Khóa luận: Nghiên cứu quy trình chiết xuất lignan từ quả ngũ vị tử nam

Khóa luận Dược sĩ trình bày quy trình chiết xuất Lignan từ quả Ngũ vị tử nam. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng và phương pháp làm giàu hoạt chất.

• Tác giả: Đỗ Thị Phương Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất lignan từ quả ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera Rehd.)
• Loại tài liệu: Khoá luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về quả ngũ vị tử nam và thành phần lignan

Quả ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera Rehd.) là một loài thực vật quý hiếm có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đặc biệt phong phú tại Ngọc Linh. Cây này chứa nhiều hợp chất có giá trị dược liệu, trong đó lignan là thành phần chính được nghiên cứu rộng rãi. Lignan từ ngũ vị tử bao gồm các hợp chất như Schisandrin, Gomisin B và Schisandrin A, có hoạt tính sinh học mạnh mẽ. Các hợp chất này có tác dụng bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa. Nghiên cứu quy trình chiết xuất lignan tối ưu là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận và nâng cao chất lượng sản phẩm dược phẩm từ ngũ vị tử nam.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân loại thực vật ngũ vị tử

Ngũ vị tử nam thuộc họ Schisandraceae, là cây leo có lá xanh quanh năm. Quả của cây có màu đỏ hoặc xanh tùy theo loài và độ chín. Cây phân bố tự nhiên ở vùng miền núi Tây Bắc Việt Nam, đặc biệt tại Ngọc Linh. Thực vật này được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh liên quan đến gan, thận và hệ miễn dịch. Bậc hệ phân loại của ngũ vị tử nam rất quan trọng để xác định chất lượng và hàm lượng hoạt chất.

1.2. Thành phần hoá học và tác dụng dược lý của lignan

Lignan là nhóm hợp chất dibenzocyclooctadien có cấu trúc phức tạp. Thành phần chính gồm Schisandrin A, Schisandrin B, Gomisin A, Gomisin B và các đẳng phân của chúng. Các tác dụng sinh học của lignan bao gồm: bảo vệ tế bào gan, chống viêm, chống oxy hóa, tăng cường chức năng thận và hỗ trợ hệ thần kinh. Những tính chất này làm cho lignan trở thành thành phần giá trị trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

II. Các phương pháp và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất lignan

Quy trình chiết xuất lignan là bước quan trọng để tách chiết các hợp chất có giá trị từ quả ngũ vị tử nam. Sự thành công của chiết xuất lignan tối ưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố kỹ thuật và hoá học. Các phương pháp chiết xuất thường được sử dụng bao gồm ngâm, sốt, chiết bằng dung môi hữu cơ và chiết bằng nước. Việc lựa chọn dung môi chiết là yếu tố then chốt, bao gồm ethanol, methanol, nước hoặc hỗn hợp của chúng. Ngoài ra, kích thước dược liệu, tỉ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết và số lần chiết đều ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết và hàm lượng lignan trong cao chiết cuối cùng.

2.1. Ảnh hưởng của dung môi và kích thước dược liệu

Dung môi chiết quyết định khả năng hòa tan các thành phần lignan từ quả ngũ vị tử. Ethanol 70-95% cho hiệu suất chiết cao nhất so với nước chuẩn. Kích thước dương liệu cũng rất quan trọng: dương liệu được chia nhỏ (40-60 mesh) tăng diện tích tiếp xúc, nâng cao hiệu suất chiết. Việc xay nhỏ dược liệu trước khi chiết giúp tăng khả năng khuếch tán dung môi vào mô thực vật.

2.2. Tỉ lệ dược liệu dung môi và số lần chiết

Tỉ lệ dương liệu/dung môi là yếu tố quyết định hiệu quả chiết. Tỉ lệ 1:10 hoặc 1:15 (w/v) thường cho kết quả tốt nhất. Số lần chiết ảnh hưởng đến tổng hàm lượng lignan thu được: chiết 2-3 lần với nước sôi hoặc dung môi hữu cơ cho hiệu suất tối ưu. Chiết lần cuối cùng phải đạt mức bão hòa để đảm bảo thu hồi toàn bộ hoạt chất có giá trị.

III. Quy trình tối ưu hóa và đánh giá chất lượng cao chiết lignan

Quy trình chiết xuất lignan tối ưu cần được thiết lập thông qua các thí nghiệm khoa học có kiểm soát. Sau khi xác định các thông số tối ưu (dung môi, tỉ lệ, số lần chiết), cần tiến hành đánh giá độ ổn định quy trình để đảm bảo tính lặp lại và chất lượng sản phẩm. Phương pháp định lượng lignan sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng các hợp chất chính như Schisandrin A, Schisandrin B và Gomisin. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng để đánh giá định tính sự có mặt của các thành phần lignan. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu giúp tăng hiệu suất chiết lên 15-20% so với phương pháp truyền thống.

3.1. Phương pháp HPLC định lượng lignan và các thông số phân tích

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là phương pháp phân tích chính xác để định lượng lignan. Phương pháp sử dụng cột C18, pha động là hỗn hợp nước-acetonitrile, phát hiện bằng UV tại bước sóng 254 nm. Các hợp chất lignan như Schisandrin A, Schisandrin B được phân tách rõ ràng với thời gian lưu khác nhau. Hàm lượng lignan tính bằng mg/g cao chiết khô. Phương pháp HPLC đảm bảo độ chính xác cao, lặp lại tốt và có thể phát hiện các yếu tố gây ô nhiễm.

3.2. Đánh giá độ ổn định quy trình và kiểm soát chất lượng

Độ ổn định quy trình chiết được đánh giá qua 3-5 lần lặp lại với cùng thông số tối ưu. Hiệu suất chiết và hàm lượng lignan giữa các lần không được chênh lệch quá 5%. Cao chiết được bảo quản ở điều kiện ánh sáng mờ, nhiệt độ thấp (2-8°C) để đánh giá độ ổn định theo thời gian. Kiểm soát chất lượng bao gồm xác định độ ẩm, tạp chất ngoại lai, đặc tính lý hóa của cao chiết.

IV. Các phương pháp làm giàu lignan và ứng dụng thực tiễn

Sau khi chiết xuất, làm giàu lignan là bước tiếp theo để nâng cao hàm lượng lignan trong sản phẩm cuối cùng. Các phương pháp làm giàu chính bao gồm chiết phân bố lỏng-lỏng sử dụng các cặp dung môi không hỗn trộn, và hấp phụ bằng nhựa hấp phụ. Chiết phân bố lỏng-lỏng là kỹ thuật sử dụng khác biệt độ hòa tan của lignan trong các dung môi khác nhau để tách chiết. Phương pháp này có thể tăng hàm lượng lignan lên 30-50% so với cao chiết ban đầu. Nhựa hấp phụ như D101, HPD600 hoặc AB-8 có khả năng hấp phụ chọn lọc các hợp chất lignan, cho phép thu được sản phẩm cao độ tinh khiết. Các sản phẩm lignan làm giàu có thể ứng dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm với hiệu quả sinh học cao hơn.

4.1. Phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng làm giàu lignan

Chiết phân bố lỏng-lỏng sử dụng hai pha dung môi không hỗn trộp như nước và ethyl axetat, hoặc n-butanol và nước. Cao chiết ngũ vị tử được hòa tan trong pha nước, sau đó trộn với pha hữu cơ. Lignan có độ hòa tan cao hơn trong pha hữu cơ nên sẽ chuyển sang pha này. Quá trình lặp lại 3-5 lần để thu hồi tối đa hàm lượng lignan. Pha hữu cơ được cúc tập và bay hơi dung môi để thu cao chiết giàu lignan.

4.2. Phương pháp hấp phụ nhựa và ứng dụng thực tiễn

Nhựa hấp phụ (D101, AB-8, HPD600) có khả năng hấp phụ chọn lọc lignan dựa trên kích thước phân tử và tính năng lượng tử học. Cao chiết được thông qua cột nhựa, lignan được hấp phụ lên nhựa trong khi các tạp chất được rửa trôi. Sau đó, sử dụng dung môi thích hợp (ethanol) để giải hấp phụ lignan. Phương pháp này cho sản phẩm lignan độ tinh khiết cao (>60-70%), phù hợp sản xuất dược phẩm chất lượng cao và thực phẩm chức năng có tác dụng bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .TỔNG QUAN VỀ NGŨ VỊ TỬ. Phân loại thực vật. Đặc điểm thực vật. Thành phần hoá học.

Tác dụng của Ngũ vị tử. Các sản phẩm từ Ngũ vị tử tại Ngọc Linh .MỘT SỐ QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NGŨ VỊ TỬ. 13 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất lignan. Phương pháp đánh giá tính ổn định quy trình chiết xuất lignan từ quả Ngũ vị tử nam.

Bước đầu nghiên cứu các phương pháp làm giàu lignan. Phương pháp định tính lignan.Phương pháp định lượng lignan. 22 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT LIGNAN TỪ QUẢ NGŨ VỊ TỬ NAM.

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố dung môi chiết. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố kích thước dược liệu. Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp chiết. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dược liệu/dung môi.

Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết. Đánh giá độ ổn định quy trình chiết lignan từ quả Ngũ vị tử nam. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU LIGNAN. Làm giàu lignan bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng.

Làm giàu lignan bằng phương pháp hấp phụ. 37 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN. 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO:.

49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao). TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng). DAD Diod Array Detector. HS Hiệu suất.

HL Hàm lượng. HK-2 Human kidney-2. HGF Hepatocyte Growth Factor ( Yếu tố tăng trưởng tế bào gan). EGF Epidermal Growth Factor ( Yếu tố tăng trưởng biểu bì).

HBV Hepatitis B Virus ( Virus B gây viêm gan). HCV Hepatitis C Virus ( Virus C gây viêm gan). AST Aspartate aminotransferase. ALT Alanine aminotransferase.

SGPT Serum glutamic-pyruvic transaminase. DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1. Tính chất hoá lý của các hợp chất lignan: Gomisin B, Schisandrin và Schisandrin A. Tác dụng sinh học chính của một số lignan nhóm dibenzocyclooctadien của chi Schisandra.

Tỷ lệ hệ dung môi pha động theo thời gian. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết và hàm lượng lignan trong cao. Ảnh hưởng của kích thước dược liệu đến hiệu suất chiết và hàm lượng lignan. Ảnh hưởng của phương pháp chiết tới hiệu suất chiết và hàm lượng lignan trong cao.

Ảnh hưởng của tỉ lệ dược liệu/dung môi. Ảnh hưởng của số lần chiết khi thay đổi tỷ lệ dược liệu/dung môi. Kết quả quá trình chiết xuất Lignan quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả định lượng các phân đoạn cao chiết của quá trình làm giàu bằng chiết phân bố lỏng – lỏng.

Kết quả quá trình làm giàu bằng hạt nhựa hấp phụ. 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1. Một số hình ảnh về cây Ngũ vị tử thu hái tại Ngọc Linh. Cấu trúc hoá học một số hợp chất phân lập từ cây Ngũ vị tử tại Ngọc Linh.

Mẫu quả khô Ngũ vị tử thu hái ở Ngọc Linh kích thước thô. Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu. Sơ đồ quy trình làm giàu lignan bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng. Sắc ký lớp mỏng các dung môi chiết quả Ngũ vị tử nam ở bước sóng 254nm (hệ dung môi: n-Hexan: Ethyl acetat = 7:3).

Biểu đồ ảnh hưởng ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất và hàm lượng lignan trong cao. Ảnh hưởng của các phương pháp chiết đến HS chiết lignan theo thời gian. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược liệu/dung môi tới hiệu suất chiết và hàm lượng Lignan trong cao. Sắc ký lớp mỏng phân đoạn làm giàu lignan của các dung môi hữu cơ ở bước sóng 254nm.

35 dụng làm giảm SGPT huyết tương, các enzym chuyển hóa của gan như LGPT, ALT và AST [13], [30]. Gần đây, một vài lignan như gomisin A, gomisin G, schisandrin và schisanhenol được báo cáo có tác dụng chống ung thư do tác dụng ức chế khả năng hoạt động của virus Epstein- Barr [12], ức chế đa kháng thuốc của P-glycoprotein [16], [42], tăng cường cảm ứng của doxorubicin trên thế bào ung thư gan ở người và khả năng kháng HIV [30]. Tác dụng sinh học chính của một số lignan nhóm dibenzocyclooctadien của chi Schisandra. Tên hoạt chất Tác dụng sinh học Tác giả công bố Gomisin B Cải thiện trí nhớ [38], [39] Chống oxy hoá, bảo vệ Schisandrin [21] gan, giảm đau Schisandrin A Bảo vệ gan, chống viêm [22], [31], [36] Chống ung thư, kháng Gomisin A virus, chống oxy hoá, [24], [37] bảo vệ gan.

Các sản phẩm từ Ngũ vị tử tại Ngọc Linh Hiện nay trên thị trường đã có một số sản phẩm được chế biến từ quả Ngũ vị tử tại Ngọc Linh như Hepaschis của Công ty Vạn Xuân, sản phẩm trà túi lọc và trà hoà tan Ngũ vị tử của Công ty Thái Hoà với tác dụng bảo vệ gan. Các sản 12 phẩm này còn hạn chế về dạng bào chế, nhất là vấn đề tối ưu hoá chiết xuất nhóm hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan. Ở châu Âu, nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết Ngũ vị tử được sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm có tác dụng chống lão hoá, giảm nếp nhăn, cải thiện làm da [15]. Ngoài ra, cao chiết Ngũ vị tử còn được phối hợp với các dược liệu khác như sâm (sản phẩm Ginseng Schizandra supreme) giúp tăng cường sức khỏe, khả năng miễn dịch của cơ thể.

Ngũ vị tử còn là vị thuốc trong nhiều bài thuốc cổ truyền, làm trà uống để tăng cường sức khỏe. Hiện nay, các bài thuốc và trà đã được hiện đại hóa dạng bào chế thành các dạng viên nang, dạng gói nhúng nhằm thuận tiện cho sử dụng. Các dạng bào chế mới của Ngũ vị tử đã được bán rất nhiều trên thị trường.Một số quy trình chiết xuất Ngũ vị tử Các nghiên cứu về thành phần hoá học đã xác định được lignan là một nhóm hoạt chất tồn tại trong quả Ngũ vị tử [3], [8], [11]. Tuy nhiên hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về quy trình chiết xuất lignan từ quả của cây Ngũ vị tử nam thu hái ở Ngọc Linh (Schisandra Sphenanthera).

Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về phương pháp chiết xuất quả của chi Schisandra: Schisandra Chinensis và Schisandra Sphenathera của Trung Quốc: * Phương pháp chiết siêu âm: Lấy một lượng Ngũ vị tử Bắc (Schisandra Chinensis) khô đã chưng cất để loại bỏ tinh dầu cho vào bình nón, thêm dung môi cồn, tỉ lệ rắn : lỏng khoảng 1:7 đến 1:9, chiết sử dụng siêu âm trong thời gian 10 – 60 phút, công suất 100 – 250W[44]. *Phương pháp chiết CO2 siêu tới hạn: Với nguyên liệu thô là bột quả Schisandra, chiết dưới áp suất 20 - 35MPa, nhiệt độ 30 - 50 ℃, chiết tĩnh hoặc ngâm tính 2-10 giờ. Sau đó chiết ở áp suất 20- 35Mpa, nhiệt độ 30-50oC, chiết động trong 2-6 giờ, tốc độ dòng chảy 1-4L/phút 13 thu được dịch chiết có thành phần là lignan từ quả Schisandra. Hàm lượng lignan trong sản phẩm chiết đạt hơn 8%, hiệu suất chiết lignan đạt trên 90% [41].

Phương pháp này cũng được áp dụng để điều chế dịch chiết dùng cho mỹ phẩm, cách tiến hành: 5kg quả khô của Schisandra chinensis ("nguyên liệu thô") (độ ẩm của nguyên liệu thô là 20,75% trọng lượng) được chiết xuất bằng cách sử dụng carbon dioxide siêu tới hạn. Nguyên liệu thô được đặt trong một bình có chứa carbon dioxide siêu tới hạn. Áp suất 130 bar, nhiệt độ 55 ° C, tốc độ dòng chảy của carbon dioxide siêu tới hạn là 25kg/h, 184kg carbon dioxide siêu tới hạn để chiết xuất 486 g nguyên liệu thô [15]. *Phương pháp chiết hồi lưu: Với nguyên liệu thô là bột quả Schisandra, chiết hồi lưu trong dung môi ethanol 60 -95o, tỉ lệ rắn : lỏng là 1:5 đến 1:20, chiết trong thời gian 1-3 giờ, chiết 1-3 lần, lọc, cô đặc dịch chiết.

Hàm lượng lignan trong sản phẩm chiết đạt hơn 3%, hiệu suất chiết lignan đạt hơn 56% [41]. 14 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Nguyên liệu Mẫu Ngũ vị tử nam là mẫu của đề tài cấp Bộ Y tế “ Nghiên cứu tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gan mạn tính từ Ngũ vị tử (Schisandra Sphenanthera Rehder et Wills. Schisandraceae) thu hái tại Việt Nam”, có nguồn gốc từ vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum được thu mua 09/2020.

Mẫu khi mua ở dạng quả khô được bảo quản trong túi PE ở nhiệt độ phòng. Sau đó mẫu được nghiền bằng máy xay sinh tố, sử dụng rây bột có kích thước mắt 0.35 và 1mm để phân loại kích thước. Mẫu sau khi phân loại xác định hàm ẩm đạt 3.09%, với hàm lượng lignan tổng tính trên 3 thành phần schisandrin, gomisin B và schisandrin A đạt 0. Mẫu quả khô Ngũ vị tử thu hái ở Ngọc Linh kích thước thô.

Hoá chất và thiết bị sử dụng Hoá chất sử dụng và nguồn gốc - Chất chuẩn: Schisandrin (hàm lượng 98% - USP Reference Standard), gomisin B (hàm lượng 98% - Biopurify Phytochemicals Ltd ) và schisandrin A (hàm lượng 98%- Biopurify Phytochemicals Ltd ). - Dung môi phân tích HPLC (Fisher Mỹ). - Nước cất 2 lần. 15 - Hạt nhựa hấp phụ macroporous D101 ( Anhui sanxing resin technology, Trung Quốc).

- Dung môi khác: Ethanol, Methanol, n-Hexan, Dicloromethan, Ethyl acetat (Trung Quốc). - Cồn công nghiệp ( Vietchem). Thiết bị sử dụng - Hệ thống HPLC Shimadzu, Nhật Bản. - Máy đo hàm ẩm OHAUS, Thuỵ Sĩ.

- Máy cô quay DaiHan: dung tích bình 100ml, 250ml, 1L, 2L. - Thiết bị ly tâm ( Zenithlab (Jiangsu) Co.Ltd, Trung Quốc). - Bể điều nhiệt DaiHan Cr-8. - Thiết bị siêu âm (Daihan scientific Co.

Ltd, Hàn Quốc). - Tủ sấy thường Binder – FD 115 dung tích 100L. - Cân phân tích 4 số (AND – Nhật Bản). - Cột thuỷ tinh loại: 2.

- Màng lọc PTFE 0. - Phễu lọc Buchner. - Rây với các đường kính mắt rây: 0. - Hạt nhựa hấp phụ macroporous D101.

- Các dụng cụ khác: Bình định mức, bình nón, micropipet 100-1000 𝜇L, pipet 5ml, 10ml, ống đong, ống nghiệm, đũa thuỷ tinh. Nội dung nghiên cứu *Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu: 16 Quả Ngũ vị tử khô - Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất chiết lignan. Chiết xuất lignan - Lựa chọn ra thông số tối ưu và đánh giá độ ổn định của quy trình. Dịch chiết thô - Đánh giá, so sánh bước đầu phương pháp làm giàu lignan ở một số phân Làm giàu lignan đoạn và sử dụng chất hấp phụ.

- Bước đầu lựa chọn phương pháp thực hiện cho quy trình làm giàu Lignan. Cao chiết Ngũ vị tử giàu lignan Hình 2.