Quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần của người

Quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần là một quá trình quan trọng trong chức năng thận. 117 trang · University of North Dakota · 2015.

• Tác giả: Andrea Marie Nore
• Người hướng dẫn: Dr. Don Sens
• Trường học: University of North Dakota
• Chuyên ngành: Biochemistry and Molecular Biology
• Đề tài: Quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần của người
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Grand Forks

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LIST OF FIGURES
• 1.2. LIST OF TABLES
• 1.3. ACKNOWLEDGMENTS
• 1.4. ABSTRACT
• 1.5. CHAPTER I: INTRODUCTION
• 1.5.1. Significance
• 1.5.2. Hypothesis and Rationale

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần

Quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần là một quá trình quan trọng trong chức năng thận. Nó liên quan đến việc di chuyển các chất dinh dưỡng và ion qua màng tế bào thận. Sự hiểu biết về quy trình này giúp cải thiện các phương pháp điều trị bệnh thận.

1.1. Khái niệm về vận chuyển chủ động trong thận

Vận chuyển chủ động là quá trình tiêu tốn năng lượng để di chuyển các chất qua màng tế bào. Trong ống thận gần, quá trình này giúp duy trì cân bằng ion và chất dinh dưỡng.

1.2. Vai trò của ống thận gần trong hệ thống tiết niệu

Ống thận gần đóng vai trò quan trọng trong việc tái hấp thu nước và các chất dinh dưỡng. Điều này giúp duy trì huyết áp và cân bằng điện giải trong cơ thể.

II. Vấn đề và thách thức trong quy định vận chuyển chủ động

Mặc dù quy định vận chuyển chủ động rất quan trọng, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và điều trị các bệnh liên quan đến thận. Các yếu tố như độc tố và bệnh lý có thể ảnh hưởng đến quá trình này.

2.1. Tác động của độc tố đến chức năng thận

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các độc tố như cadmium có thể gây tổn thương cho tế bào thận, làm giảm khả năng vận chuyển chủ động.

2.2. Các bệnh lý ảnh hưởng đến vận chuyển chủ động

Các bệnh như bệnh thận mạn tính có thể làm suy giảm chức năng vận chuyển chủ động, dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe.

III. Phương pháp nghiên cứu quy định vận chuyển chủ động

Để hiểu rõ hơn về quy định vận chuyển chủ động, nhiều phương pháp nghiên cứu đã được áp dụng. Các nghiên cứu này giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này.

3.1. Phân tích tế bào thận trong môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu tế bào thận trong môi trường nuôi cấy giúp xác định vai trò của các yếu tố bên ngoài trong quy trình vận chuyển chủ động.

3.2. Sử dụng mô hình động vật để nghiên cứu

Mô hình động vật cung cấp cái nhìn sâu sắc về cách thức vận chuyển chủ động hoạt động trong cơ thể sống và ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy định vận chuyển chủ động

Nghiên cứu về quy định vận chuyển chủ động không chỉ có giá trị lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Điều này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh thận.

4.1. Phát triển thuốc điều trị bệnh thận

Hiểu biết về quy trình vận chuyển chủ động có thể dẫn đến việc phát triển các loại thuốc mới giúp cải thiện chức năng thận.

4.2. Tăng cường phương pháp chẩn đoán

Nghiên cứu này cũng có thể giúp cải thiện các phương pháp chẩn đoán bệnh thận, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu quy định vận chuyển chủ động

Nghiên cứu về quy định vận chuyển chủ động trong ống thận gần vẫn đang tiếp tục phát triển. Những hiểu biết mới có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh thận.

5.1. Tương lai của nghiên cứu thận

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tìm hiểu sâu hơn về các cơ chế vận chuyển và cách cải thiện chức năng thận.

5.2. Tích hợp công nghệ mới vào nghiên cứu

Sự phát triển của công nghệ sinh học có thể giúp nâng cao khả năng nghiên cứu và điều trị các bệnh thận hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ "Regulation Of Vectorial Active Transport In Human Proximal Tubule Cells By MT-3: The Role Of The C-Terminal Domain On E-And N-Cadherin Expression And The Confirmation Of Protein-Protein Interactions" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Andrea Marie Nore, bảo vệ tại Khoa Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Trường Y khoa và Khoa học Sức khỏe thuộc Đại học North Dakota (University of North Dakota), Hoa Kỳ vào tháng 12 năm 2015.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Tỷ lệ mắc bệnh thận mạn tính (Chronic Kidney Disease - CKD) đang gia tăng nhanh chóng tại các nước công nghiệp phát triển, biểu hiện lâm sàng qua các triệu chứng như protein niệu (albuminuria), suy giảm độ thanh thải creatinin, biến đổi hình thái cầu thận và thoái hóa biểu mô ống thận. Về mặt bệnh học mô, xơ hóa mô kẽ ống thận (tubulo-interstitial fibrosis) được xác định là dấu hiệu cốt lõi quyết định sự tiến triển của bệnh thận mạn. Tiếp xúc mạn tính với kim loại nặng cadmium (Cd) từ ô nhiễm môi trường và khói thuốc là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tổn thương hoại tử và tích tụ độc tính tại ống lượn gần.

Trong các nghiên cứu cơ chế bệnh sinh xơ hóa thận, dòng tế bào biểu mô ống lượn gần bất tử hóa HK-2 (Human Kidney-2) được sử dụng rộng rãi làm mô hình thực nghiệm chuyển tiếp biểu mô - trung mô (Epithelial-Mesenchymal Transition - EMT). Tuy nhiên, tồn tại một khoảng trống thực nghiệm lớn: đa số các công bố quốc tế nuôi cấy HK-2 trong môi trường chứa huyết thanh thai bò (Fetal Calf Serum), trái với khuyến cáo ban đầu từ nhóm phân lập dòng tế bào và hướng dẫn của ATCC (sử dụng môi trường không huyết thanh KSFM bổ sung EGF và chiết xuất tuyến yên bò). Điều này đặt ra nghi vấn về việc liệu môi trường có huyết thanh tự thân nó đã kích thích quá trình EMT hay chưa. Đồng thời, bản thân dòng tế bào bất tử hóa HK-2 khi đối chiếu với tế bào biểu mô ống lượn gần nguyên phát ở người (Human Proximal Tubule - HPT) đã bị mất hoàn toàn chức năng vận chuyển tích cực định hướng (vectorial active transport), không tạo được cấu trúc vòm (dome formation) và mất điện trở xuyên biểu mô (transepithelial resistance - TER). Nghiên cứu sinh hóa trước đó phát hiện sự tái biểu hiện của Metallothionein-3 (MT-3) giúp tế bào HK-2 chuyển tiếp ngược từ trung mô về biểu mô (Mesenchymal-Epithelial Transition - MET), song miền chức năng cấu trúc cụ thể của MT-3 và mạng lưới protein tương tác trực tiếp nhằm tái thiết lập cực tính tế bào vẫn chưa được xác định.

Giả thuyết và mục tiêu nghiên cứu

Luận án kiểm tra hai giả thuyết khoa học chính:

1. Quá trình chuyển tiếp biểu mô - trung mô (EMT) xảy ra ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô ống lượn gần, và việc nuôi cấy tế bào trong điều kiện có huyết thanh sẽ thúc đẩy tế bào thu nhận kiểu hình trung mô.
2. Đoạn chèn hexapeptide ở miền đầu C (C-terminal domain) của protein Metallothionein-3 (MT-3) là yếu tố bắt buộc để điều hòa chức năng vận chuyển ion tích cực định hướng thông qua tương tác với các protein tham gia vào tổ chức bộ khung tế bào (cytoskeleton).

Mục tiêu nghiên cứu bao gồm:

1. Đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy (có huyết thanh so với không có huyết thanh) đối với các chỉ dấu EMT kinh điển (E-cadherin và N-cadherin) ở dòng HK-2.
2. Định lượng và đối chiếu mức độ biểu hiện mRNA và protein của E-cadherin, N-cadherin và Connexin 32 giữa dòng tế bào chuyển gen HK-2 và dòng tế bào nguyên phát HPT, cũng như xác nhận sự phân bố của các cadherin này trên mô ống thận người.
3. Xác định epitope chức năng trên chuỗi polypeptide của MT-3 chịu trách nhiệm kích nạp quá trình MET ở tế bào HK-2 thông qua kỹ thuật gây đột biến định hướng điểm (site-directed mutagenesis).
4. Phân lập và xác nhận các protein nội bào tương tác trực tiếp với MT-3 nhằm duy trì kiểu hình biểu mô và tổ chức bộ khung tế bào biểu mô ống lượn gần.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng sinh học:
  • Mô thận người bình thường lấy từ 3 bệnh phẩm lưu trữ khối parafin (archival paraffin blocks) sau phẫu thuật cắt bỏ ung thư biểu mô tế bào thận (Renal Cell Carcinoma), được thẩm định không chứa tế bào u bởi bác sĩ giải phẫu bệnh.
  • Dòng tế bào biểu mô ống lượn gần bất tử hóa ở người HK-2 (phân lập bằng chuyển nhiễm gen E6/E7 của HPV16).
  • Tế bào biểu mô ống lượn gần nguyên phát ở người (HPT).
  • Protein Metallothionein-3 (MT-3), Metallothionein-1E (MT-1E), các thể đột biến dung hợp gắn thẻ V5, cùng các phân tử liên kết tế bào: E-cadherin, N-cadherin, Connexin 32.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu in vitro và ex vivo thực hiện tại Đại học North Dakota, hoàn thành và bảo vệ năm 2015.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu kinh điển và hiện đại về bệnh học thận, chuyển tiếp biểu mô và họ protein metallothionein:

Các hướng nghiên cứu nền tảng

1. Cơ chế bệnh sinh xơ hóa thận và nguồn gốc myofibroblast: Các nghiên cứu bệnh học lâm sàng của Bohle và cộng sự (1996), Fine, Ong và Norman (1993), Eddy và Neilson (2006), Zeisberg và Neilson (2010) xác định xơ hóa mô kẽ ống thận là thước đo quyết định suy giảm chức năng thận. Nghiên cứu theo dõi dòng tế bào (fate tracing) của Lin và cộng sự (2008), Picard và cộng sự (2008), Humphreys và Lin (2010) chứng minh tế bào quanh mạch (pericytes) và nguyên bào sợi tại chỗ mới là nguồn sản sinh trực tiếp myofibroblast, trong khi tế bào biểu mô ống thận trải qua EMT đóng vai trò gián tiếp thông qua tái cấu trúc vi môi trường mô kẽ và truyền tín hiệu tiền xơ hóa (Alpers & Hudkins, 1994; Fine, Norman, & Ong, 1995; Coca, Yusuf, & Shlipak, 2009; Venkatachalam & Griffin, 2010).
2. Đặc tính dòng tế bào HK-2 và sự thiếu nhất quán trong nuôi cấy: Dòng HK-2 được Ryan, Johnson và Kirk (1994) phân lập và duy trì trên môi trường không huyết thanh (KSFM), bảo lưu các hoạt tính enzyme ống lượn gần (alkaline phosphatase, gamma glutamyltranspeptidase, leucine aminopeptidase) và vận chuyển glucose phụ thuộc Na⁺ nhạy cảm phlorizin. Tuy nhiên, hàng loạt nghiên cứu thực nghiệm sau đó (Bai et al., 2012; Berzal et al., 2012; W. Ding et al., 2012; Eneling et al., 2012; Guillén-Gómez, 2012; Q. Li et al., 2011; Y. Li et al., 2011; Lin et al., 2011; Masola et al., 2012; Veerasamy & Nguyen, 2009) lại nuôi cấy HK-2 trong môi trường chứa huyết thanh, đối lập với các nhóm sử dụng môi trường không huyết thanh chuẩn (Dudas et al., 2009, 2011; Grabias & Konstantopoulos, 2012; Sarközi et al., 2012; Yuan et al., 2012).
3. Độc tính ống thận của Cadmium: Cadmium xâm nhập ống lượn gần qua trung gian thụ thể megalin (nội bào hóa phức hợp Cd-MT do gan tiết ra) hoặc chất vận chuyển kim loại hóa trị hai DMT1 (SLC11A2), ZIP8 (SLC39A8) và ZIP14 (SLC39A14) (Bridges & Zalups, 2005; Vesey, 2010; Sabolić et al., 2010; Tang et al., 1998). Tích tụ cadmium đạt ngưỡng 150-200 µg/g mô vỏ thận gây ức chế phức hợp III chuỗi truyền điện tử ty thể, phá vỡ liên kết bám E-cadherin thông qua bắt chước phân tử canxi và biến đổi phân bố claudin-2, claudin-5 (Gobe & Crane, 2010; Prozialeck et al., 2000, 2003, 2004).
4. Cấu trúc và chức năng của Metallothionein-3 (MT-3): MT-3 được Uchida và cộng sự (1991) phát hiện đầu tiên ở hệ thần kinh trung ương dưới tên gọi yếu tố ức chế tăng trưởng (Growth Inhibitory Factor - GIF). Khác với các đồng dạng cảm ứng phổ quát MT-1 và MT-2, MT-3 có biểu hiện đặc hiệu mô, hiện diện ở biểu mô vỏ thận người (Garrett, Sens et al., 1999) và một số loại ung thư (Satarug et al., 2010; Sens et al., 2000; Zhou et al., 2002). Cấu trúc MT-3 gồm 68 axit amin, chứa một gốc Threonine chèn ở đầu N, gốc Proline tạo nếp gấp ở miền β (vị trí Pro7 và Pro9 chịu trách nhiệm cho hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào; Sewell et al., 1995; Romero-Isart et al., 2002) và một đoạn chèn gồm 6 axit amin mang tính axit ở miền C (EAEAAE). Nghiên cứu trước của phòng thí nghiệm (Kim et al., 2002; Bathula et al., 2008) phát hiện việc chuyển gen MT-3 vào tế bào HK-2 giúp tái lập khả năng tạo vòm, tăng trở kháng TER và chuyển dịch biểu hiện cadherin.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết: (1) Xác định định lượng sự thay đổi biểu hiện E-cadherin và N-cadherin dưới tác động của huyết thanh ở tế bào HK-2; (2) Chứng minh vị trí phân bố thực tế của E- và N-cadherin trên ống thận người in vivo bằng kỹ thuật vi phẫu bóc tách laser; (3) Phân lập chính xác motif axit amin trên miền C của MT-3 chịu trách nhiệm kích hoạt quá trình MET; và (4) Xác thực các đối tác tương tác protein-protein của MT-3 trong tế bào thận (vốn trước đây chỉ được mô tả trong hệ thần kinh trung ương).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Phức hợp liên kết và phân cực biểu mô: Biểu mô ống lượn gần duy trì chức năng tái hấp thu nhờ sự phân cực đỉnh - đáy bên (apical-basolateral polarity). Các liên kết bên gồm: liên kết vòng bịt (tight junction: occludin, claudin-2/5), liên kết bám (adherens junction: E-cadherin liên kết với actin thông qua α-catenin, β-catenin và α-actinin), thể liên kết (desmosome) và liên kết khe (gap junction: connexin 32).
• Cơ chế chuyển tiếp EMT/MET: Sự phân rã liên kết vòng bịt và liên kết bám làm giải phóng β-catenin vào bào tương; β-catenin thoát khỏi quá trình phosphoryl hóa bởi GSK3β để chuyển vị vào nhân, liên kết với phức hợp TCF/LEF nhằm hoạt hóa các yếu tố phiên mã Snail 1/2, Zeb 1/2, Twist-1, qua đó ức chế biểu hiện E-cadherin và hoạt hóa N-cadherin, vimentin, α-SMA. MET là quá trình tái lập lại kiểu hình biểu mô phân cực.
• Tương tác kim loại và cấu trúc Metallothionein: MT liên kết 7 ion kim loại hóa trị hai thông qua 20 gốc cystein phân bố ở hai miền: miền β ở đầu N (liên kết 3 ion) và miền α ở đầu C (liên kết 4 ion).

Nhóm thông số / Kháng thể	Nguồn gốc / Động vật	Mã sản phẩm / Nhà sản xuất	Độ pha loãng Western Blot	Trọng lượng phân tử (kDa)
β-actin	Chuột đơn dòng	Abcam (Ab8226)	1:1000	42
Gelsolin	Chuột đơn dòng	Abcam (Ab11081)	1:500 - 1:1000	86
Tropomyosin III	Chuột đơn dòng	Santa-Cruz (Sc12059)	1:1000	29 - 32
Myosin IIa	Dê đa dòng	Abcam (Ab55456)	1:500	215
α-enolase (Enolase-1)	Thỏ đa dòng	Abcam (Ab56795)	1:3000	47 - 51
α-aldolase (Aldolase A)	Dê đa dòng	Santa-Cruz (Sc12059)	1:500	40
Thẻ V5	Chuột đơn dòng	Invitrogen (Ab9116)	1:5000	10 - 12
E-cadherin	Thỏ đa dòng	Santa-Cruz (Sc 120)	1:500	120
N-cadherin	Chuột đơn dòng	Life Technologies (333900)	1:1000	100
Connexin 32	Thỏ đa dòng	Life Technologies (32)	1:1000	32

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Hóa mô miễn dịch (IHC): Thực hiện trên các lát cắt dày 5 µm từ 3 mẫu thận người lưu trữ, cố định trong formalin trung tính 10% trong 16-18 giờ. Bộc lộ kháng nguyên bằng Dako Target Retrieval Solution (S1699), ủ với kháng thể kháng E-cadherin (Santa Cruz, 1:100), N-cadherin (Zymed, 1:100), Aquaporin-1 (Abcam, 1:400, dấu ấn ống lượn gần) và Calbindin (Swant, 1:800, dấu ấn ống lượn xa). Phát hiện bằng hệ thống Dako Envision+ Dual Link System (K4061) và chất tạo màu DAB, nhuộm tương phản hematoxylin.
2. Vi phẫu bóc tách tế bào bằng laser (LCM) và RT-qPCR: Sử dụng hệ thống PixCell II™ LCM và màng nhiệt dẻo CapSure™ HS LCM caps để thu thập chính xác các tế bào biểu mô ống lượn gần. Tách chiết RNA bằng bộ kit RNAqueous®-Micro (Life Technologies). Tổng hợp cDNA và chạy real-time PCR bằng hệ thống Bio-Rad iCycler iQ sử dụng hóa chất SYBR Green, chuẩn hóa theo số lượng bản sao 18S rRNA.
3. Nuôi cấy tế bào và đo đạc chức năng biểu mô:
   • Tế bào HPT: nuôi trên bình phủ collagen với môi trường không huyết thanh (DME:Ham's F-12 tỷ lệ 1:1 bổ sung selen 5 ng/ml, insulin 5 µg/ml, transferrin 5 µg/ml, hydrocortisone 36 ng/ml, triiodothyronine 4 pg/ml, EGF 10 ng/ml).
   • Tế bào HK-2: nuôi cấy đối chứng trên môi trường không huyết thanh và các môi trường bổ sung huyết thanh để đánh giá hình thái.
   • Đo điện trở xuyên biểu mô (TER): nuôi tế bào trên màng cellulose ester 24 mm (Corning), đo định kỳ mỗi 2 ngày bằng máy EVOM Epithelial Voltohmmeter trang bị điện cực STX2; theo dõi tạo vòm tế bào trên đĩa 12 giếng.
4. Định lượng Protein bằng ELISA Sandwich: Sử dụng bộ kit ELISA thương mại từ Abnova (E-cadherin #KA0433 và N-cadherin #KA1135), nạp 1-25 µg protein tổng số/giếng, ủ kháng thể biotin hóa (1:100), phức hợp Avidin-Biotin-Peroxidase và cơ chất TMB; đo độ hấp thụ tại bước sóng 450 nm trên máy Biotek, phân tích đường chuẩn bằng mô hình 5 tham số (MasterPlex software).
5. Gây đột biến định hướng điểm và chuyển gen (Transfection):
   • Sử dụng hệ thống Gateway™ cloning vector (pENTR chuyển sang pcDNA6.2/V5-DEST).
   • Thiết kế các cấu trúc đột biến: xóa đoạn C-terminal của MT-3 (MT-3ΔCT, mất đoạn EAEAAE), chèn đoạn C-terminal của MT-3 vào MT-1E (1E-CT), biến đổi đầu N của MT-1E sang dạng MT-3 (1E-NT), đột biến proline thành threonine ở đầu N của MT-3 (MT-3-NT).
   • Chuyển gen ổn định vào tế bào HK-2 bằng Effectene™ (Qiagen) với tỷ lệ plasmid:Effectene 1:10 (2 µg DNA/giếng), chọn lọc bằng blasticidin (3 µg/ml).
   • Chuyển gen biểu hiện tạm thời bằng kỹ thuật xung điện (electroporation, Lonza Nucleofector Solution V, chương trình V), bổ sung kẽm 30 µM sau 6 giờ nuôi cấy để kích thích biểu hiện protein.
6. Đồng miễn dịch tủa (Co-IP): Dùng 1000 µg dịch ly giải tế bào HK-2 chuyển gen MT-3-V5 trong đệm IP lysis (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 5% glycerol), tiền xử lý (pre-clear) với hạt từ Protein A/G và kháng thể IgG thỏ, sau đó ủ qua đêm với 20 µg kháng thể kháng V5 (Abcam Ab9116) ở 4°C. Rửa hạt từ và ly giải phức hợp bằng đệm Laemmli không chứa chất khử ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
7. Phân tích thống kê: Dữ liệu thực nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần (triplicate), biểu diễn dưới dạng sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SE). Phân tích thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism® sử dụng t-test phương sai riêng biệt và phân tích phương sai ANOVA kèm kiểm nghiệm sau Tukey (mức ý nghĩa thống kê $p < 0.05$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Đặt vấn đề, ý nghĩa khoa học và tổng quan lý thuyết

Chương này thiết lập nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và bệnh học thận:

• Phân tích chi tiết vai trò của cực tính tế bào biểu mô và cấu trúc của các liên kết gian bào (tight junctions, adherens junctions, gap junctions) trong việc duy trì vận chuyển tích cực định hướng.
• Trình bày cơ chế phân tử của 3 loại hình chuyển tiếp biểu mô - trung mô (EMT Loại I trong phát triển phôi, Loại II trong lành vết thương/xơ hóa mô, và Loại III trong xâm lấn ung thư).
• Tổng quan độc tính của Cadmium trên ống thận người: con đường nội bào hóa qua trung gian megalin/DMT1, sự tích tụ trong ty thể gây ức chế hô hấp tế bào và cơ chế phá vỡ liên kết bám E-cadherin.
• Phân tích cấu trúc phân tử của gia đình protein Metallothionein (MT-1 đến MT-4), nhấn mạnh các đặc điểm cấu trúc đặc thù của MT-3 (đoạn chèn threonine ở đầu N, hai gốc proline tạo góc gấp ở miền β và đoạn chèn hexapeptide EAEAAE mang tính axit ở miền C).
• Tổng hợp các protein đã biết tương tác với MT-3 trong mô thần kinh và thận (Bảng I-1: Transthyretin, Rab3A, Hsp90, Hsp70, Drp2, Creatine Kinase, β-actin, Exo84, 14-3-3, Enolase-1, Aldolase 1/3, Pyruvate Kinase, Malate Dehydrogenase, Tubulin α3, Gelsolin, Myosin-9, Tropomyosin 3).

Chương II: Phương pháp nghiên cứu và quy trình thực nghiệm

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ các quy trình thao tác chuẩn trong phòng thí nghiệm:

• Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch kép và đơn trên tiêu bản mô thận người cố định formalin.
• Kỹ thuật vi phẫu bóc tách laser (LCM) thu hồi tế bào biểu mô ống lượn gần và quy trình ly giải, tinh sạch micro-RNA để thực hiện real-time RT-qPCR định lượng bản sao E-cadherin và N-cadherin.
• Quy trình nuôi cấy dòng HPT và dòng HK-2 trong các điều kiện môi trường có và không có huyết thanh; quy trình đo trở kháng điện thế biểu mô (TER) và đếm cấu trúc vòm tế bào.
• Kỹ thuật định lượng protein màng E- và N-cadherin bằng phương pháp sandwich ELISA.
• Chiến lược thiết kế mồi, đột biến gen định hướng điểm bằng Gateway recombination, chuyển nhiễm plasmid vào tế bào biểu mô bằng Effectene và xung điện Nucleofector.
• Quy trình đồng miễn dịch tủa (Co-IP) sử dụng hạt từ tính Protein A/G kết hợp kháng thể nhận diện thẻ dung hợp V5 nhằm bảo tồn các phức hợp protein không bền.

Chương III: Kết quả thực nghiệm

Chương này trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm cốt lõi của luận án:

1. Biểu hiện của E-cadherin và N-cadherin trong ống lượn gần thận người

• Phân tích hóa mô miễn dịch (IHC) trên 3 mẫu mô thận độc lập chứng minh các ống lượn gần biểu hiện E-cadherin ở mức độ vừa phải (moderate), tập trung chủ yếu ở bờ lòng ống (luminal/apical border) (Hình III-1 A, B, D, E, G, H).
• Ngược lại, các ống lượn xa biểu hiện E-cadherin rất mạnh (strong) bao quanh toàn bộ màng tế bào biểu mô.
• Biểu hiện N-cadherin ở ống lượn gần có cường độ vừa phải và định vị đặc hiệu ở phía màng đáy bên (basolateral side) (Hình III-1 C, F, I). Các ống lượn xa và cầu thận hoàn toàn âm tính với N-cadherin.
• Kỹ thuật LCM kết hợp RT-qPCR xác nhận sự hiện diện đồng thời của cả bản sao mRNA E-cadherin và N-cadherin trong các tế bào ống lượn gần được bóc tách vi thể.

2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên tế bào HK-2

• Khảo sát sự thay đổi hình thái và mức độ biểu hiện protein cadherin khi nuôi tế bào HK-2 trong môi trường có huyết thanh so với môi trường chuẩn không huyết thanh. Kết quả chỉ ra rằng môi trường chứa huyết thanh thúc đẩy tế bào HK-2 biểu hiện các đặc điểm phân tử rõ rệt hơn của quá trình EMT.

3. So sánh tế bào HK-2 và tế bào nguyên phát HPT

• Định lượng bằng ELISA và Western blot cho thấy dòng HK-2 biểu hiện mức protein E-cadherin thấp hơn đáng kể và mức N-cadherin cao hơn so với tế bào HPT nguyên phát.
• Tế bào HK-2 nuôi trên màng lọc Transwell không tạo được điện trở biểu mô (TER ~ 0 $\Omega \cdot \text{cm}^2$) và không có khả năng hình thành cấu trúc vòm, chứng minh sự mất toàn bộ chức năng vận chuyển tích cực định hướng và suy giảm liên kết khe Connexin 32.

4. Vai trò của miền C-terminal của MT-3 trong quá trình kích nạp MET

• Chuyển gen MT-3 kiểu dại (wild type) vào tế bào HK-2 giúp khôi phục khả năng tạo vòm, tăng TER, tăng cường biểu hiện E-cadherin và Connexin 32, đồng thời giảm N-cadherin.
• Thể đột biến mất đoạn 6 axit amin ở đầu C (MT-3ΔCT, mất đoạn EAEAAE) mất hoàn toàn khả năng khôi phục tạo vòm và không thể tái tạo điện trở biểu mô TER.
• Thể đột biến chèn đoạn hexapeptide của MT-3 vào khung của MT-1E (1E-CT) có khả năng tái lập một phần chức năng tạo vòm và cảm ứng kiểu hình MET.
• Đột biến ở miền đầu N (MT-3-NT) không làm mất chức năng cảm ứng MET của MT-3, khẳng định motif EAEAAE ở miền C là epitope chức năng chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính này.

5. Ảnh hưởng của việc cưỡng bức biểu hiện quá mức E-cadherin

• Chuyển gen biểu hiện trực tiếp E-cadherin vào tế bào HK-2 chỉ làm tăng mức E-cadherin đơn thuần nhưng không đủ để khôi phục quá trình tạo vòm hay tái lập chức năng vận chuyển tích cực định hướng nếu thiếu MT-3.

6. Xác nhận tương tác protein-protein của MT-3 bằng Co-IP

• Thí nghiệm pulldown bằng $\text{Zn}_7\text{MT-3}$ và đồng miễn dịch tủa (Co-IP) sử dụng kháng thể kháng V5 trên dịch ly giải tế bào HK-2 chuyển gen khẳng định MT-3 tương tác vật lý trực tiếp với các protein nội bào: Myosin IIa (Myosin-9, 215 kDa), β-actin (42 kDa), Tropomyosin 3 (29-32 kDa), α-enolase (Enolase-1, 47-51 kDa), Aldolase A (40 kDa) và Gelsolin (86 kDa).

Chương IV: Thảo luận kết quả và cơ chế tác động

• HK-2 là mô hình đã trải qua các giai đoạn sớm của EMT: Mất vận chuyển tích cực, mất TER, giảm Connexin 32 và đảo chiều tỷ lệ E-cadherin/N-cadherin ở HK-2 phản ánh trạng thái tiền trung mô do quá trình bất tử hóa bằng HPV16 E6/E7 tạo ra.
• Cơ chế kích nạp MET của MT-3: MT-3 không chỉ hoạt động như protein bắt giữ kim loại mà còn đóng vai trò như một phân tử giàn giáo (scaffolding molecule). Đoạn chèn EAEAAE ở đầu C mang điện tích âm, tạo điều kiện thuận lợi để tương tác với các protein vận động và cấu trúc tế bào (Myosin IIa, β-actin, Tropomyosin 3), qua đó tái tổ chức hệ thống vi sợi actin và tái định vị các phức hợp liên kết bám/vòng bịt lên màng tế bào.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận khoa học

1. Xác lập bằng chứng mô học và sinh học phân tử khẳng định biểu mô ống lượn gần thận người bình thường in vivo biểu hiện đồng thời cả E-cadherin (tại bờ đỉnh/lòng ống) và N-cadherin (tại bờ đáy bên), bác bỏ quan điểm đơn thuần cho rằng ống lượn gần chỉ biểu hiện duy nhất một loại cadherin.
2. Chứng minh dòng tế bào bất tử hóa HK-2 bản chất đã mang sẵn các đặc tính phân tử và chức năng của giai đoạn sớm trong quá trình chuyển tiếp biểu mô - trung mô (EMT), do đó các nghiên cứu sử dụng HK-2 để khảo sát giai đoạn khởi đầu của EMT cần được đánh giá lại một cách cẩn trọng.
3. Lần đầu tiên xác định đoạn chèn hexapeptide EAEAAE gồm 6 axit amin ở miền đầu C của Metallothionein-3 là motif cấu trúc thiết yếu điều hòa quá trình chuyển tiếp trung mô - biểu mô (MET) và tái lập vận chuyển tích cực định hướng ở tế bào biểu mô thận.
4. Mở rộng mạng lưới tương tác protein của MT-3 ngoài phạm vi hệ thần kinh trung ương, chứng minh tương tác trực tiếp của MT-3 với các protein khung xương và enzyme chuyển hóa trong tế bào thận: Myosin IIa, β-actin, Tropomyosin-3, Enolase-1, Aldolase A và Gelsolin.

Đóng góp thực tiễn và khuyến nghị phương pháp

1. Quy chuẩn điều kiện nuôi cấy HK-2: Khuyến nghị các nghiên cứu mô hình hóa bệnh học xơ hóa thận phải sử dụng môi trường không huyết thanh (serum-free KSFM) theo đúng chuẩn phân lập để tránh hiện tượng huyết thanh tự kích nạp kiểu hình trung mô gây sai lệch kết quả.
2. Ứng dụng mô hình HK-2 chuyển gen MT-3: Đề xuất sử dụng tế bào HK-2 chuyển gen biểu hiện MT-3 như một hệ thống mô hình in vitro chuẩn để sàng lọc các hợp chất có khả năng kích hoạt quá trình MET, phục vụ nghiên cứu trị liệu đảo ngược xơ hóa mô kẽ thận trong bệnh thận mạn tính.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận trong luận án

• Các thí nghiệm định lượng tương tác protein-protein được thực hiện chủ yếu trong điều kiện in vitro thông qua đồng miễn dịch tủa (Co-IP) và Western blot trên dòng tế bào nuôi cấy, chưa đánh giá động học liên kết trực tiếp trên động vật sống.
• Các mẫu mô thận người được thu thập từ các khối parafin lưu trữ sau phẫu thuật ung thư biểu mô tế bào thận (dù đã được chọn lọc vùng mô bình thường bởi bác sĩ giải phẫu bệnh), do đó cỡ mẫu còn giới hạn ở 3 trường hợp.
• Chưa khảo sát chi tiết nồng độ ion kẽm nội bào và trạng thái bão hòa kim loại của MT-3 ảnh hưởng như thế nào đến ái lực liên kết với các protein đối tác trong điều kiện stress oxy hóa hoặc nhiễm độc cadmium mạn tính.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát cấu trúc không gian 3 chiều của phức hợp giữa miền C-terminal của MT-3 với Myosin IIa và β-actin bằng phương pháp tinh thể học tia X hoặc cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
• Nghiên cứu động học của các tương tác protein này dưới các điều kiện bệnh lý thực nghiệm, đặc biệt là khi tế bào biểu mô ống thận tiếp xúc với nồng độ gây độc của Cadmium.
• Đánh giá khả năng chuyển giao của việc kích hoạt biểu hiện MT-3 in vivo trên các mô hình chuột suy thận mạn và xơ hóa thận do nhiễm độc kim loại nặng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và nhà khoa học chuyên ngành Hóa sinh, Sinh học phân tử và Độc chất học: Cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật vi phẫu bóc tách laser (LCM) trên mô parafin, phương pháp thiết kế đột biến gen định hướng điểm bằng hệ thống Gateway, và kỹ thuật đồng miễn dịch tủa tối ưu hóa cho các protein liên kết kim loại kích thước nhỏ.
• Các nhà nghiên cứu bệnh học Thận và Tế bào học: Cung cấp dữ liệu chuẩn mực về sự phân bố của E-cadherin, N-cadherin và Connexin 32 trên ống thận người; là tài liệu tham chiếu quan trọng về việc lựa chọn môi trường nuôi cấy cho dòng tế bào HK-2.
• Phần đáng tham khảo nhất:
  • Chương II (Quy trình chi tiết về LCM, nuôi cấy tế bào HPT sơ cấp không huyết thanh, kỹ thuật đo TER và phương pháp Co-IP).
  • Chương III (Dữ liệu hình ảnh hóa mô miễn dịch đối chiếu E- và N-cadherin, số liệu phân tích chức năng của các cấu trúc đột biến miền C của MT-3).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phân bố của E-cadherin và N-cadherin trong các cấu trúc ống thận người bình thường có đặc điểm gì khác biệt?

Theo kết quả hóa mô miễn dịch tại Chương III (Hình III-1), trong ống lượn gần, E-cadherin biểu hiện ở mức độ vừa phải và tập trung chủ yếu ở bờ đỉnh/lòng ống (luminal/apical border), trong khi N-cadherin cũng biểu hiện ở mức độ vừa phải nhưng định vị đặc hiệu ở màng đáy bên (basolateral side). Ở ống lượn xa, E-cadherin biểu hiện rất mạnh bao quanh toàn bộ chu vi màng tế bào, trong khi N-cadherin hoàn toàn âm tính. Cầu thận hoàn toàn âm tính với N-cadherin và âm tính hoặc biểu hiện rất yếu với E-cadherin.

2. Vì sao dòng tế bào bất tử hóa HK-2 được kết luận là đã trải qua các giai đoạn sớm của EMT?

Khi so sánh trực tiếp với tế bào biểu mô ống lượn gần nguyên phát (HPT) trong cùng điều kiện nuôi cấy không huyết thanh, dòng HK-2 đã mất hoàn toàn khả năng vận chuyển tích cực định hướng (không tạo được cấu trúc vòm/dome), không tạo được điện trở xuyên biểu mô (TER ~ 0 $\Omega \cdot \text{cm}^2$), mất liên kết khe Connexin 32, đồng thời có sự suy giảm mức protein E-cadherin và gia tăng mức biểu hiện N-cadherin. Đây là các dấu hiệu phân tử và chức năng đặc trưng của giai đoạn sớm quá trình EMT.

3. Đột biến nào ở phân tử MT-3 chứng minh vai trò quyết định của miền C-terminal đối với quá trình MET?

Nghiên cứu đã tạo ra cấu trúc đột biến MT-3ΔCT (xóa bỏ đoạn chèn 6 axit amin mang tính axit EAEAAE ở miền đầu C của MT-3). Khi chuyển cấu trúc này vào tế bào HK-2, tế bào mất hoàn toàn khả năng tái lập sự tạo vòm và không tạo được điện trở biểu mô. Ngược lại, khi chèn đoạn EAEAAE này vào protein MT-1E (cấu trúc 1E-CT), phân tử lai thu nhận khả năng tái tạo vòm tế bào. Đột biến thay thế proline ở đầu N (MT-3-NT) không làm mất hoạt tính này, khẳng định motif EAEAAE ở miền C là cấu trúc quyết định kích nạp MET.

4. Bằng chứng thực nghiệm nào xác nhận MT-3 tương tác trực tiếp với các protein bộ khung tế bào?

Thí nghiệm đồng miễn dịch tủa (Co-IP) sử dụng hạt từ Protein A/G gắn kháng thể kháng thẻ V5 trên dịch ly giải tế bào HK-2 chuyển gen MT-3-V5, kết hợp nhuộm Western blot với các kháng thể đơn dòng và đa dòng đặc hiệu (Bảng II-1), đã xác nhận MT-3 tạo phức hợp liên kết vật lý với Myosin IIa (215 kDa), β-actin (42 kDa), Tropomyosin 3 (29-32 kDa), Gelsolin (86 kDa), α-enolase (47-51 kDa) và Aldolase A (40 kDa).

5. Cadmium tích tụ ở nồng độ nào thì bắt đầu gây tổn thương chức năng ống lượn gần?

Theo tổng quan dịch tễ học và độc chất học được trình bày trong Chương I, cadmium là chất độc tích lũy sinh học có thời gian bán thải kéo dài từ 15 đến 30 năm ở người. Tổn thương chức năng ống lượn gần (biểu hiện qua protein niệu, đường niệu, axit amin niệu và phosphaturia) bắt đầu xuất hiện khi nồng độ tích tụ của cadmium đạt ngưỡng 150 - 200 µg cadmium/g mô thận.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Andrea Marie Nore đã làm sáng tỏ cơ chế điều hòa chức năng vận chuyển tích cực định hướng ở tế bào biểu mô ống lượn gần thận người thông qua vai trò của Metallothionein-3 (MT-3). Nghiên cứu khẳng định tế bào ống lượn gần in vivo biểu hiện đồng thời cả E-cadherin và N-cadherin, đồng thời chỉ ra dòng tế bào HK-2 nguyên bản đã mang các đặc điểm phân tử của quá trình EMT sớm. Bằng kỹ thuật đột biến gen định hướng điểm và đồng miễn dịch tủa, tác giả chứng minh đoạn chèn hexapeptide EAEAAE ở miền C-terminal của MT-3 là epitope bắt buộc để kích nạp quá trình chuyển tiếp ngược trung mô - biểu mô (MET) thông qua tương tác vật lý trực tiếp với các protein tổ chức khung tế bào như Myosin IIa, β-actin và Tropomyosin 3. Các phát hiện này cung cấp cơ sở sinh học phân tử quan trọng cho việc chuẩn hóa mô hình thực nghiệm in vitro và mở ra hướng tiếp cận mới trong nghiên cứu cơ chế phục hồi biểu mô thận sau tổn thương xơ hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of North Dakota UND Scholarly Commons Theses and Dissertations Theses, Dissertations, and Senior Projects January 2015 Regulation Of Vectorial Active Transport In Human Proximal Tubule Cells By MT-3: The Role Of The C-Terminal Domain On E-And N- Cadherin Expression And The Confirmation Of Protein-Protein Interactions Andrea Marie Nore Follow this and additional works at: https://commons.edu/theses Recommended Citation Nore, Andrea Marie, "Regulation Of Vectorial Active Transport In Human Proximal Tubule Cells By MT-3: The Role Of The C- Terminal Domain On E-And N-Cadherin Expression And The Confirmation Of Protein-Protein Interactions" (2015). Theses and Dissertations.edu/theses/1938 This Dissertation is brought to you for free and open access by the Theses, Dissertations, and Senior Projects at UND Scholarly Commons. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations by an authorized administrator of UND Scholarly Commons. For more information, please contact zeineb.

REGULATION OF VECTORIAL ACTIVE TRANSPORT IN HUMAN PROXIMAL TUBULE CELLS BY MT-3: THE ROLE OF THE C-TERMINAL DOMAIN ON E-AND N-CADHERIN EXPRESSION AND THE CONFIRMATION OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS by Andrea Marie Nore Bachelor of Science, Minnesota State University Moorhead, 2010 A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of the University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Grand Forks, North Dakota December 2015 Copyright 2015 Andrea Nore ii This dissertation, submitted by Andrea Nore in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy from the University of North Dakota, has been read by the Faculty Advisory Committee under whom the work has been done and is hereby approved. Garrett __________________________________________ Seema Somji __________________________________________ Donald A. Dunlevy This dissertation is being submitted by the appointed advisory committee as having met all of the requirement of the School of Graduate Studies at the University of North Dakota and is hereby approved. __________________________________ Wayne Swisher Dean of the School of Graduate Studies _________________________________ Date iii PERMISSION Title REGULATION OF VECTORIAL ACTIVE TRANSPORT IN HUMAN PROXIMAL TUBULE CELLS BY MT-3: THE ROLE OF THE C- TERMINAL DOMAIN ON E-AND N-CADHERIN EXPRESSION AND THE CONFIRMATION OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS Department Biochemistry and Molecular Biology Degree Doctor of Philosophy In presenting this dissertation in partial fulfillment of the requirements for a graduate degree from the University of North Dakota, I agree that the library of this University shall make it freely available for inspection.

I further agree that permission for extensive copying for scholarly purposes may be granted by the professor who supervised my dissertation work or, in his absence, by the Chairperson of the department or the dean of the School of Graduate Studies. It is understood that any copying or publication or other use of this dissertation or part thereof for financial gain shall not be allowed without my written permission. It is also understood that due recognition shall be given to me and to the University of North Dakota in any scholarly use which may be made of any material in my dissertation. Andrea Nore November 5, 2015 iv TABLE OF CONTENTS LIST OF FIGURES.

vii LIST OF TABLES. 1 Hypothesis and Rationale. 3 Epithelial Cell Adhesion and Polarity. 6 Epithelial-Mesenchymal Transition.

8 Cadmium is Nephrotoxic. 18 Metallothionein-3 Protein-Protein Interactions. 22 Laser-Capture Microdissection. 26 RNA isolation and qRT-PCR.

34 Expression of E- and N-Cadherin in Human Kidney Proximal Tubules. 34 Expression of E- and N-Cadherin in HK-2 Cells as a Function of Growth Medium Composition. 38 Comparison of E- and N-Cadherin Expression in HK-2 and HPT Cell Cultures. 39 Alterations in Tight Monolayer Development.

44 Association of the Unique C-Terminal Domain of MT-3 With MT-3 Induced MET in HK-2 Cells. 46 Effect of Forced E-cadherin Expression on HK-2 Vectorial Active Transport, N-Cadherin Expression, and Cell Morphology. 52 Zn7MT-3 mediated pulldowns in HK-2 lysates. 55 V5-mediated immunoprecipitations in MT-3 expressing HK-2 lysates.

60 HK-2 Cells have Features Associated with the Initial Stages of EMT. 60 HK-2 Cells Undergo MET Mediated by MT-3. 65 MT-3 Interacts with Proteins that Promote an Epithelial Phenotype. 82 vi LIST OF FIGURES Figure Page III-1.

Immunohistochemical staining of E-cadherin and N- Cadherin in the human kidney. Expression of E-and N-cadherin in microdissected proximal tubules. Influence of growth medium on E-and N-cadherin expression in HK-2 cells. Comparison of E-cadherin expression in HPT and HK-2 cell cultures.

Comparison of N-cadherin expression in HPT and HK-2 cell cultures. The pattern of E- and N-cadherin expression is unaltered when cells are grown on transwell inserts. Transepithelial resistance comparison of HPT and HK-2 cell cultures. Connexin 32 expression in HK-2, HPT, and HK-2 cells expressing MT-3.

Mutated metallothionein constructs. Effect of the altered domains of MT-3 on the formation of domes in stably transfected HK-2 cells. Effect of the altered domains of MT-3 on the expression of E-and N-cadherin in stably transfected HK-3 cells. Effect of the altered domains of MT-3 on the expression of connexin 32 in stably transfected HK-3 cells.

The effect of forced overexpression of E-cadherin on the expression of N-cadherin and on dome formation in HK-2 cells. Schematic representation of the methodology used to pulldown MT-3 interacting proteins. MT-3 interacts with β-actin, Tropomyosin 3, enolase-1, and aldolase A. Zinc supplementation 6 hours post transient transfection of V5-tagged MT-3 into HK-2 cells increases MT-3 protein expression.

MT-3 interacts with several proteins in cultured proximal tubule cells. Co-immunoprecipitation of MT-3 protein complexes in HK-2 cells transfected with V5 tagged-MT-3. Immunostaining of MT-3 in Skin Pigment Lesions. Immunostaining of MT-3 in Nevi and Melanoma Cells.

Expression of MT-3 in primary normal human keratinocytes (NHEK), Immortalized Human Keratinocytes (HaCaT), and normal human melanocytes (HEMa-LP). 94 viii LIST OF TABLES Table Page I-1. MT-3 interacting proteins. Primary antibodies used for western blotting.

Transepithelial resistance and dome formation in HK-2 cells overexpressing MT-3 with altered protein domains. Immunostaining of MT-3 in normal skin, SCC, BCC, Nevi, and Melanoma. 89 ix ACKNOWLEDGMENTS First and foremost I would like to thank Dr. Don Sens, Dr.

Van Doze, Dr. Jim Porter and Dr. Joe Provost for recognizing my potential when I was an undergraduate researcher. Their combined support and mentorship has greatly impacted my scientific success and I am forever grateful.

I would like to recognize the many individuals who made this body of work a possibility. Xudong Zhou, Dr. Yun Zhen, and Dr. Mary Ann Sens procured the tissue and aided in all of immunohistochemistry related data.

I would also like to thank Dr. Chandra Bathula for designing the mutant metallothionein constructs, identifying putative protein interactions with the assistance of Dr. John Shabb, and Wallace Muhonen, and finally for performing the microdissection of proximal tubules from paraffin-embedded blocks of tissue. I would like to thank Dr.

Dunlevy for her assistance with microscopy, expertise in cell biology, and mentorship. Brent Voels performed much of the cloning and purification of the 6.2/V5 vectors prior to kindly giving them to me for linearization and transfection. Seema Somji and Dr. Scott Garrett have been fantastic mentors as well, always available to assist with any struggles I encountered and their independent strengths have made me a well-rounded researcher.

Finally, I would like to thank my family and friends that have supported me as I achieved my goals. My husband (and best friend) John, who has been with me from the beginning of graduate school, is my rock. The many great friends who started and ended this journey with me, in particular Elizabeth Sandquist, Katie Collette, and Dani Rastedt. x These girls hold a special place in my heart, and I will cherish our many “knit nights,” happy hours, potlucks, seminars, practice sessions, comprehensive test review, and cakes.

I couldn’t have done it without any of you. xi ABSTRACT The proximal tubule of the kidney is particularly susceptible to toxicant-induced damage and cell cultures of human proximal tubule cells are widely utilized to study the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in renal disease. Cadmium is a toxic metal ion that is known to produce renal tubular necrosis and accumulate in the proximal tubule. This metal binds to a family of cysteine rich metal binding proteins known as metallothioneins (MT) that are found in abundance in the kidney.

Previous studies from our laboratory have shown that the third isoform of metallothionein (MT-3) is expressed in the epithelial cells of the human kidney, including those of the proximal tubule. An immortalized proximal tubule cell line does not express MT-3 and does not demonstrate vectorial active transport. Transfection of the MT-3 gene into the HK-2 cells restores vectorial active transport as evidenced by dome formation. This suggests that MT-3 is involved in mesenchymal to epithelial transition (MET), the reverse of EMT, and promotes and epithelial phenotype.

The goals of the present study were to examine the role of growth media composition on classic EMT responses, quantitatively evaluate the expression levels of E- and N-cadherin, define the functional epitope of MT-3 that mediates MET in HK-2 cells, and identify proteins that interact with MT-3 to promote epithelial features in the proximal tubule. It was shown that both E- and N-cadherin mRNA and protein are expressed in the human renal proximal tubule. Based on the pattern of cadherin expression, vectorial active transport, and transepithelial resistance, it seems that the HK-2 cell line has already undergone many of the early features associated xii with EMT. Our data indicates the unique, six amino acid C-terminal sequence of MT-3 is required to induce MET in HK-2 cells.

A combination of co-immunoprecipitation and western blotting indicate that MT-3 interacts with myosin-IIa, β-actin, enolase-1, tropomyosin-3, and aldolase-a in vitro. Together, the data suggests the HK-2 cell line can be an effective model to study later stages in the conversion of the renal epithelial cell to a mesenchymal cell and when transfected with MT-3 it may be an effective model to study the process of MET. MT-3 protein-protein interactions provide insight into the potential mechanism by which MT-3 promotes cytoskeletal organization in non-diseased epithelial proximal tubule cells and offers the opportunity to investigate these interactions under pathological conditions. xiii CHAPTER I INTRODUCTION Significance The incidence of chronic kidney disease (CKD) is steadily rising and has reached epidemic proportions in the western and industrialized world.

Chronic kidney disease is associated with albuminuria, decreased creatinine clearance, altered glomerular morphology, and tubular degeneration (Eddy & Neilson, 2006). Epidemiological evidence and animal models have demonstrated chronic cadmium exposure as a significant contributory factor for developing CKD (Gobe & Crane, 2010; Klaassen, Liu, & Diwan, 2009; Walter C Prozialeck & Edwards, 2012; Thévenod, 2003) Clinicopathological studies have shown tubulo-interstitial fibrosis to be the hallmark of CKD progression (Bohle, Müller, Wehrmann, Mackensen-Haen, & Xiao, 1996; Eddy & Neilson, 2006; Fine, Ong, & Norman, 1993; Zeisberg & Neilson, 2010). This suggests that halting the progression of CKD could be achieved by stopping the progression of or even by inducing remission of fibrosis. Renal fibrosis is defined as the scarring of the tubulo-interstitial space after kidney damage of any type.

It appears to be initiated at random in small areas that are preceded by interstitial inflammation, then expands to become diffuse if drivers of fibrosis persist (Prunotto et al. Accumulation and proliferation of activated fibroblasts (myofibroblasts) in these small areas are linked to the risk of progression of fibrosis (Hinz et al. The exact source 1 of renal myofibroblasts remains to be definitely defined. Several hypotheses exist in the literature including: migration of circulating fibrocytes to the site of the lesion, differentiation of local fibroblasts or pericytes, direct transformation of resident endothelial cells by endothelial-mesenchymal transition (endoMT), or transformation of resident epithelial cells through epithelial mesenchymal transition (EMT).

Studies in experimental models have shown that it is the pericytes that respond to chronic injury and profibrotic signals through proliferation and differentiation into myofibroblasts (S.