Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cần tây (Apium graveolens L.)

Luận văn trình bày quy trình nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cần tây, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và xây dựng tiêu chuẩn.

• Tác giả: Nguyễn Văn Phương
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thu Hằng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền
• Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cây cần tây (Apium graveolens L.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ dược học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về hạt cần tây và flavonoid

Hạt cần tây (Apium graveolens L.) là một nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú chứa nhiều hợp chất flavonoid có giá trị cao. Flavonoid là các polyphenol thiên nhiên với tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ sức khỏe con người. Các nghiên cứu khoa học từ Đại học Dược Hà Nội đã xác nhận rằng hạt cần tây chứa nồng độ flavonoid đáng kể, đặc biệt là những hợp chất như 3-n-butylphtalid (3nB). Những chất này có khả năng hỗ trợ điều trị các bệnh mạn tính như gút, cao huyết áp và các bệnh liên quan đến viêm nhiễm. Việc chiết xuất cao flavonoid từ hạt cần tây không chỉ giúp tập trung hóa các dưỡng chất quý hiếm mà còn tạo ra các sản phẩm dược phẩm hiệu quả, an toàn cho sức khỏe.

1.1. Đặc điểm thực vật của cần tây

Cần tây (Apium graveolens L.) là một loài cây thuộc họ Apiaceae, được phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới trên thế giới. Hạt cần tây là bộ phận có giá trị dược liệu cao nhất, chứa nhiều tinh dầu và hợp chất flavonoid quý giá. Hạt có kích thước nhỏ, màu vàng nâu, mùi thơm đặc trưng và hương vị hơi cay đắng.

1.2. Thành phần hóa học chính

Flavonoid toàn phần là thành phần chính cần quan tâm khi chiết xuất cao từ hạt cần tây. Ngoài ra, hạt còn chứa tinh dầu, carbohydrate, protein và các chất khoáng quan trọng. Các flavonoid như quercetin, kaempferol và luteolin có tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa hiệu quả, là cơ sở khoa học cho ứng dụng dược phẩm của sản phẩm này.

II. Quy trình chiết xuất cao flavonoid từ hạt cần tây

Quy trình chiết xuất cao flavonoid từ hạt cần tây yêu cầu sự tối ưu hóa nhiều yếu tố khác nhau để đạt hiệu suất cao và chất lượng tốt nhất. Theo luận văn Thạc sĩ Dược học của Nguyễn Văn Phương tại Đại học Dược Hà Nộ, quá trình chiết xuất bao gồm các bước chuẩn bị nguyên liệu, xác định các biến số tối ưu như dung môi, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ dược liệu. Phương pháp nghiên cứu sử dụng chủ yếu là phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tìm ra điều kiện tối ưu. Kết quả cho thấy việc chiết xuất cao cần tây có thể được tiến hành ở quy mô khác nhau, từ 15g đến 500g dược liệu, với độ lặp lại cao.

2.1. Chuẩn bị nguyên liệu và các yếu tố ảnh hưởng

Trước khi tiến hành chiết xuất cao flavonoid, cần phải chuẩn bị hạt cần tây bằng cách làm sạch, sấy khô hoàn toàn. Kích thước dược liệu có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết xuất, hạt nhỏ hơn giúp tăng diện tích tiếp xúc. Tỷ lệ dung môi so với dược liệu, nhiệt độ chiết xuất và số lần chiết xuất là những yếu tố then chốt quyết định hiệu quả chiết xuất cao từ hạt cần tây.

2.2. Dung môi và điều kiện tối ưu

Lựa chọn dung môi chiết xuất là bước quan trọng nhất. Nghiên cứu chỉ ra rằng ethanol 70% cho hiệu suất chiết xuất flavonoid tốt nhất. Nhiệt độ chiết xuất nên duy trì ở 50-60°C, thời gian khoảng 2-3 giờ, số lần chiết xuất 2-3 lần. Tỷ lệ dung môi:dược liệu 10:1 cho kết quả tối ưu nhất.

III. Phương pháp định lượng và khảo sát chất lượng

Để đảm bảo chất lượng cao flavonoid từ hạt cần tây, cần thiết lập phương pháp định lượng flavonoid toàn phần tin cậy và chính xác. Phương pháp sử dụng chuẩn quercetin làm hệ số chuẩn để đo nồng độ flavonoid toàn phần bằng quang phổ UV-Vis ở bước sóng 415nm. Phương pháp thẩm định bao gồm kiểm tra độ chuyên biệt (specificity), độ tuyến tính (linearity), độ chính xác (accuracy) và độ lặp lại (precision). Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định theo tiêu chuẩn ICH. Ngoài ra, cần khảo sát các chỉ tiêu kiểm nghiệm khác như mất khối lượng do làm khô, hàm lượng tro, độ ẩm để đảm bảo chất lượng cao cần tây đáp ứng tiêu chuẩn dược phẩm.

3.1. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn định lượng

Định lượng flavonoid toàn phần được thực hiện bằng phương pháp phức tạp với chuẩn quercetin. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác, sau đó pha loãng thành các nồng độ khác nhau để vẽ đường chuẩn. Mẫu thử từ cao cần tây được xử lý tương tự, đo quang phổ và tính toán hàm lượng flavonoid.

3.2. Các chỉ tiêu kiểm nghiệm chất lượng cao

Chỉ tiêu kiểm nghiệm cao cần tây bao gồm: mất khối lượng do làm khô (<10%), hàm lượng tro (<5%), độ ẩm (<10%), hàm lượng flavonoid toàn phần (>8% theo tính toán từ quercetin). Các chỉ tiêu này đảm bảo cao từ hạt cần tây đạt chuẩn dược phẩm, an toàn sử dụng lâu dài cho bệnh nhân.

IV. Ứng dụng và triển vọng phát triển

Cao flavonoid từ hạt cần tây có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Những hợp chất flavonoid từ hạt cần tây có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp giảm bệnh gút, kiểm soát huyết áp và hỗ trợ điều trị viêm nhiễm. Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện nhiều sản phẩm từ hạt cần tây dưới dạng viên, bột, trà, chiết xuất lỏng. Tuy nhiên, các sản phẩm này còn thiếu tiêu chuẩn chất lượng thống nhất. Quy trình chiết xuất hoàn chỉnh được phát triển tại Đại học Dược Hà Nội cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để sản xuất cao cần tây theo tiêu chuẩn dược phẩm. Điều này mở ra cơ hội phát triển sản phẩm dược phẩm chất lượng cao từ hạt cần tây phục vụ nhu cầu sức khỏe cộng đồng.

4.1. Tác dụng sinh học và ứng dụng lâm sàng

Flavonoid từ hạt cần tây thể hiện nhiều tác dụng sinh học quý giá: chống oxy hóa, kháng viêm, hạ huyết áp, giảm bệnh gút thông qua ức chế enzyme xanthin oxidase. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy sản phẩm từ hạt cần tây giúp kiểm soát bệnh gút hiệu quả, giảm đau và ngăn ngừa tái phát. Nó cũng hỗ trợ bảo vệ tim mạch, cải thiện tuần hoàn máu.

4.2. Triển vọng phát triển sản phẩm

Quy trình chiết xuất cao cần tây được tiêu chuẩn hóa mở đường cho sản xuất công nghiệp cao flavonoid từ hạt cần tây. Các sản phẩm dược phẩm từ cao cần tây có thể phát triển thành thuốc đồng dược, thực phẩm chức năng hay mỹ phẩm. Triển vọng thị trường rất lớn với nhu cầu sản phẩm tự nhiên, an toàn ngày càng tăng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cần tây (Apium graveolens L.) là loại cây rau ăn được trồng rất phổ biến trên thế giới và đã được di thực về trồng ở Việt Nam. Hạt cần tây được đánh giá là dược liệu tiềm năng để phát triển sản phẩm phòng và điều trị bệnh gút do tác dụng hạ acid uric [57], ức chế xanthin oxidase [5], chống viêm [65], giảm đau [63] của dược liệu này đã được chứng minh trên thực nghiệm. Tại một số quốc gia đã có sản phẩm từ hạt cần tây để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gút như Cachets Lesourd (Gabriel Lesourd Laboratoires - Pháp), Celery Plus (Swiss Bio Pharma - Thụy sĩ), Rheumatic Pain (The Cantassium Company - Anh), Arthritic Pain Herbal Formula 1 (Mayne Pharma - Mỹ), Apium Graveolens (Standard Homeopathic - Canada)…[82]. Flavonoid là một trong những thành phần chính của hạt cần tây [38], đồng thời cũng là nhóm hợp chất liên quan đến tác dụng hạ acid uric và chống viêm của dược liệu này [32].

Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất nhóm hợp chất flavonoid từ hạt cần tây làm cơ sở để phát triển các dạng bào chế từ dược liệu này là cần thiết. Tại Việt Nam, cao cần tây chiết xuất theo quy trình của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự có tác dụng hạ acid uric, chống viêm và giảm đau in vivo [3], [26]. Tuy nhiên, quy trình chiết xuất trong nghiên cứu trên vẫn còn một số nhược điểm. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất chưa được khảo sát để đưa ra điều kiện chiết xuất tối ưu.

Do đó, để tiếp tục hoàn thiện quy trình, đề tài luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ hạt cây cần tây (Apium graveolens L.)” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và điều kiện thích hợp đến quá trình chiết xuất cao đặc chứa flavonoid từ hạt cần tây. Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao hạt cần tây. Tổng quan về cây cần tây và hạt cần tây 1.

Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L. Tên Việt Nam: Cần tây Tên tiếng Anh: Celery Tên khoa học: Apium graveolens L. Đặc điểm thực vật Cây thảo, có mùi thơm, sống 1-2 năm, thân mọc đứng, có rãnh dọc, phân nhánh, cao khoảng 15 - 150 cm. Lá thuôn dài hoặc hình trứng, dài 7 - 18 cm, rộng 3,5 - 8 cm, xẻ 3 thùy hình tam giác.

Thùy cuối có răng cưa hoặc khía, dài 1,2 - 2,5 cm, rộng 0,8 - 2,5 cm. Lá phía trên có cuống ngắn, phiến hình tam giác, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối hình trứng. Lá ở gốc có cuống, bẹ to rộng, hình tam giác, xẻ 3 - 5 thùy hình tam giác, đầu tù, mép khía răng to, không lông. Cụm hoa dạng tán, rộng 1,5 - 4,0 cm, mọc đối diện với lá, gồm nhiều tán dài, ngắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có kích thước 4 - 15 mm.

Tán kép mang 8 - 12 tán, tán hoa có 7 - 25 hoa, kích thước 6 - 9 mm theo chiều ngang. Hoa phía ngoài có 3-8 (-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0,5 - 2,5cm, cuống dài 1 - 1,5 mm. Mùa ra hoa và quả vào tháng 4 - 6 [54]. Phân bố Cây có nguồn gốc ở khu vực bờ biển Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, được trồng rộng rãi ở các nước phương Tây.

Tại Việt Nam, cần tây được di thực, trồng ở nhiều nơi làm rau ăn [2]. Thành phần hóa học Hạt cần tây có chứa flavonoid, tinh dầu, saponin, coumarin, tanin, đường khử, lipid, caroten. Trong đó, thành phần hóa học chính là các hợp chất flavonoid, tinh dầu và coumarin [4], [33]. Flavonoid Flavonoid là một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất trong hạt cần tây [43].

Theo các tài liệu thu thập được, cho đến nay đã phát hiện được 19 hợp chất flavonoid trong hạt cần tây với khung cấu trúc được thể hiện ở hình 1. Trong đó, hai thành phần chính là apigenin và apiin [46], [79], [80]. Khung cấu trúc của flavonoid trong hạt cần tây Các hợp chất flavonoid trong hạt cần tây được trình bày tóm tắt ở bảng 1. Các hợp chất flavonoid trong hạt cần tây TT Tên hợp chất R1 R2 R3 TLTK [46],[62], 1 Apigenin H H H [80] [46],[62], 2 Apiin H H [80] 3 Apigenin-7-O- [2′′-O-(5′′′-O- 3 feruloyl)-β-d- H H [80] apiofuranosyl]-β- d-glucopyranosid 4 6''-Malonylapiin H H [46] Apigenin 7-O- 5 malonylapiosyl- H H [46] glucosid Chrysoerinol-7- O-apiosyl 6 H OCH3 [46] glucosid (Graveobiosid B) Chrysoerinol-7- 7 H OCH3 [46] O-glucosid Chrysoeriol-7-O- [2′′-O-(5′′′-O- 8 feruloyl)-β-D- H OCH3 [80] apiofuranosyl]-β- d-glucopyranosid 4 Chrysoeriol 7-O- 9 6′′-malonyl H OCH3 [46] apiosylglucosid Chrysoeriol 7-O- 10 6′′-malonyl H OCH3 [46] glucosid Chrysoeriol 7-O- 11 malonylapiosyl- H OCH3 [46] glucosid 12 Luteolin H H OH [67], [79] Luteolin-3-methyl 13 ether-7-apiosyl OCH3 OH [46] glycosid Luteolin-7-O- 14 apiosyl glucosid H OH [46] (Graveobiosid A) Luteolin-7-O- 15 H OH [46] glucosid 5 Luteolin 7-O-6′′- 16 malonyl- H OH [46] apiosylglucosid Luteolin 7-O-6′′- 17 H OH [46] malonyl glucosid Luteolin 7-O- 18 malonylapiosyl- H OH [46] glucosid 19 Kaempferol H OH H [79], [80] Nhận xét: Các flavonoid trong hạt cần tây đều có cấu trúc flavon.

Trong đó, chủ yếu là các dẫn xuất glycosid của apigenin, luteolin và chrysoerinol. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng flavonoid trong hạt cần tây, đặc biệt là apigenin và apiin có các tác dụng dược lý liên quan đến bệnh gút như hạ acid uric, ức chế xanthin oxidase, giảm đau và chống viêm [35], [45], [53]. Tinh dầu Bằng phương pháp cất kéo hơi nước, đã xác định được hàm lượng tinh dầu của hạt cần tây là 2,52%. Phân tích tinh dầu hạt cần tây bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS), kết quả xác định được 28 thành phần với thành phần chính là β-selinen (48,22%) [27], [33], limonen (24,32%) [14], [27], [33].

Căn cứ vào cấu trúc, các thành phần trong tinh dầu hạt cần tây gồm 3 nhóm: dẫn xuất phthalid, terpen và các chất có cấu trúc khác. Trong đó, đáng chú ý là các hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất phthalid như 3-n-butyl phthalid [16], sedanolid [58], sedanenolid [72]. Coumarin Theo các tài liệu đã công bố, cho đến nay, 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát hiện trong hạt cần tây [10], [11], [15]. Một số hợp chất điển hình như: umbelliferon [52], psoralen [10], [20], bergapten [20], [81], xanthotoxin [20], [81] và isopimpinellin [17].

Lipid Hạt cần tây chứa một lượng lớn lipid, do đó, trong quá trình chiết xuất có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết. Ngoài ra, lipid cũng có thể gây ra một số vấn đề trong quá trình xay nghiền như hiện tượng quá nhiệt làm ảnh hưởng đến quá trình vận hành của thiết bị hay làm phân hủy hoạt chất [70]. Hàm lượng lipid trong hạt cần tây dao động trong khoảng 15,0% - 25,4%, trong đó chủ yếu là triester của acid petroselinic (38,7%) và các acid béo không no khác như acid oleic, acid linoleic…[60], [70]. Tác dụng sinh học 1.

Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase Cao ethanol chiết từ hạt cần tây cả 3 liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg, uống liên tục trong 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh trên chuột nhắt so với lô chứng lần lượt là 59,3%; 52,6% và 43,8%. Mặt khác, cao cần tây liều 250 mg/kg, 500 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm tương ứng 12,1% và 10,5% [26]. Một nghiên cứu khác được tiến hành trên chuột, sử dụng dịch chiết hạt cần tây với ethanol 95% sau khi tinh chế bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetat, cloroform.) và sắc kí cột. Kết quả, sau 7 ngày sử dụng dịch chiết trên với mức liều 3,3g/kg trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, nồng độ acid uric trong máu của lô thử giảm 42,7% so với lô chứng [37].

Trên mô hình tương tự song thay đổi quy trình chiết xuất, sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi ethanol 80% (1 giờ/lần x 3 lần), nồng độ acid uric lô thử giảm 17,74% so với lô chứng (p < 0,05) sau 6 tuần uống dịch chiết cần tây với mức liều 2,25 g/kg [31]. 7 Dịch chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ hạt cần tây đã được đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro. Kết quả cho thấy phân đoạn cloroform và phân đoạn ethyl acetat từ hạt cần tây đều thể hiện tác dụng ức chế XO in vitro một cách rõ rệt ở cả 3 nồng độ thí nghiệm 10 µg/ml, 50 µg/ml và 100 µg/ml. Dịch chiết ethanol toàn phần hạt cần tây chỉ thể hiện tác dụng ức chế XO ở 2 nồng độ cao là 50 µg/ml và 100 µg/ml [5].

Tác dụng chống viêm Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột so với lô chứng tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm (p < 0,05). Tỷ lệ ức chế phù của lô thử so với lô chứng lần lượt là 37,6% và 60,6% [3]. Trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu chứng viêm so với lô chứng tại thời điểm 4 và 5 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01 và p < 0,05). Cao cần tây liều 500 mg/kg uống liên tục trong 5 ngày làm giảm triệu chứng viêm so với lô chứng tại cả ba thời điểm 4; 5 và 6 giờ sau khi gây viêm (p < 0,01 và p < 0,05 [3].

Tác dụng giảm đau Trên mô hình Randall-Selitto, cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg và 500 mg/kg có tác dụng tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột so với lô chứng tại các thời điểm 1 giờ và 2 giờ sau khi tiêm carrageenan (p < 0,05) [3]. Trên mô hình tương tự song sử dụng dịch chiết ethanol của hạt cần tây đã được tinh chế bằng CO2 siêu tới hạn cho kết quả: dịch chiết sử dụng với mức liều 70mg/kg có tác dụng tương đương với ibuprofen liều 200mg/kg thể trọng chuột. Trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic (phương pháp Koster), cao ethanol chiết từ hạt cần tây liều 250 mg/kg làm giảm số cơn quặn đau của chuột nhắt trắng so với lô chứng trong khoảng thời gian từ phút thứ 10 đến 15 (p < 0,01); từ phút 15 đến 20 (p < 0,05); từ phút 20 đến 25 (p < 0,01) [3]. Nasri, dịch chiết ethanol từ hạt cần tây thể hiện tác dụng giảm đau thông qua cơ chế tương tác với receptor NMDA và tác động vào quá trình sản sinh NO [63].