Khám Phá và Phân Tích Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người và Tác Động Của Cadmium

Khám phá và phân tích tế bào gốc từ tế bào ống thận người là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học… 116 trang · University of North Dakota · 2018.

• Tác giả: Swojani Shrestha
• Trường học: University of North Dakota
• Chuyên ngành: Biochemistry and Molecular Biology
• Đề tài: Khám Phá và Phân Tích Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Grand Forks

Mục lục chi tiết

• PERMISSION
• TABLE OF CONTENTS
• 1. Proximal Tubule Cells of the Kidney, Their Functions and Significance
• 2. Kidney Tubule Regeneration Theories
• 3. Stem/Progenitor Cells in Kidney
• 4. Markers of Stem/Progenitor Cells in Human Proximal Tubule Cells
• 5. Studies on Isolation of Stem/Progenitor Cells of Human Proximal Tubule Cells
• 6. Role of Stem/Progenitor Cells in Tubular Regeneration
• 7. Significance of In-vitro Cell Culture Models
• 8. Cell Culture Models
• 9. Real Time PCR
• 10. Microarray Analysis of Global Gene Expression
• 11. Determination of Cell Viability by DAPI Staining
• 12. Western Blot
• 13. Determination of LDH release
• 14. Florescence Activated Cell Sorting
• 15. Transepithelial Resistance Measurement
• 16. Spheroids Culture
• 17. Thick and Thin Layer Matrigel coated Cell Growth
• 18. MTT growth assay
• 19. Exposure of Cell-lines to Cd2+ and Determination of Cell Population
• 20. Subcutaneous Injection of Cell-Lines
• 21. Immunohistochemistry
• 22. Statistical Analysis
• 23. RESULTS
• 23.1. Global Gene Expression Pattern of HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells
• 23.2. Expression of CD24 and CD133 in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells
• 23.3. Expression of Cadherins, Claudins and Occludin in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cell Isolates
• 23.4. Mode of Cell Death in RPTEC/TERT1 Cells in Response to Cd+2 - Induced Toxicity
• 23.5. Isolation of CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population from RPTEC/TERT1 Cell Cultures
• 23.6. Expression of CD133 and CD24 Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells Cultures
• 23.7. Morphology, Transepithelial Resistance and Growth Rate Determination of RPTEC/TERT, CD133+CD24+ and CD24+ Cells
• 23.8. Ki67 Expression in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells
• 23.9. Expression of AQP-1 and CAL Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells
• 23.10. Ability of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells to Form Spheroids
• 23.11. Change in CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population after Exposure to Cd2+ for 34 Days
• 23.12. Growth of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ and HPT Cells with Matrigel in Culture Plates
• 23.13. Histology and Immunohistochemical staining of tubular structures formed by various populations of RPTEC/TERT1 cells
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• 24. CHAPTER I INTRODUCTION
• 24.1. The Kidney
• 24.2. Proximal Tubules of the Kidney, Their Function and Significance

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khám Phá Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người

Khám phá và phân tích tế bào gốc từ tế bào ống thận người là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. Tế bào gốc có khả năng tái tạo và phục hồi các mô bị tổn thương, đặc biệt là trong các bệnh lý liên quan đến thận. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của tế bào gốc mà còn mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị bệnh thận.

1.1. Tế Bào Gốc Là Gì Và Vai Trò Của Chúng Trong Y Học

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo mô và điều trị các bệnh lý. Nghiên cứu về tế bào gốc trong y học giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý nghiêm trọng.

1.2. Tại Sao Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Quan Trọng

Tế bào ống thận có khả năng tái tạo và phục hồi chức năng thận. Việc nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tái tạo mô thận và phát triển các phương pháp điều trị cho bệnh thận mãn tính.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tế Bào Gốc

Mặc dù nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận mang lại nhiều hứa hẹn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các vấn đề như sự phân bố tế bào gốc, khả năng tái tạo và sự tương tác với môi trường xung quanh cần được giải quyết. Những thách thức này ảnh hưởng đến hiệu quả của các phương pháp điều trị dựa trên tế bào gốc.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Tách Chiết Tế Bào Gốc

Quá trình tách chiết tế bào gốc từ tế bào ống thận gặp nhiều khó khăn do sự tương tác phức tạp giữa các tế bào. Việc phát triển các phương pháp tách chiết hiệu quả là cần thiết để nâng cao chất lượng tế bào gốc.

2.2. Sự Tương Tác Giữa Tế Bào Gốc và Môi Trường

Tế bào gốc cần một môi trường thích hợp để phát triển và hoạt động. Sự tương tác giữa tế bào gốc và các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến khả năng tái tạo và chức năng của chúng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận

Nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy tế bào, phân tích gene và các kỹ thuật sinh học phân tử. Những phương pháp này giúp xác định đặc điểm và chức năng của tế bào gốc, từ đó phát triển các ứng dụng lâm sàng.

3.1. Nuôi Cấy Tế Bào Gốc Trong Môi Trường In Vitro

Nuôi cấy tế bào gốc trong môi trường in vitro cho phép nghiên cứu sự phát triển và chức năng của chúng. Các yếu tố như dinh dưỡng và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Phân Tích Gene Để Xác Định Đặc Điểm Tế Bào

Phân tích gene giúp xác định các dấu hiệu sinh học của tế bào gốc. Việc này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng tái tạo và chức năng của tế bào gốc trong điều trị bệnh.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Tế Bào Gốc Trong Y Học

Tế bào gốc từ tế bào ống thận có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý thận. Chúng có thể được sử dụng để tái tạo mô thận, điều trị bệnh thận mãn tính và phục hồi chức năng thận sau tổn thương.

4.1. Tái Tạo Mô Thận Sau Tổn Thương

Tế bào gốc có khả năng tái tạo mô thận bị tổn thương do các yếu tố như độc tố hoặc bệnh lý. Việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị giúp phục hồi chức năng thận hiệu quả.

4.2. Điều Trị Bệnh Thận Mãn Tính

Nghiên cứu cho thấy tế bào gốc có thể cải thiện tình trạng bệnh thận mãn tính. Việc áp dụng tế bào gốc trong điều trị có thể mở ra hướng đi mới cho bệnh nhân.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Tế Bào Gốc

Nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận người đang mở ra nhiều cơ hội mới trong y học. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng của tế bào gốc trong điều trị bệnh thận là rất lớn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong điều trị và phục hồi chức năng thận.

5.1. Tiềm Năng Của Tế Bào Gốc Trong Y Học

Tế bào gốc có tiềm năng lớn trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý. Nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp khai thác tối đa khả năng của chúng.

5.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Hướng đi tương lai trong nghiên cứu tế bào gốc sẽ tập trung vào việc cải thiện các phương pháp tách chiết và nuôi cấy, cũng như phát triển các ứng dụng lâm sàng hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

• Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu: Ống lượn gần (proximal tubule) của nephron là cấu trúc đảm nhận khoảng 60% tổng lượng tái hấp thu dịch lọc cầu thận và các chất hòa tan. Quá trình này đòi hỏi mật độ ty thể cao và nguồn năng lượng ATP lớn, khiến tế bào biểu mô ống lượn gần trở thành vị trí nhạy cảm hàng đầu trước các tác nhân gây độc và các đợt thiếu máu cục bộ. Cadmium (Cd2+) là một chất gây ung thư và độc chất môi trường có thời gian bán hủy sinh học kéo dài từ 12 đến 30 năm trong cơ thể người. Cd2+ không bị phân hủy sinh học, bài tiết rất hạn chế qua nước tiểu và tích tụ chủ yếu tại vỏ thận. Quá trình tích tụ mạn tính Cd2+ dẫn đến rối loạn chức năng vận chuyển, tổn thương liên kết tế bào, khởi phát tổn thương thận cấp tính (Acute Kidney Injury - AKI), tiến triển thành bệnh thận mạn tính (Chronic Kidney Disease - CKD) và suy thận giai đoạn cuối (End-Stage Renal Disease - ESRD).

  Để nghiên cứu cơ chế bệnh sinh và độc học thận, việc thiết lập mô hình nuôi cấy in-vitro thích hợp là yêu cầu bắt buộc. Mặc dù tế bào biểu mô ống lượn gần nguyên phát ở người (Human Proximal Tubule - HPT) phản ánh trung thực đặc tính sinh lý in-vivo, nguồn mô vỏ thận từ người bệnh rất khó tiếp cận và tế bào bị giới hạn số lần phân chia do hiện tượng lão hóa sao chép (replicative senescence). Dòng tế bào bất tử HK-2 (được tạo ra bằng cách chuyển gen HPV16 E6/E7) được sử dụng phổ biến trong hơn một thập kỷ qua, nhưng đã suy giảm các đặc tính biểu mô: mất khả năng vận chuyển tích cực định hướng (không tạo được cấu trúc vòm - domes), không hình thành trở kháng biểu mô (Transepithelial Resistance - TER) do thiếu liên kết chặt, giảm biểu hiện E-cadherin, tăng N-cadherin và chết theo hình thức tự hủy (apoptosis) khi phơi nhiễm Cd2+, trong khi các mẫu sinh thiết lâm sàng ở người bệnh AKI và CKD lại thể hiện hình thái hoại tử (necrosis). Dòng tế bào RPTEC/TERT1 (bất tử hóa bằng cách biểu hiện tiểu đơn vị xúc tác telomerase người - hTERT) ra đời nhằm khắc phục các nhược điểm trên, song đòi hỏi phải được đánh giá đối sánh toàn diện về hệ gen và phản ứng độc chất so với HPT và HK-2.

  Bên cạnh đó, các lý thuyết tái tạo biểu mô thận hiện đại chỉ ra rằng quá trình phục hồi sau tổn thương bắt nguồn từ quần thể tế bào gốc/tiền thân cư trú tại chỗ biểu hiện các dấu ấn CD133 và CD24. Khoảng trống nghiên cứu then chốt mà luận án tập trung giải quyết là: xác định xem dòng tế bào RPTEC/TERT1 có duy trì quần thể tế bào tiền thân này hay không; thực hiện phân lập các tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+; khảo sát đáp ứng sống sót của chúng dưới tác động phơi nhiễm Cd2+ mạn tính; và kiểm chứng năng lực biệt hóa tạo cấu trúc ống thận trong môi trường nuôi cấy ba chiều (in-vitro) cũng như trên mô hình động vật (in-vivo).

• Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Đánh giá mức độ tương đồng về kiểu hình biểu hiện toàn bộ hệ gen (microarray), hệ thống phân tử liên kết biểu mô và phương thức chết tế bào do Cd2+ giữa dòng tế bào bất tử RPTEC/TERT1 với tế bào nguyên phát HPT và dòng HK-2.
  2. Phân lập hai tiểu quần thể tế bào CD133+CD24+ và CD24+ từ dòng tế bào RPTEC/TERT1 bằng phương pháp phân tách tế bào kích hoạt huỳnh quang (Fluorescence-Activated Cell Sorting - FACS).
  3. Định đặc tính sinh học của hai tiểu quần thể phân lập thông qua hình thái học, trở kháng điện thế biểu mô, tốc độ tăng sinh tế bào, dấu ấn phân chia Ki67, khả năng tạo thể cầu (spheroids) và biểu hiện các protein biệt hóa AQP-1 và Calbindin.
  4. Đánh giá sự biến đổi tỷ lệ quần thể và khả năng đề kháng của tế bào CD133+CD24+ và CD24+ khi phơi nhiễm mạn tính với Cd2+ ở nồng độ 4,5 µM và 9 µM trong thời gian 34 ngày.
  5. Đánh giá khả năng hình thành cấu trúc hình ống của các tiểu quần thể tế bào trên giá thể Matrigel in-vitro và trong các nốt ghép dưới da chuột khuyết miễn dịch in-vivo.

• Giả thuyết nghiên cứu: Quần thể tế bào gốc/tiền thân phân lập từ tế bào ống lượn gần người tham gia vào quá trình tái tạo sau tổn thương do cadmium bằng cách gia tăng số lượng tế bào và thể hiện khả năng biệt hóa tạo cấu trúc hình ống khi tiêm in-vivo.

• Đối tượng nghiên cứu:

  • Tế bào biểu mô ống lượn gần thận người: Tế bào nguyên phát HPT (phân lập từ mô vỏ thận của 6 bệnh nhân riêng biệt), dòng tế bào chuyển gen HPV16 E6/E7 HK-2, dòng tế bào chuyển gen hTERT RPTEC/TERT1.
  • Các tiểu quần thể tế bào CD133+CD24+ và CD24+ được phân tách từ dòng RPTEC/TERT1.
  • Chuột thí nghiệm suy giảm miễn dịch (nude mice).

• Phạm vi nghiên cứu:

  • Không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Trường Y và Khoa học Sức khỏe thuộc Đại học North Dakota (Grand Forks, North Dakota, Hoa Kỳ).
  • Thời gian thực nghiệm: Thử nghiệm độc tính cấp tính kéo dài đến 16 ngày; thử nghiệm phơi nhiễm cadmium mạn tính kéo dài liên tục 34 ngày; theo dõi sự phát triển của nốt ghép tế bào dưới da động vật ở các mốc ngày 7, 10, 13 và 16. Luận án được hoàn thành và bảo vệ năm 2018.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

• Các hướng nghiên cứu trước:

  • Cơ sở sinh lý và mô hình nuôi cấy tế bào ống lượn gần: Matlin K. đã làm rõ vai trò của các protein liên kết tế bào trong việc duy trì tính phân cực biểu mô và điều hòa tính thấm qua biểu mô. Mandel L. xác định ống lượn gần chịu trách nhiệm tái hấp thu 60% lượng dịch lọc cầu thận. Detrisac C. và cộng sự (1984) đã phân lập thành công tế bào biểu mô ống lượn gần vỏ thận người (HPT) trong môi trường không huyết thanh và mô tả hiện tượng tạo vòm như một chỉ dấu sinh lý của quá trình vận chuyển tích cực định hướng. Kim D. và cộng sự chỉ ra dòng tế bào HK-2 bị mất khả năng tạo vòm và không phát triển trở kháng biểu mô do thiếu hụt liên kết chặt. Bathula C. phát hiện dòng HK-2 bị suy giảm E-cadherin và tăng biểu hiện N-cadherin so với tế bào HPT. Ryan M. và cộng sự thiết lập dòng tế bào HK-2 thông qua chuyển nhiễm virus HPV16 E6/E7. Wieser M. và cộng sự thiết lập dòng RPTEC/TERT1 bằng cách chuyển gen hTERT. Aschauer L. và cộng sự, Simon B. và cộng sự, cùng Crean D. và cộng sự đã chứng minh RPTEC/TERT1 có hình thái tương đồng HPT, hình thành được liên kết chặt và có khả năng ứng dụng trong các thử nghiệm độc học thận.
  • Cơ chế độc tính của Cadmium: Satarug S. và Moore M. công bố các dữ liệu dịch tễ về phơi nhiễm cadmium qua thuốc lá và thực phẩm; Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2010) quy định mức dung nạp tạm thời hàng tháng là 25 µg/kg thể trọng. Järup L. phân tích tác động của cadmium gây tổn thương chức năng ống lượn gần, protein niệu và suy thận. Prozialeck W. chứng minh cadmium gây tổn hại cấu trúc cadherin, làm phân ly liên kết tế bào và khiến tế bào biểu mô co cụm thành hình tròn. Hodgson làm rõ con đường phức hợp cadmium-metallothionein (Cd-MT) đi vào tế bào ống thận và bị thoái giáng trong lysosome giải phóng Cd2+ tự do. He L. phát hiện kênh vận chuyển ion kim loại ZIP8 tham gia vận chuyển Cd2+ tự do qua màng tế bào. Garrett S. và cộng sự phân tích sự biến đổi biểu hiện các gen phản ứng stress, chu kỳ tế bào và bám dính khi tế bào HPT tiếp xúc với Cd2+. Thévenod (2009) chỉ ra các con đường tín hiệu MAP kinase, cAMP và Wnt/β-catenin bị thay đổi dưới tác động của cadmium. Bagchi và cộng sự (1997) cùng Waisberg và cộng sự ghi nhận cadmium kích thích sinh các gốc oxy hóa tự do (ROS) và gây tổn thương oxy hóa DNA. Về phương thức chết tế bào trên lâm sàng, Peres L. C. và cộng sự (2012) cùng Rosen S. xác nhận mẫu thận từ bệnh nhân AKI và CKD chủ yếu biểu hiện các đặc trưng hoại tử mô.
  • Lý thuyết tái tạo ống thận và tế bào gốc/tiền thân cư trú: Oliver J.S. và cộng sự (2005) cùng Lin F. và cộng sự (2005) chứng minh nguồn tế bào tái tạo ống thận xuất phát từ bên trong mô thận chứ không phải từ tủy xương hay tế bào ngoại thận. Vogetseder A. và cộng sự đề xuất giả thuyết tế bào ống sống sót trải qua quá trình khử biệt hóa, tăng sinh và tái biệt hóa. Humphreys B. sử dụng kỹ thuật đánh dấu dòng tế bào (lineage tracing) trên chuột AKI, khẳng định quá trình sửa chữa do các tế bào nội tại ống thận tự làm mới thực hiện mà không có sự tham gia của tế bào ngoài ống. Về sự tồn tại của tế bào tiền thân, Bussolati B. và cộng sự (2005) phân lập thành công tế bào CD133+ từ vỏ thận người, chứng minh chúng có khả năng tạo thể cầu, biểu hiện E-cadherin, ZO-1, phosphatase kiềm và khi tiêm dưới da chuột tạo nên các cấu trúc hình ống biểu hiện Cytokeratin 7, Cytokeratin 19, Vimentin và Pax-2. Lindgren D. và cộng sự (2011) sử dụng FACS phân lập tế bào có hoạt tính aldehyde dehydrogenase cao (ALDHhigh), chứng minh nhóm tế bào này biểu hiện CD133, CD24, VIM và có khả năng tạo thể cầu. Angelotti M.L. và cộng sự (2012) phân lập quần thể tế bào CD133+CD24+CD106- từ ống thận, chứng minh khả năng giảm nồng độ nitơ ure huyết khi truyền vào chuột suy thận cấp và tạo cấu trúc ống mang cả dấu ấn gần và xa khi nhuộm PKH26 trên chuột SCID. Romagnani P. và cộng sự (2013) khẳng định toàn bộ tế bào biểu hiện CD24 trong mô thận người trưởng thành đều đồng biểu hiện CD133. Bombelli S. và cộng sự sử dụng thể cầu thận (nephrospheres) tái định cư thành công trên khung giá thể thận người đã khử tế bào. Shrestha (nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả) ghi nhận tế bào HPT nguyên phát chứa khoảng 55-60% tế bào CD133+CD24+ và 40-45% tế bào CD24+.

• Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Phần lớn các nghiên cứu trước đây phân lập tế bào tiền thân từ mô tươi phẫu thuật của người, vốn có số lượng hạn chế và khó duy trì dài ngày để thử nghiệm độc chất mạn tính. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống này bằng cách: xác lập dòng bất tử RPTEC/TERT1 như một nguồn cung cấp ổn định để phân tách hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+; đối sánh trực tiếp kiểu hình phân tử của chúng với tế bào nguyên phát; làm rõ sự khác biệt giữa hai tiểu quần thể về khả năng chịu đựng trước phơi nhiễm Cd2+ liên tục trong 34 ngày; và kiểm chứng tiềm năng biệt hóa tạo ống in-vitro lẫn in-vivo.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

• Cơ sở lý thuyết và khung phân tích:

  • Lý thuyết hàng rào biểu mô và vận chuyển tích cực: Tế bào biểu mô ống lượn gần duy trì tính phân cực đỉnh - đáy thông qua hệ thống liên kết dính (adherens junctions) chứa các cadherin (E-cadherin/CDH1, N-cadherin/CDH2, P-cadherin/CDH3, Ksp-cadherin/CDH16) và liên kết chặt (tight junctions) chứa claudin 1 (CLDN1), claudin 4 (CLDN4) và occludin (OCDN). Hoạt động bơm ion của Na+/K+-ATPase tại màng đáy-bên thúc đẩy sự di chuyển dịch từ lòng ống vào khoang kẽ, tạo nên các bọng dịch đội lớp tế bào đơn lên khỏi mặt đĩa nuôi cấy (hiện tượng tạo vòm) và hình thành giá trị trở kháng điện thế TER.
  • Lý thuyết tế bào gốc/tiền thân ống thận: Giả định sự tồn tại của quần thể tế bào chưa biệt hóa hoàn toàn mang dấu ấn bề mặt CD133 và CD24, sở hữu hoạt tính enzyme ALDH1A1 cao, tốc độ phân chia cơ bản chậm nhưng có năng lực tự làm mới (tạo thể cầu), kháng lại tổn thương độc chất và có khả năng biệt hóa thành các tế bào ống chức năng biểu hiện Aquaporin-1 (AQP-1) hoặc Calbindin (CAL).
  • Khung phân tích hình thức chết tế bào: Phân biệt giữa hoại tử (đặc trưng bởi sự phá vỡ màng sinh chất, giải phóng enzyme nội bào lactate dehydrogenase - LDH, không có sự hoạt hóa caspase-3 và nhân tế bào không bị co cụm phân mảnh) và tự hủy (đặc trưng bởi sự hoạt hóa enzyme caspase-3 và nhân phân mảnh khi nhuộm DAPI).

• Phương pháp nghiên cứu thực tế:

  • Phương pháp định tính: Quan sát hình thái đơn lớp tế bào và hiện tượng tạo vòm dưới kính hiển vi quang học Zeiss; quan sát cấu trúc thể cầu và mạng lưới hình ống trên khuôn nền Matrigel mỏng và dày; chụp ảnh hiển vi huỳnh quang đồng tiêu laser (Leica TCS SPE, DM5500) đánh giá sự phân bố của CD133, CD24, AQP-1, CAL và sợi F-actin nhuộm bằng phalloidin; đánh giá cấu trúc mô học và biểu hiện protein qua nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) sử dụng phức hợp Dako EnVision+ và cơ chất diaminobenzidine (DAB).
  • Phương pháp định lượng: Định lượng biểu hiện toàn bộ hệ gen thông qua mảng lai Affymetrix Human Transcriptome 2.0 Array; định lượng mức phiên mã gen bằng Real-Time PCR (Bio-Rad iCycler iQ); định lượng protein bằng phương pháp Western blot; đo hoạt độ enzyme LDH giải phóng (đo quang ở bước sóng 490 nm); đo hoạt độ caspase-3 qua sự phân cắt cơ chất DEVD-pNA (đo quang ở bước sóng 405 nm); đếm tỷ lệ nhân phân mảnh bằng nhuộm DAPI (tối thiểu 20 vi trường/giếng, 3 giếng/điểm dữ liệu); đo giá trị TER bằng thiết bị EVOM; đo tốc độ tăng trưởng tế bào bằng xét nghiệm khử muối MTT (đo quang ở bước sóng 570 nm); phân tích dòng tế bào và tỷ lệ tế bào dương tính với Ki67 trên máy SONY SH800 và BD LSRII.
  • Kỹ thuật phân tách tế bào (FACS): Tế bào RPTEC/TERT1 bão hòa được phân tách đơn bào bằng Accutase, nhuộm kháng thể liên hợp huỳnh quang CD133-FITC và CD24-PE, đưa vào hệ thống BD FACS Aria. Thiết lập cổng phân loại loại bỏ tế bào kép (doublets) qua biểu đồ FSC so với SSC, đặt ngưỡng tín hiệu dương tính là 1x10^3 trên cả hai trục tọa độ và thu nhận 1x10^5 tế bào cho mỗi quần thể vào đĩa 48 giếng để nhân dòng bậc thang (lên đĩa 24 giếng, 6 giếng, bình T-25 và T-75).
  • Thử nghiệm ghép động vật in-vivo: Hỗn dịch 1x10^6 tế bào trộn với Matrigel tỷ lệ 1:1 trong PBS lạnh (thể tích tiêm 0,4 ml) được tiêm dưới da 4 chuột khuyết miễn dịch (nude mice) cho mỗi dòng tế bào; thu hoạch nốt mô ở các ngày 7, 10, 13 và 16 để cố định trong formalin 10%, đúc khối paraffin và cắt lát 3-5 µm.
  • Xử lý số liệu thống kê: Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập (triplicates). Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SEM). Phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) kết hợp kiểm định sau phân tích Tukey post-hoc được thực hiện trên phần mềm GraphPad PRISM 4.

• Nguồn tư liệu và bảng hóa chất, kháng thể:

Tên kháng thể	Mục đích sử dụng	Loại kháng thể / Loài	Nhà sản xuất & Mã sản phẩm	Trọng lượng phân tử / Nồng độ sử dụng
β-actin	Western blot	Chuột đơn dòng	Abcam (Ab8226)	42 kDa; pha loãng 1:1000
CD133	WB / IF / IHC	Chuột đơn dòng / Thỏ đa dòng	Miltenyi Biotec (130-090-422 / ab19898)	95 kDa; WB 1:100, IF 1:25, IHC 1:50
CD24	WB / IF / IHC	Chuột đơn dòng	Santa-Cruz (sc-19585) / Invitrogen (MA5-11833)	35-45 kDa; WB 1:500, IF 1:50, IHC 1:10
CD44	Western blot	Chuột đơn dòng	Cell Signaling (#3570)	80 kDa; pha loãng 1:1000
ALDH1A1	Western blot	Chuột đơn dòng	Santa-Cruz (sc-374149)	56 kDa; pha loãng 1:2000
CDH2	Western blot	Chuột đơn dòng	Invitrogen (MA1-2002)	130 kDa; pha loãng 1:500
CDH1	Western blot	Thỏ đa dòng	Santa-Cruz (sc-7870)	120 kDa; pha loãng 1:250
CDH3	Western blot	Thỏ đa dòng	Santa-Cruz (sc-7893)	118 kDa; pha loãng 1:800
CDH16	Western blot	Thỏ đa dòng	Abcam (ab80320)	90 kDa; pha loãng 1:300
OCDN	Western blot	Chuột đơn dòng	Invitrogen (33-1500)	82 kDa; nồng độ 0,5 µg/ml
CLDN4	Western blot	Chuột đơn dòng	Invitrogen (32-9400)	22 kDa; pha loãng 1:500
CLDN1	Western blot	Chuột đơn dòng	Life Technologies (37-4900)	18 kDa; pha loãng 1:500
AQP-1	IF	Chuột đơn dòng	Abcam (ab9566)	Pha loãng 1:100
CAL	IF / IHC	Thỏ đa dòng	Abcam (ab11426)	IF 1:1000, IHC 1:200
AP	IHC	Thỏ đa dòng	Abcam (ab95462)	Pha loãng 1:200
VIM	IHC	Thỏ đơn dòng	Cell Signaling (5741S)	Pha loãng 1:100
CK AE1&3	IHC	Chuột đơn dòng	Dako (M351501)	Pha loãng 1:200
CK7	IHC	Chuột đơn dòng	Dako (M7018)	Pha loãng 1:200
CK19	IHC	Thỏ đa dòng	Abcam (ab155118)	Pha loãng 1:100
PAX-2	IHC	Chuột đơn dòng	Abcam (ab150391)	Pha loãng 1:50

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Giới thiệu (Introduction)

Chương I tổng thuật hệ thống cấu trúc giải phẫu của thận gồm ba vùng (vỏ thận, tủy thận, bể thận) và cấu trúc nephron. Tác giả đi sâu vào tế bào biểu mô ống lượn gần với bờ bàn chải vi nhung mao ở mặt lòng ống, hệ thống liên kết tế bào dính kết vào màng đáy, cùng mật độ ty thể phục vụ tái hấp thu 60% dịch lọc cầu thận. Chương này làm rõ cơ chế tích tụ của độc chất cadmium qua con đường nhập bào phức hợp Cd-MT và kênh ZIP8, dẫn đến stress oxy hóa, kích hoạt các dòng thác tín hiệu MAP kinase, cAMP, Wnt/β-catenin và làm tan rã các protein liên kết tế bào.

Tác giả phân tích hai trường phái lý thuyết về tái tạo biểu mô ống thận: lý thuyết tế bào sống sót khử biệt hóa và lý thuyết tế bào gốc/tiền thân cư trú tại chỗ. Dựa trên các nghiên cứu của Oliver, Lin và bằng chứng đánh dấu dòng tế bào của Humphreys, luận án khẳng định vai trò quyết định của quần thể tế bào tiền thân nội tại biểu hiện CD133, CD24 và VIM. Chương I cũng điểm lại các mô hình tế bào in-vitro, so sánh những khiếm khuyết của dòng HK-2 với ưu điểm giữ nguyên kiểu hình phân cực biểu mô và khả năng tạo vòm của dòng RPTEC/TERT1, từ đó thiết lập cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học cho toàn bộ nghiên cứu.

Chương II: Phương pháp nghiên cứu (Methods)

Chương II mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Phương pháp nuôi cấy dòng tế bào HPT, HK-2 và RPTEC/TERT1 trong môi trường không huyết thanh DMEM/Ham's F-12 (tỷ lệ 1:1) bổ sung 6 dưỡng chất thiết yếu (selenium 5 ng/ml, insulin 5 µg/ml, transferrin 5 µg/ml, hydrocortisone 36 ng/ml, triiodothyronine 4 pg/ml và EGF 10 ng/ml).
• Quy trình phân lập RNA bằng Tri Reagent và 1-bromo-3-chloropropane (BCP), tổng hợp cDNA bằng bộ kit iScript và phân tích biểu hiện gen trên Bio-Rad iCycler iQ sử dụng hóa chất SYBR Green.
• Quy trình phân tích microarray toàn bộ hệ gen trên mảng Affymetrix Human Transcriptome 2.0 Array (chứa 44.699 cụm mã hóa protein và 22.829 cụm không mã hóa), chuẩn hóa tín hiệu bằng thuật toán SST-RMA trên phần mềm Affymetrix Expression Console bản 1.3, phân tích cụm phân cấp không giám sát UPGMA dựa trên hệ số tương quan Pearson và kiểm định bootstrap trên phần mềm GeneMath XT 2.0 với hơn 10.000 hoán vị (độ ổn định cụm đạt 100).
• Các thử nghiệm xác định hình thức chết tế bào: nhuộm huỳnh quang nhân DAPI đếm tỷ lệ nhân phân mảnh; đo hoạt độ LDH giải phóng bằng CytoTox 96; xét nghiệm hoạt độ caspase-3 qua sự phân cắt cơ chất DEVD-pNA.
• Quy trình kỹ thuật phân tách tế bào FACS trên hệ thống BD FACS Aria thu nhận hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+; đo trở kháng TER bằng máy EVOM với điện cực STX2 trên màng lọc 0,1 cm2; nuôi cấy thể cầu trong bình siêu bám dính thấp; nuôi cấy trên lớp phủ Matrigel mỏng và dày; thử nghiệm tăng trưởng MTT; phơi nhiễm mạn tính với Cd2+ (4,5 µM và 9 µM) trong 34 ngày phân tích trên máy dòng chảy tế bào BD LSRII và SONY SH800; tiêm dưới da chuột khuyết miễn dịch và phân tích hóa mô miễn dịch các nốt u sau thu hoạch.

Chương III: Kết quả nghiên cứu (Results)

Chương III trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm được tổ chức thành 13 nhóm nội dung chính:

1. Mô hình biểu hiện gen toàn cầu: Phân tích phân cụm phân cấp UPGMA và phân tích thành phần chính (PCA) trên 67.528 cụm phiên mã phi đối chứng cho thấy 3 mẫu lặp của dòng RPTEC/TERT1 liên kết chặt chẽ vào cùng một nhánh phân loại với 6 mẫu tế bào HPT nguyên phát, trong khi dòng HK-2 phân nhánh tách biệt hoàn toàn.
2. Biểu hiện CD133 và CD24: Dòng RPTEC/TERT1 và tế bào HPT biểu hiện tỷ lệ tế bào đồng dương tính CD133+CD24+ vượt trội so với dòng HK-2 trên cả phân tích Western blot, RT-qPCR và dòng chảy tế bào.
3. Biểu hiện các protein liên kết: RPTEC/TERT1 duy trì mức biểu hiện E-cadherin (CDH1), Ksp-cadherin (CDH16), claudin 1 (CLDN1), claudin 4 (CLDN4) và occludin (OCDN) tương đồng với HPT; ngược lại, HK-2 bị suy giảm mạnh E-cadherin và các protein liên kết chặt, đồng thời tăng biểu hiện N-cadherin (CDH2).
4. Phương thức chết tế bào dưới tác động của Cd2+: Khi tiếp xúc với Cd2+, dòng HK-2 chết qua con đường tự hủy với sự gia tăng rõ rệt của caspase-3 và nhân phân mảnh nhuộm DAPI; trong khi đó, dòng RPTEC/TERT1 chết qua con đường hoại tử, đặc trưng bởi sự rò rỉ mạnh enzyme LDH mà không làm tăng caspase-3 hay gây phân mảnh nhân.
5. Phân lập quần thể tế bào: Từ dòng RPTEC/TERT1 nguyên bản (chứa khoảng 70-75% tế bào CD133+CD24+ và 25-30% tế bào CD24+), kỹ thuật FACS đã phân tách thành công hai tiểu quần thể thuần khiết là CD133+CD24+ và CD24+.
6. Kiểm tra độ tinh sạch và biểu hiện dấu ấn: Sau nhiều lần cấy chuyển, tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+ duy trì độ thuần khiết và kiểu hình biểu hiện protein ổn định qua phân tích Western blot và nhuộm huỳnh quang miễn dịch.
7. Hình thái, trở kháng biểu mô và tốc độ tăng trưởng: Cả hai tiểu quần thể đều có hình thái biểu mô đa giác đồng nhất và có khả năng hình thành cấu trúc vòm. Cả hai đều thiết lập giá trị TER từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 10 sau khi gieo cấy. Xét nghiệm MTT cho thấy tiểu quần thể song dương tính CD133+CD24+ có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn rõ rệt so với tiểu quần thể đơn dương tính CD24+.
8. Biểu hiện dấu ấn phân bào Ki67: Phân tích tế bào dòng chảy trên các đĩa nuôi cấy bão hòa xác nhận tỷ lệ tế bào dương tính với Ki67 ở quần thể CD133+CD24+ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với quần thể CD24+ và dòng tế bào gốc RPTEC/TERT1.
9. Biểu hiện AQP-1 và CAL: Nhuộm huỳnh quang miễn dịch xác nhận cả hai tiểu quần thể đều biểu hiện dấu ấn ống lượn gần Aquaporin-1 (AQP-1) và dấu ấn ống lượn xa Calbindin (CAL).
10. Khả năng tạo thể cầu (Spheroids): Cả hai tiểu quần thể khi nuôi cấy trong bình siêu bám dính thấp đều hình thành các thể cầu trôi nổi sau 8-10 ngày, chứng minh năng lực tự làm mới.
11. Đáp ứng trước phơi nhiễm Cd2+ trong 34 ngày: Khi nuôi cấy liên tục với 4,5 µM và 9 µM Cd2+, tỷ lệ tế bào CD133+CD24+ duy trì ổn định và không suy giảm; ngược lại, số lượng tế bào CD24+ giảm dần theo thời gian, cho thấy tiểu quần thể CD133+CD24+ có tính đề kháng cao hơn trước độc tính của cadmium.
12. Nuôi cấy trên Matrigel in-vitro: Khi gieo cấy trên lớp Matrigel mỏng (3 ngày) và lớp Matrigel dày (14 ngày), các tế bào di chuyển, tập hợp và biệt hóa tạo thành mạng lưới cấu trúc dạng ống tương tự tế bào HPT.
13. Tạo ống và hóa mô miễn dịch in-vivo: Các nốt mô hình thành dưới da chuột sau khi tiêm tế bào CD133+CD24+ và CD24+ được thu hoạch ở các ngày 7, 10, 13 và 16. Phân tích IHC cho thấy các cấu trúc hình ống xuất phát từ tế bào CD133+CD24+ dương tính với cả dấu ấn ống gần (AP, AQP-1) lẫn dấu ấn ống xa (CAL, CK7, CK19, PAX-2); trong khi nốt u từ tế bào CD24+ chỉ dương tính với các dấu ấn ống gần.

Chương IV: Thảo luận (Discussion)

Chương IV phân tích sâu các ý nghĩa sinh học từ kết quả đạt được:

• Khẳng định dòng tế bào RPTEC/TERT1 là mô hình thay thế đại diện cho tế bào ống lượn gần người nguyên phát nhờ duy trì trọn vẹn kiểu hình biểu hiện gen, các cấu trúc liên kết biểu mô và khả năng vận chuyển tích cực định hướng (tạo vòm và TER), vượt trội so với sự biến đổi kiểu hình do virus ở dòng HK-2.
• Nhấn mạnh tính tương thích lâm sàng của phương thức chết hoại tử ở RPTEC/TERT1 khi tiếp xúc với cadmium, phản ánh chính xác tình trạng bệnh lý ghi nhận trên bệnh nhân AKI và CKD so với cơ chế tự hủy nhân tạo ở dòng HK-2.
• Thảo luận về bản chất của hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+: sự tồn tại của quần thể song dương tính đề kháng cao với Cd2+ củng cố lý thuyết về tế bào tiền thân cư trú tại chỗ chịu trách nhiệm tái tạo biểu mô sau tổn thương độc chất. Sự biểu hiện của cả dấu ấn ống lượn gần và xa trong cấu trúc ống in-vivo chứng minh tính đa năng và tiềm năng biệt hóa rộng của tiểu quần thể CD133+CD24+.

---

Kết quả và những đóng góp mới

• Những đóng góp mới về mặt lý luận:

  1. Chứng minh thông qua phân tích microarray toàn bộ hệ gen (67.528 cụm phiên mã) rằng dòng tế bào bất tử RPTEC/TERT1 có mô hình biểu hiện gen tương đồng cao với tế bào ống lượn gần nguyên phát HPT từ người, đồng thời phân tách biệt lập hoàn toàn khỏi dòng HK-2.
  2. Xác lập bằng chứng thực nghiệm cho thấy tế bào RPTEC/TERT1 chết theo phương thức hoại tử (tăng rò rỉ LDH, không tăng caspase-3, nhân không phân mảnh) khi phơi nhiễm Cd2+, mô phỏng sát thực tế bệnh học lâm sàng ở người so với cơ chế chết tự hủy của dòng HK-2.
  3. Xác định trong dòng RPTEC/TERT1 tồn tại hai tiểu quần thể riêng biệt gồm CD133+CD24+ (chiếm 70-75%) và CD24+ (chiếm 25-30%), tương tự sự phân bố ghi nhận trên nuôi cấy nguyên phát HPT.
  4. Chứng minh tiểu quần thể CD133+CD24+ có khả năng đề kháng chọn lọc trước phơi nhiễm Cd2+ mạn tính (34 ngày) và sở hữu đặc tính tiền thân đa năng khi có khả năng biệt hóa tạo cấu trúc hình ống mang cả dấu ấn ống gần (AP, AQP-1) và ống xa (CAL, CK7, CK19, PAX-2) trên mô hình động vật in-vivo.

• Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

  • Khuyến nghị sử dụng dòng tế bào bất tử RPTEC/TERT1 làm mô hình in-vitro tiêu chuẩn thay thế cho dòng HK-2 trong các nghiên cứu sàng lọc độc tính thận và cơ chế bệnh lý ống thận do hóa chất hay kim loại nặng gây ra.
  • Đề xuất ứng dụng quy trình phân tách FACS và nuôi cấy mở rộng hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+ để nghiên cứu chuyên sâu về sinh học tế bào gốc thận.
  • Định hướng sử dụng tiểu quần thể CD133+CD24+ làm nguồn tế bào mục tiêu cho các nghiên cứu y học tái tạo và kỹ thuật mô thận nhờ khả năng chịu đựng độc chất và tiềm năng tái tạo biểu mô hình ống.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Phương pháp nuôi cấy thể cầu 3D (spheroid) trong bình siêu bám dính thấp gặp khó khăn trong việc mở rộng quy mô số lượng lớn, dẫn đến hạn chế lượng mẫu sinh học phục vụ các phân tích sâu về hệ protein (proteomics) và phân tử.
  • Các thể cầu tế bào hình thành rất khó phân tách thành tế bào đơn lẻ, gây trở ngại kỹ thuật cho việc đánh giá khả năng tăng sinh và biệt hóa đơn dòng tiếp theo.
  • Vai trò sinh lý học chính xác và chức năng của tiểu quần thể tế bào đơn dương tính CD24+ chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn do quần thể này bị suy giảm số lượng mạnh dưới tác động của Cd2+.
  • Thử nghiệm tạo ống in-vivo mới dừng lại ở mô hình cấy ghép dưới da chuột khuyết miễn dịch, chưa thực hiện tiêm ghép trực tiếp vào nhu mô vỏ thận hay dưới bao thận trên các mô hình động vật suy thận cấp thực nghiệm.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Đi sâu phân tích các cơ chế phân tử và con đường truyền tín hiệu giúp tiểu quần thể CD133+CD24+ duy trì khả năng đề kháng trước độc tính mạn tính của cadmium.
  • Nghiên cứu chi tiết số phận và chức năng của tiểu quần thể CD24+ trong các trạng thái sinh lý và bệnh lý khác nhau của biểu mô thận.
  • Ứng dụng các vật liệu sinh học 3D cải tiến hoặc khung giá thể thận người đã khử tế bào (như phương pháp của Bombelli) để khảo sát khả năng tái định cư và phục hồi chức năng của quần thể tế bào tiền thân phân lập.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và các nhà khoa học trong các chuyên ngành Hóa sinh, Sinh học phân tử, Độc học tế bào, Sinh học tế bào gốc và Thận học (Nephrology).
  • Giảng viên đại học chuyên ngành y sinh học làm tài liệu giảng dạy về mô hình hóa bệnh lý in-vitro, kỹ thuật phân tách tế bào dòng chảy và cơ chế tổn thương biểu mô.
  • Các chuyên gia và đơn vị nghiên cứu y học tái tạo, kỹ thuật mô đang tìm kiếm nguồn tế bào tiền thân thận ổn định, có thể nuôi cấy dài hạn mà không bị biến đổi ác tính.

• Nội dung có giá trị tham khảo cao nhất:

  • Quy trình kỹ thuật phân tách FACS, nuôi cấy nhân dòng bậc thang và duy trì độ tinh sạch của hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+ (Chương II).
  • Bộ dữ liệu đối sánh hệ gen toàn cầu (microarray) và bằng chứng xác lập phương thức chết tế bào hoại tử của RPTEC/TERT1 trước tác động của cadmium (Chương III).
  • Phương pháp và kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch đánh giá cấu trúc hình ống đa dòng in-vivo hình thành từ tế bào tiền thân thận (Chương III).

---

Câu hỏi thường gặp

• Câu hỏi 1: Tỷ lệ phân bố ban đầu của hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+ trong dòng RPTEC/TERT1 và tế bào HPT nguyên phát là bao nhiêu? Trả lời: Trong dòng tế bào bất tử RPTEC/TERT1, tiểu quần thể song dương tính CD133+CD24+ chiếm khoảng 70-75%, trong khi tiểu quần thể đơn dương tính CD24+ chiếm khoảng 25-30%. Tỷ lệ này ở tế bào biểu mô ống lượn gần nguyên phát (HPT) từ các nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả là khoảng 55-60% tế bào CD133+CD24+ và 40-45% tế bào CD24+.

• Câu hỏi 2: Sự khác biệt cốt lõi về phương thức chết tế bào giữa dòng RPTEC/TERT1 và HK-2 khi phơi nhiễm với cadmium là gì? Trả lời: Dưới tác động của cadmium (Cd2+), dòng tế bào HK-2 chết theo hình thức tự hủy (apoptosis), thể hiện qua sự gia tăng hoạt độ enzyme caspase-3 và xuất hiện nhân tế bào co cụm, phân mảnh khi nhuộm DAPI. Ngược lại, dòng tế bào RPTEC/TERT1 chết theo hình thức hoại tử (necrosis), đặc trưng bởi sự gia tăng phóng thích enzyme LDH vào môi trường mà không kích hoạt caspase-3 và không làm phân mảnh nhân tế bào.

• Câu hỏi 3: Hai tiểu quần thể CD133+CD24+ và CD24+ phản ứng như thế nào khi phơi nhiễm mạn tính với Cd2+ ở nồng độ 4,5 µM và 9 µM trong 34 ngày? Trả lời: Tiểu quần thể song dương tính CD133+CD24+ thể hiện tính đề kháng cao với cadmium, số lượng và tỷ lệ tế bào không bị suy giảm trong suốt 34 ngày điều trị. Ngược lại, tiểu quần thể CD24+ rất nhạy cảm với độc chất, số lượng tế bào bị suy giảm đáng kể theo thời gian phơi nhiễm.

• Câu hỏi 4: Khả năng biệt hóa tạo ống in-vivo của tiểu quần thể CD133+CD24+ khác biệt như thế nào so với tiểu quần thể CD24+ khi tiêm dưới da chuột khuyết miễn dịch? Trả lời: Khi tiêm dưới da chuột khuyết miễn dịch, tiểu quần thể CD133+CD24+ hình thành các cấu trúc hình ống dương tính với cả dấu ấn ống lượn gần (Phosphatase kiềm - AP, Aquaporin-1 - AQP-1) và dấu ấn ống lượn xa (Calbindin - CAL, Cytokeratin 7 - CK7, Cytokeratin 19 - CK19, PAX-2), thể hiện tính chất tiền thân đa năng. Trong khi đó, các cấu trúc hình ống do tiểu quần thể CD24+ tạo ra chỉ dương tính với các dấu ấn của ống lượn gần.

• Câu hỏi 5: Tại sao dòng tế bào HK-2 không được xem là mô hình lý tưởng để nghiên cứu chức năng ống lượn gần so với dòng RPTEC/TERT1? Trả lời: Dòng HK-2 đã bị biến đổi kiểu hình do tác động của oncogene E6/E7 từ virus HPV16: tế bào mất khả năng vận chuyển tích cực định hướng (không tạo được cấu trúc vòm), không thiết lập được trở kháng điện thế biểu mô (TER) do thiếu hụt liên kết chặt, bị suy giảm E-cadherin và tăng N-cadherin, đồng thời biểu hiện kiểu chết tế bào tự hủy nhân tạo không tương đồng với các tổn thương hoại tử trên lâm sàng. Dòng RPTEC/TERT1 khắc phục toàn bộ các nhược điểm này và duy trì kiểu hình tương đồng với tế bào nguyên phát HPT.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Swojani Shrestha đã xác lập thành công dòng tế bào bất tử hTERT RPTEC/TERT1 như một mô hình in-vitro thích hợp thay thế tế bào nguyên phát HPT trong nghiên cứu sinh lý và độc học thận do cadmium. Nghiên cứu đã phân lập và đặc trưng hóa toàn diện hai tiểu quần thể tế bào tiền thân CD133+CD24+ và CD24+ từ dòng RPTEC/TERT1. Kết quả thực nghiệm khẳng định tiểu quần thể CD133+CD24+ sở hữu tốc độ tăng sinh cao, có khả năng đề kháng bền vững trước phơi nhiễm cadmium mạn tính trong 34 ngày và thể hiện tiềm năng biệt hóa đa dòng tạo cấu trúc hình ống hoàn chỉnh cả in-vitro lẫn in-vivo. Các phát hiện này cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế bệnh sinh ống thận và ứng dụng y học tái tạo trong điều trị tổn thương thận.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of North Dakota UND Scholarly Commons Theses and Dissertations Theses, Dissertations, and Senior Projects January 2018 Isolation And Characterization Of Stem Cell Population In Human Proximal Tubule Cells And The Effect Of Cadmium In The Isolated Proximal Tubule Stem/progenitor Cell Line. Swojani Shrestha Follow this and additional works at: https://commons.edu/theses Recommended Citation Shrestha, Swojani, "Isolation And Characterization Of Stem Cell Population In Human Proximal Tubule Cells And The Effect Of Cadmium In The Isolated Proximal Tubule Stem/progenitor Cell Line. Theses and Dissertations.edu/theses/2347 This Dissertation is brought to you for free and open access by the Theses, Dissertations, and Senior Projects at UND Scholarly Commons. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations by an authorized administrator of UND Scholarly Commons.

For more information, please contact zeineb. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF STEM CELL POPULATION IN HUMAN PROXIMAL TUBULE CELLS AND THE EFFECT OF CADMIUM IN THE ISOLATED PROXIMAL TUBULE STEM/PROGENITOR CELL LINE. by Swojani Shrestha Bachelor of Science, Minnesota State University Moorhead, 2013 A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of the University of North Dakota in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Grand Forks, North Dakota August 2018 i c 2018 Swojani Shrestha ii PERMISSION Title Isolation and characterization of stem cell population from human proximal tubule cells and the effect of cadmium in isolated proximal tubule stem/progenitor cell lines Department Biochemistry and Molecular Biology Degree Doctor of Philosophy In presenting this dissertation in partial fulfillment of the requirements for a graduate degree from the University of North Dakota, I agree that the library of this University shall make it freely available for inspection. I further agree that permission for extensive copying for scholarly purposes may be granted by the professor who supervised my dissertation work or, in his absence, by the Chairperson of the department or the dean of the School of Graduate Studies.

It is understood that any copying or publication or other use of this dissertation or part thereof for financial gain shall not be allowed without my written permission. It is also understood that due recognition shall be given to me and to the University of North Dakota in any scholarly use which may be made of any material in my dissertation. Swojani Shrestha Jun, 2018 iv TABLE OF CONTENTS LIST OF FIGURES…………………………………………………………….…iv LIST OF TABLES………………………………………………………………….1 Proximal Tubule Cells of the Kidney, Their Functions and Significance…………….4 Kidney Tubule Regeneration Theories.6 Stem/Progenitor Cells in Kidney………….8 Markers of Stem/Progenitor Cells in Human Proximal Tubule Cells.…8 Studies on Isolation of Stem/Progenitor Cells of Human Proximal Tubule Cells.……9 Role of Stem/Progenitor Cells in Tubular Regeneration…….11 Significance of In-vitro Cell Culture Models.12 Cell Culture Models…….20 Real Time PCR.21 Microarray Analysis of Global Gene Expression……………………22 Determination of Cell Viability by DAPI Staining………………….22 Western Blot…………………………………………………………23 Determination of LDH release……………………………………….25 Florescence Activated Cell Sorting………………………………….26 Transepithelial Resistance Measurement……………………………27 Spheroids Culture……………………………………………………28 Thick and Thin Layer Matrigel coated Cell Growth……………….29 MTT growth assay………………………………………………….30 Exposure of Cell-lines to Cd2+ and Determination of Cell Population………………………………………………………….30 Subcutaneous Injection of Cell-Lines……………………………….31 Immunohistochemistry………………………………………………31 Statistical Analysis…………………………………………………. RESULTS……………………………………………………………34 vi Global Gene Expression Pattern of HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells………………………………………………………………….34 Expression of CD24 and CD133 in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells……………………………………………….42 Expression of Cadherins, Claudins and Occludin in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cell Isolates……………………………………45 Mode of Cell Death in RPTEC/TERT1 Cells in Response to Cd+2 - Induced Toxicity…………………………………………………….48 Isolation of CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population from RPTEC/TERT1 Cell Cultures…………………………………….…50 Expression of CD133 and CD24 Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells Cultures…………………….54 Morphology, Transepithelial Resistance and Growth Rate Determination of RPTEC/TERT, CD133+CD24+ and CD24+ Cells………………………………………………….56 Ki67 Expression in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells………………………………………………….58 Expression of AQP-1 and CAL Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells………………………….60 Ability of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells to Form Spheroids…………………………………………………….61 Change in CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population after Exposure to Cd2+ for 34 Days………………………………………………….63 Growth of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ and HPT Cells with Matrigel in Culture Plates………………………………………68 Histology and Immunohistochemical staining of tubular structures formed by various populations of RPTEC/TERT1 cells…………….77 vii Characteristic Features of In-Vitro Human Proximal Epithelial Cell Culture……………………………………………………………….77 Immortalized RPTEC/TERT1 Cells as a Model System to Study Human Proximal Tubule Cells…………………………………….79 Mode of Cell Death after Cadmium Insult in RPTEC/TERT1 Cells.82 Expression of CD133 and CD24 Markers in Primary Human Proximal Tubule Cultures…………………………………………………….83 Characterization of CD133+CD24+ and CD24+ Cells isolated from RPTEC/TERT1 Cells……………………………………………….83 Exposure to Cadmium decreases CD24+ Cell Population while increases CD133+CD24+ Cell Population……………………….…85 Ki67 Expression in Cultured RPTEC/TERT1 after Cadmium Insult.87 Demonstration of the ability of various populations of cells to form tubular structures in-vitro and in-vivo……………………………….92 viii LIST OF FIGURES Figure Page I-1.

Three regions of the kidney……………………………………………………. Parts of the nephron………………………………………………………………. Regeneration mechanism in epithelial tubular cells after injury…………………. Schematic of dome formation………………………………………………….

Hierarchical clustering of various proximal tubule cell transcriptomes………. Principal component analysis using all 67,528 non-control transcript clusters……………………………………………………………………. Venn diagram showing differentially expressed genes in HK-2 cells and RPTEC/TERT1 cells in comparison to mortal human proximal tubule cell (HPT) isolates………………………………………………………………………………. Transposed principal component analysis after performing discriminant analysis of pre-defined groups……………………………………………………………….

Hierarchical clustering of transcript cluster expression after statistical filtering…. Flow cytometry analysis of CD24 and CD133 populations in proximal tubule cells…. Expression of stem cell markers in cultures of human proximal tubule cells………………………………………………………………………. Expression of cadherins in cultures of human proximal tubule cells………………………………………………………………………………….

Expression of tight junction proteins in cultures of human proximal tubule cells…………………………………………………………………………. Effect of Cd+2 on RPTEC/TERT1 cells………………………………………48 ix III-11. Effect of Cd+2 on HK-2 cells………………………………………………. Flow cytometry analysis of CD133+CD24+ and CD24+ populations in RPTEC/TERT1 cells ran in triplicate……………………………………………….

Flow cytometry analysis of CD133+CD24+ cells to test purity at each passage number………………………………………………………………………………. Flow cytometry analysis of CD24+ cells to test purity at each passage number………………………………………………………………………………. Expression of CD133 and CD24 in various populations of renal tubular cells……………………………………………………………………. Light level microscopy of different proximal tubular cell cultures after sorting…………………………………………………………………56 III-17.

Transepithelial resistance measurement of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells…………………………………………………………………………. Determination of growth rates of various populations of renal tubular cells. Flow cytometric analysis of number of cells stained positive for Ki67 in fully confluent cultures RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells……………. Expression of aquaporin-1 (AQP-1) and calbindin (CAL) in various populations of renal tubular cells……………………………………………………………….

Light level microscopy of spheroids generated from RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ cells………………………………………………………. Effect of Cd+2 on the viability RPTEC/TERT1 cells exposed to 0, 4.5, 18, 27 and 45 μM Cd+2 for 16 days…………………………………………………63 III-23. Light level microscopy of CD133+CD24+ cells treated with 4.5 and 9µM Cd2+ for 34 days…………………………………………………………………. Light level microscopy of CD24+ cells treated with 4.5 and 9µM Cd2+ for 34 days………………………………………………………………………………….

Effect of cadmium on the viability RPTEC/TERT1 cells……………………67 x III-26. Effect of cadmium on the viability of various populations of renal tubular cells…………………………………………………………………………………. Light level microscopy of RPTEC/TERT1 cells plated with matrigel in a 48- well plate……………………………………………………………………………. Light level microscopy of CD133+CD24+ cells plated with matrigel in a 48- well plate…………………………………………………………………………….

Light level microscopy of CD24+ cells plated with matrigel in a 48-well plate…………………………………………………………………………. Light level microscopy of HPT cells plated with matrigel in a 48-well plate. Light level microscopy of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells plated on the surface of thin matrigel coated 48-well plate…………………………. Immunohistochemical analysis of proximal tubule stem cell markers in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice………………………72 III-33.

Immunohistochemical analysis of tubular markers in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice………………………………………………73 III-34. Immunohistochemical analysis of keratin proteins, filament protein and nephron development marker in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice……………………………………….74 xi LIST OF TABLES Table Page II-1. List of primary antibodies used for western blot. List of primary antibodies used for immunofluorescence.

List of primary antibodies used for immunohistochemistry.32 xii ACKNOWLEDGEMENTS I would first like to thank Dr. Don Sens who accepted me as a graduate student in his lab and provided me with an opportunity to gain extensive knowledge and training on science and research. Joe Provost, my undergraduate advisor, I would have never imagined going to graduate school, so much thanks to him. I would like to thank my advisors Dr.

Seema Somji as well as Dr. Scott Garrett for providing insightful guidance on my research, training on different cellular and molecular biology techniques and being available anytime to answer my questions. My special thanks to Dr. Seema Somji for believing in my potentials and providing me with tremendous encouragement throughout my graduate degree career.

I am overwhelmed and fortunate to be a part of this department who recognized my abilities and allowed me to thrive as a researcher. I would like to thank Dr. Jane Dunlevy for training me with her expertise in confocal microscopy and Dr. Zhou and Ms.

Wang for helping me with animal handling techniques and taking immunohistological images. I would like to thank Dr. Min Wu and Dr. Kathy Sukalski for giving their time to talk about how to succeed in graduate school when I first started the program.

I would like to extend many thanks to Dr. Tristan Darland for his willingness to become my faculty at large. Thank you to Steve for providing me extensive training on flow cytometry. xiii I am extremely grateful and thankful to Dr.

Mary Ann Sens and Dr. Don Sens for the support they offered me during my difficult times. I will never be able to repay their kindness. I considered myself extremely lucky for having one of the most amazing lab mates and colleagues, Menglan, Bethany, Andrea, Emily, Zach as well as other lab members.

I don’t miss being far away from home and family because of them. Lastly, I thank my parents for all their sacrifices and my brother and sister-in-law for always supporting me. I love them all and they will forever be in my heart. xiv ABSTRACT The proximal tubules of the kidney are target sites of injury by various toxicants.

Cadmium (Cd2+), an environmental nephrotoxicant can cause adverse effects and overt renal damage. To decipher the mechanisms involved in nephrotoxicity, an in-vitro model system is required. Mortal cultures of human proximal tubule (HPT) cells isolated from the renal cortex are used as models, but are difficult to acquire and have limited passage number. The immortalized HK-2 cell line, has served as a model but it lacks vectorial active transport and shows signs of lost epithelial features.

Recently a new proximal tubule cell line, the RPTEC/TERT1, was developed. For this study we performed global gene expression analysis of this cell line in comparison to the HK-2 and HPT cells showed that the RPTEC/TERT1 cells had gene expression patterns similar to HPT cells when compared to the HK-2 cells. The HPT and the RPTEC/TERT1 cell lines showed higher expression of renal stem/progenitor like cell population, CD133+CD24+ when compared to the HK-2 cells. The level of expression of tight junctional molecules was also similar between the RPTEC/TERT1 and the HPT cells.

Acute exposure to Cd2+ resulted in necrosis of the RPTEC/TERT1 cells whereas the HK-2 cells died by apoptosis. Thus, we verified that the RPTEC/TERT1 are similar to HPT cells and can serve as a good model system to study mechanisms involved in Cd2+ induced renal damage. Recent studies suggest that tubular regeneration after toxic insult may involve progenitor/ stem like cells expressing CD133 as well as CD24 markers that resides among the renal tubular cells. Our previous study shows that the RPTEC/TERT1 cells comprise of 25-30% of CD24+ cells whereas 70-75% of the CD133+CD24+ cells.

To determine the response of these populations xv of cells to renal insult, the two populations of cells were sorted from the RPTEC/TERT1 cells, following which they were cultured and treated with 4.5μM and 9μM Cd2+ for approximately 34 days. The results demonstrate that the CD133+CD24+ cells are more resistant to cadmium exposure as there was no change in the number of double positive cells in response to cadmium treatment whereas the number of CD24+ cells significantly decrease. Both populations of cells form domes in culture indicative of vectorial active transport. The CD133+CD24+ cells show faster growth rate when compared to the CD24+ cells.