phế quản và viêm đường tiết niệu [6], [7]. Trong y học hiện đại, rau má ít được dùng trực tiếp, mà thường ở dạng cao đã tiêu chuẩn hóa bằng đường uống, tiêm bắp hoặc dưới da [3]. Cao rau má điều trị bỏng độ hai và độ ba có tác dụng dự phòng sự co rúm và sưng do nhiễm khuẩn và ức chế tạo sẹo lồi.

Kem chứa 1% cao rau má điều trị nhiễm khuẩn mạn tính. Viên nang chứa cao rau má hoặc asiaticosid và kali clorid có hiệu quả như dapson trong điều trị bệnh nhân phong. Cao rau má tiêu chuẩn hóa được dùng trong điều trị bệnh loét dạ dày tá tràng có tác dụng tốt cải thiện các hiệu ứng chủ quan và làm lành các vết loét ở 73% bệnh nhân qua xét nghiệm bằng nội soi và chụp tia Rơngen [6]. Tổng quan về triterpenoid trong Rau má Các triterpenoid trong rau má thuộc nhóm pentacyclic triterpenoid, có khung cơ bản là ursan hoặc oleanan [13] Nhóm ursan gồm 4 saponin chính là asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, và acid madecassic.

Acid asiatic: R= H, R1 = OH Acid madecassic: R= OH, R1 = OH O Asiaticosid: R= H, R1 = O – Glu (6 → 1) – Glu (4 → 1) – Rham Madecassosid: R= OH, R1 = O – Glu (6 → 1) – Glu (4 → 1) – Rham Hình 1. Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má Nhóm oleanan gồm 2 saponin chính là asiaticosid B và acid terminolic. Hai chất này cũng là 1 cặp glycosid - aglycon tương ứng [13]. Acid termonilic: R= OH, R1 = OH O Asiaticosid B: R= OH, R1 = O – Glu (6 → 1) – Glu (4 → 1) – Rham Hình 1.

Cấu trúc các saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má Hàm lượng triterpenoid trong rau má thay đổi tùy thuộc vào khu vực địa lý và bộ phận thực vật. Trong một nghiên cứu chỉ ra rằng, Rau má ở Madagascar có thể chứa từ 6 2,6% đến 6,42% asiaticosid theo khối lượng dược liệu khô [37]. Trong nghiên cứu của Aziz và cộng sự đã kết luận rằng Rau má có hàm lượng triterpenoid cao nhất ở lá và thấp nhất ở rễ [38]. Hoạt chất triterpenoid trong Rau má thường tồn tại dưới dạng saponin (glycosid) hoặc dạng acid tự do (aglycon).

Trong đó, các triterpenoid chính bao gồm asiaticosid, madecassosid, và các aglycon tương ứng là acid asiatic và acid madecassic. Ngoài ra, rau má còn chứa một số triterpenoid khác như brahmosid, brahminosid, thankunisid, isothankunisid và centellose; tuy nhiên asiaticosid, madecassosid, acid asiatic và acid madecassic là bốn hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng nhất về mặt dược lý [39]. Các hợp triterpenoid chính trong Rau má ❖ Asiaticosid Asiaticosid là một triterpenoid pentacyclic thuộc nhóm ursan, đây là một trong những triterpenoid có hàm lượng cao nhất trong Rau má và thường được sử dụng làm chất chỉ điểm để đánh giá chất lượng nguyên liệu Rau má. Tên đồng nghĩa: Emdecassol, Dermatologico.

Công thức phân tử: C48H78O19. Khối lượng phân tử: 959,12 g/mol. Công thức cấu tạo của asiaticosid Tính chất vật lý: Asiaticosid tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, có khả năng tan tốt trong các dung môi phân cực như nước nóng, ethanol và methanol, nhưng lại ít tan hoặc không tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực như ether hay chloroform [40]. ❖ Madecassosid Madecassosid cũng là một saponin triterpenoid pentacyclic thuộc nhóm ursan, có cấu trúc hóa học rất gần với asiaticosid.