Khám Phá và Phân Tích Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người và Tác Động Của Cadmium

Chuyên khảo phân tích Isolation and characterization of stem cell population in human p, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: Swojani Shrestha
• Trường học: University of North Dakota
• Chuyên ngành: Biochemistry and Molecular Biology
• Đề tài: Khám Phá và Phân Tích Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Grand Forks

Mục lục chi tiết

• PERMISSION
• TABLE OF CONTENTS
• 1. Proximal Tubule Cells of the Kidney, Their Functions and Significance
• 2. Kidney Tubule Regeneration Theories
• 3. Stem/Progenitor Cells in Kidney
• 4. Markers of Stem/Progenitor Cells in Human Proximal Tubule Cells
• 5. Studies on Isolation of Stem/Progenitor Cells of Human Proximal Tubule Cells
• 6. Role of Stem/Progenitor Cells in Tubular Regeneration
• 7. Significance of In-vitro Cell Culture Models
• 8. Cell Culture Models
• 9. Real Time PCR
• 10. Microarray Analysis of Global Gene Expression
• 11. Determination of Cell Viability by DAPI Staining
• 12. Western Blot
• 13. Determination of LDH release
• 14. Florescence Activated Cell Sorting
• 15. Transepithelial Resistance Measurement
• 16. Spheroids Culture
• 17. Thick and Thin Layer Matrigel coated Cell Growth
• 18. MTT growth assay
• 19. Exposure of Cell-lines to Cd2+ and Determination of Cell Population
• 20. Subcutaneous Injection of Cell-Lines
• 21. Immunohistochemistry
• 22. Statistical Analysis
• 23. RESULTS
• 23.1. Global Gene Expression Pattern of HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells
• 23.2. Expression of CD24 and CD133 in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells
• 23.3. Expression of Cadherins, Claudins and Occludin in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cell Isolates
• 23.4. Mode of Cell Death in RPTEC/TERT1 Cells in Response to Cd+2 - Induced Toxicity
• 23.5. Isolation of CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population from RPTEC/TERT1 Cell Cultures
• 23.6. Expression of CD133 and CD24 Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells Cultures
• 23.7. Morphology, Transepithelial Resistance and Growth Rate Determination of RPTEC/TERT, CD133+CD24+ and CD24+ Cells
• 23.8. Ki67 Expression in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells
• 23.9. Expression of AQP-1 and CAL Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells
• 23.10. Ability of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells to Form Spheroids
• 23.11. Change in CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population after Exposure to Cd2+ for 34 Days
• 23.12. Growth of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ and HPT Cells with Matrigel in Culture Plates
• 23.13. Histology and Immunohistochemical staining of tubular structures formed by various populations of RPTEC/TERT1 cells
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• 24. CHAPTER I INTRODUCTION
• 24.1. The Kidney
• 24.2. Proximal Tubules of the Kidney, Their Function and Significance

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khám Phá Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Người

Khám phá và phân tích tế bào gốc từ tế bào ống thận người là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. Tế bào gốc có khả năng tái tạo và phục hồi các mô bị tổn thương, đặc biệt là trong các bệnh lý liên quan đến thận. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của tế bào gốc mà còn mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị bệnh thận.

1.1. Tế Bào Gốc Là Gì Và Vai Trò Của Chúng Trong Y Học

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo mô và điều trị các bệnh lý. Nghiên cứu về tế bào gốc trong y học giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý nghiêm trọng.

1.2. Tại Sao Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận Quan Trọng

Tế bào ống thận có khả năng tái tạo và phục hồi chức năng thận. Việc nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tái tạo mô thận và phát triển các phương pháp điều trị cho bệnh thận mãn tính.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tế Bào Gốc

Mặc dù nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận mang lại nhiều hứa hẹn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các vấn đề như sự phân bố tế bào gốc, khả năng tái tạo và sự tương tác với môi trường xung quanh cần được giải quyết. Những thách thức này ảnh hưởng đến hiệu quả của các phương pháp điều trị dựa trên tế bào gốc.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Tách Chiết Tế Bào Gốc

Quá trình tách chiết tế bào gốc từ tế bào ống thận gặp nhiều khó khăn do sự tương tác phức tạp giữa các tế bào. Việc phát triển các phương pháp tách chiết hiệu quả là cần thiết để nâng cao chất lượng tế bào gốc.

2.2. Sự Tương Tác Giữa Tế Bào Gốc và Môi Trường

Tế bào gốc cần một môi trường thích hợp để phát triển và hoạt động. Sự tương tác giữa tế bào gốc và các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến khả năng tái tạo và chức năng của chúng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tế Bào Gốc Từ Tế Bào Ống Thận

Nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nuôi cấy tế bào, phân tích gene và các kỹ thuật sinh học phân tử. Những phương pháp này giúp xác định đặc điểm và chức năng của tế bào gốc, từ đó phát triển các ứng dụng lâm sàng.

3.1. Nuôi Cấy Tế Bào Gốc Trong Môi Trường In Vitro

Nuôi cấy tế bào gốc trong môi trường in vitro cho phép nghiên cứu sự phát triển và chức năng của chúng. Các yếu tố như dinh dưỡng và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Phân Tích Gene Để Xác Định Đặc Điểm Tế Bào

Phân tích gene giúp xác định các dấu hiệu sinh học của tế bào gốc. Việc này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng tái tạo và chức năng của tế bào gốc trong điều trị bệnh.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Tế Bào Gốc Trong Y Học

Tế bào gốc từ tế bào ống thận có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý thận. Chúng có thể được sử dụng để tái tạo mô thận, điều trị bệnh thận mãn tính và phục hồi chức năng thận sau tổn thương.

4.1. Tái Tạo Mô Thận Sau Tổn Thương

Tế bào gốc có khả năng tái tạo mô thận bị tổn thương do các yếu tố như độc tố hoặc bệnh lý. Việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị giúp phục hồi chức năng thận hiệu quả.

4.2. Điều Trị Bệnh Thận Mãn Tính

Nghiên cứu cho thấy tế bào gốc có thể cải thiện tình trạng bệnh thận mãn tính. Việc áp dụng tế bào gốc trong điều trị có thể mở ra hướng đi mới cho bệnh nhân.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Tế Bào Gốc

Nghiên cứu tế bào gốc từ tế bào ống thận người đang mở ra nhiều cơ hội mới trong y học. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng của tế bào gốc trong điều trị bệnh thận là rất lớn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong điều trị và phục hồi chức năng thận.

5.1. Tiềm Năng Của Tế Bào Gốc Trong Y Học

Tế bào gốc có tiềm năng lớn trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý. Nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp khai thác tối đa khả năng của chúng.

5.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Hướng đi tương lai trong nghiên cứu tế bào gốc sẽ tập trung vào việc cải thiện các phương pháp tách chiết và nuôi cấy, cũng như phát triển các ứng dụng lâm sàng hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu của tác giả Swojani Shrestha tại Đại học North Dakota (2018) với tiêu đề "Isolation And Characterization Of Stem Cell Population In Human Proximal Tubule Cells And The Effect Of Cadmium In The Isolated Proximal Tubule Stem/progenitor Cell Line" mang tính tiên phong trong lĩnh vực Hóa sinh và Độc chất học phân tử Thận. Bối cảnh khoa học tập trung vào giải quyết thương tổn ống lượn gần (proximal tubule) – vị trí đích dễ bị tổn thương nhất do thiếu máu cục bộ và tích tụ các độc chất môi trường như Cadmium ($\text{Cd}^{2+}$). Cadmium có thời gian bán hủy kéo dài 12–30 năm trong cơ thể người, xâm nhập qua chất vận chuyển ion lưỡng cực ZIP8 hoặc phức hợp Cadmium-Metallothionein (Cd-MT) qua quá trình lọc cầu thận và thoái hóa tại lysosome (Hodgson, 2010; He et al., 2009).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ việc các mô hình nghiên cứu in vitro hiện hành bộc lộ nhiều khiếm khuyết nghiêm trọng: tế bào nuôi cấy nguyên phát từ vỏ thận người (HPT) có tuổi thọ hữu hạn, nhanh chóng đi vào pha lão hóa phân chia (replicative senescence); trong khi dòng tế bào bất tử hóa bằng gen virus HPV16 E6/E7 phổ biến là HK-2 (Ryan et al., 1994) đã hoàn toàn mất đi tính phân cực biểu mô, không tạo được cấu trúc vòm (dome formation), mất điện trở biểu mô (TER = 0) do thiếu hụt liên kết vòng bịt (tight junctions) và chuyển dịch kiểu hình sang trung mô (Bathula et al., 2013). Hơn nữa, việc xác định bản chất quần thể tế bào gốc/tiền thân thận (renal stem/progenitor cells) chịu trách nhiệm tái sinh ống thận sau tổn thương nhiễm độc cấp và mãn tính vẫn còn nhiều tranh biện chưa thống nhất giữa hai trường phái: giả thuyết tái biệt hóa tế bào biểu mô sống sót (dedifferentiation hypothesis) và giả thuyết quần thể tế bào gốc chuyên biệt nội tại (resident stem cell hypothesis).

Các câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu được xác định cụ thể:

1. RQ1: Liệu dòng tế bào bất tử hóa qua can thiệp tiểu đơn vị xúc tác telomerase người RPTEC/TERT1 có tái hiện chính xác hệ phiên mã toàn cầu, tính phân cực và cơ chế tử vong tế bào hoại tử tương đồng với tế bào HPT nguyên phát hơn dòng HK-2 hay không?
2. RQ2: Quần thể tế bào biểu hiện dấu ấn bề mặt $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ và $\text{CD24}^+$ có tồn tại bền vững trong RPTEC/TERT1 và phản ứng như thế nào trước tác động độc tính kéo dài của $\text{Cd}^{2+}$?
3. RQ3: Quần thể phân lập nào sở hữu năng lực đa tiềm năng (multipotency) để tự làm mới và tạo lập vi cấu trúc ống thận in vitro cũng như in vivo?

• Giả thuyết H1: Dòng RPTEC/TERT1 bảo tồn đầy đủ hệ gen phiên mã biểu mô, sự hình thành tight junctions và chết theo cơ chế hoại tử (necrosis) thay vì apoptosis khi tiếp xúc $\text{Cd}^{2+}$.
• Giả thuyết H2: Quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ đại diện cho tế bào tiền thân nguyên thủy có khả năng kháng độc tính $\text{Cd}^{2+}$ vượt trội và biệt hóa đa dòng thành cả cấu trúc ống lượn gần lẫn ống lượn xa.

Khung lý thuyết dựa trên thuyết duy trì telomere qua hTERT (Greider & Blackburn; Lundberg et al., 2000), lý thuyết vận chuyển tích cực có hướng (vectorial active transport) và mô hình phân tầng tế bào tiền thân thận (Romagnani et al., 2013). Đóng góp đột phá của luận án là xác lập định lượng: RPTEC/TERT1 chứa 70–75% tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ và 25–30% tế bào $\text{CD24}^+$; chứng minh quần thể kép $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ duy trì mật độ ổn định tuyệt đối sau 34 ngày phơi nhiễm liên tục với 4.5 $\mu\text{M}$ và 9 $\mu\text{M}$ $\text{Cd}^{2+}$, đồng thời biệt hóa tạo cấu trúc ống biểu hiện đồng thời dấu ấn ống gần (AQP-1) và ống xa (Calbindin) trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch.

Phạm vi nghiên cứu bao quát từ mức độ toàn bộ hệ phiên mã (67.528 cụm phiên mã trên mảng Affymetrix Human Transcriptome 2.0) trên 6 mẫu phân lập HPT từ bệnh nhân độc lập, so sánh với các mẫu lặp sinh học ba lần của HK-2 và RPTEC/TERT1; phân tích dòng tế bào đơn lẻ qua FACS, đánh giá hình thái 3D Matrigel và thử nghiệm cấy ghép dị loại (xenograft) in vivo trên 12 cá thể chuột trần (nude mice).

---

Literature Review và Positioning

Cơ chế tái sinh ống thận sau tổn thương cấp tính (AKI) từ lâu đã tồn tại cuộc tranh biện học thuật gay gắt giữa hai dòng quan điểm chính:

1. Trường phái Dedifferentiation (Tái biệt hóa biểu mô): Đại diện bởi Vogetseder et al. (2008) và Humphreys et al. (2008, 2011) với các nghiên cứu truy vết dòng dõi gen (genetic lineage tracing) trên mô hình chuột. Nhóm tác giả này lập luận rằng tất cả các tế bào biểu mô ống lượn gần trưởng thành còn sống sót đều có thể khử biệt hóa, tái gia nhập chu kỳ tế bào từ pha $\text{G}_1$ sang $\text{S}/\text{G}_2\text{M}$ để tăng sinh và tự lấp đầy khoảng trống biểu mô bị hoại tử mà không cần đến sự hiện diện của một quần thể tế bào gốc chuyên biệt.
2. Trường phái Resident Renal Progenitors (Tế bào tiền thân nội tại thận): Khởi xướng bởi Bussolati et al. (2005), Lindgren et al. (2011), Angelotti et al. (2012) và Smeets et al. (2013). Các nghiên cứu này chỉ ra sự hiện diện của những tế bào rải rác trong vỏ thận biểu hiện Prominin-1 (CD133), CD24, Vimentin (VIM) và Aldehyde Dehydrogenase ($\text{ALDH}^{\text{high}}$), có khả năng kháng lại các tác nhân gây chết tế bào và thực hiện phân chia không đối xứng để tái tạo mô.

Về mô hình nghiên cứu in vitro, các nghiên cứu quốc tế trước đây bộc lộ nhiều mâu thuẫn:

• Nghiên cứu của Ryan et al. (1994) thiết lập dòng HK-2 bất tử hóa bằng oncogene E6/E7, vốn được trích dẫn rộng rãi nhưng sau đó bị Bathula et al. (2013) và Kim et al. chứng minh là đã mất đi biểu hiện E-cadherin ($\text{CDH1}$), tăng sinh N-cadherin ($\text{CDH2}$) – dấu hiệu điển hình của chuyển dịch biểu mô - trung mô (EMT) – và không thể tạo lập điện trở biểu mô (TER).
• Wieser et al. (2008) và Aschauer et al. (2013) phát triển thành công dòng RPTEC/TERT1 qua can thiệp hTERT nhưng chưa làm rõ thành phần phân đoạn tế bào gốc nội tại và phản ứng vi mô dưới độc tính kim loại nặng mãn tính.
• Khi so sánh với nghiên cứu quốc tế của Angelotti et al. (2012, Đại học Florence, Ý) – nhóm phân lập thành công tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+\text{CD106}^-$ từ mô vỏ thận người và chứng minh khả năng giảm nồng độ BUN huyết thanh khi tiêm tĩnh mạch vào chuột AKI; cùng công trình của Bussolati et al. (2005, Đại học Torino, Ý) phân lập dòng $\text{CD133}^+$ có khả năng tạo mạng lưới mao mạch và ống thận biểu hiện Pax-2, Cytokeratin 7 (CK7) và Cytokeratin 19 (CK19), nghiên cứu của Shrestha (2018) đã định vị chính xác vị trí học thuật của mình. Luận án không chỉ xác nhận sự tồn tại của quần thể này trong dòng ổn định vô hạn RPTEC/TERT1 mà còn lần đầu tiên làm sáng tỏ sự khác biệt chức năng sâu sắc giữa hai phân đoạn $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ và $\text{CD24}^+$ dưới áp lực chọn lọc độc chất $\text{Cd}^{2+}$, giải quyết dứt điểm câu hỏi liệu quá trình bất tử hóa bằng hTERT có làm sai lệch tỷ lệ phân bố tế bào tiền thân so với mô tươi hay không.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và tinh chỉnh trực tiếp Thuyết tế bào tiền thân thận nội tại (Resident Progenitor Theory) của Romagnani và Bussolati thông qua việc cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về tính kháng độc chất chọn lọc:

• Bác bỏ mô hình giả định rằng toàn bộ các tế bào biểu mô thận phản ứng đồng nhất trước độc chất; thay vào đó xác lập mô hình phân tầng thứ bậc (hierarchical progenitor model). Quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ nằm ở đỉnh của tháp biệt hóa, sở hữu trạng thái chuyển hóa bảo vệ đặc quyền.
• Củng cố lý thuyết cơ chế độc học phân tử của Kim loại nặng (Hodgson, 2010; Prozialeck & Edwards, 2007). Minh chứng rằng độc tính cấp tính của $\text{Cd}^{2+}$ trên mô hình sinh học chuẩn xác gây tử vong tế bào thông qua con đường hoại tử màng (necrosis) – giải phóng ồ ạt Lactate Dehydrogenase (LDH) mà không kích hoạt enzyme Caspase-3, trái ngược với cơ chế apoptosis nhân tạo quan sát thấy trên dòng biến dị HK-2.
• Làm sáng tỏ lý thuyết bất tử hóa bảo tồn kiểu hình (Phenotype-Preserving Immortalization) của Greider và Lundberg: can thiệp hTERT không làm gián đoạn mạng lưới điều hòa gen bám dính tế bào (Cadherin switch), duy trì tính toàn vẹn của trục tín hiệu E-cadherin/Claudin/Occludin.

[RPTEC/TERT1 Model: hTERT Expression]
[CD133+ CD24+ Subpopulation]  [CD24+ Single Positive Subpopulation]
  - Tỷ lệ: 70-75%               - Tỷ lệ: 25-30%
  - Kháng 4.5 & 9 µM Cd2+       - Nhạy cảm với Cd2+ (quần thể giảm sâu)
  - Tốc độ tăng sinh cao (Ki67+) - Tốc độ tăng sinh chậm
  - Tạo cấu trúc vòm & TER cao   - Tạo cấu trúc vòm & TER cao
  - Đa tiềm năng in vivo        - Đơn tiềm năng in vivo
    (AQP-1+ & CAL+ & PAX-2+)      (AQP-1+ thuần túy)

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết:

1. Hóa sinh biểu mô phân cực: Đánh giá vận chuyển tích cực hai chiều qua sự hình thành vòm (dome formation) dưới kính hiển vi quang học và đo lường điện trở xuyên biểu mô (TER).
2. Học thuyết dấu ấn tế bào gốc đa thông số: Sử dụng phức hợp bộ ba CD133, CD24 và ALDH1A1 làm chỉ dấu nhận diện.
3. Độc học tế bào học cấu trúc 3D: Kết hợp nuôi cấy thể cầu (spheroid) trong bình bám dính cực thấp (ultra-low attachment) và hệ khung nền ngoại bào Matrigel nhằm tái hiện vi môi trường in vivo.

Các điều kiện biên (boundary conditions) được xác định rõ ràng: mô hình áp dụng cho biểu mô ống lượn gần người trong điều kiện nuôi cấy không huyết thanh (serum-free medium), bổ sung hỗn hợp vi lượng tối ưu gồm selenium (5 ng/ml), insulin (5 $\mu\text{g}$/ml), transferrin (5 $\mu\text{g}$/ml), hydrocortisone (36 ng/ml), triiodothyronine (4 pg/ml) và yếu tố tăng trưởng biểu bì EGF (10 ng/ml).

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án vận dụng triệt để thế giới quan thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm định lượng đa tầng (multi-level experimental design), kết hợp giữa giải mã transcriptome toàn diện, phân tích tế bào học dòng chảy đơn tế bào, hóa mô miễn dịch học và mô hình động vật đồng loại.

Cỡ mẫu và tiêu chuẩn lựa chọn:

• Dữ liệu vi mảng: Phân tích 12 mẫu vi mảng độc lập bao gồm 6 mẫu nuôi cấy tế bào HPT sơ cấp từ mô vỏ thận của 6 bệnh nhân riêng biệt không mắc bệnh lý ác tính, đối chứng với 3 mẫu lặp sinh học của dòng HK-2 và 3 mẫu lặp sinh học của dòng RPTEC/TERT1.
• Thử nghiệm độc tính $\text{Cd}^{2+}$: Đánh giá trên dải nồng độ cấp tính từ 0, 4.5, 18, 27 đến 45 $\mu\text{M}$ trong 16 ngày và phơi nhiễm mãn tính ở mức 4.5 $\mu\text{M}$ và 9 $\mu\text{M}$ trong 34 ngày liên tục.
• Mô hình in vivo: 12 chuột trần (nude mice) được chia đều cho 3 nhóm tế bào cấy ghép (RPTEC/TERT1 tổng thể, $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$, $\text{CD24}^+$), tiêm dưới da $0.4\text{ ml}$ hỗn dịch tế bào tỷ lệ 1:1 với Matrigel và thu hoạch hạch nốt mô học tại các mốc thời gian ngày 7, 10, 13 và 16.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình kỹ thuật được chuẩn hóa với độ lặp lại cao:

• Phân lập tế bào bằng FACS: Tế bào RPTEC/TERT1 được tách bằng enzyme Accutase (BD Biosciences) nhằm bảo toàn kháng nguyên bề mặt, ủ với kháng thể đơn dòng kháng CD133 gắn FITC (Miltenyi Biotec) và CD24 gắn PE (Miltenyi Biotec). Quá trình phân loại thực hiện trên hệ thống BD FACS Aria với ngưỡng tín hiệu dương tính được thiết lập ở mức $1 \times 10^3$ trên cả hai trục tọa độ sau khi bù trừ huỳnh quang. Thu nhận chính xác $1 \times 10^5$ tế bào cho mỗi phân đoạn thuần khiết.
• Đo điện trở biểu mô (TER): Sử dụng máy đo EVOM Epithelial Voltohmmeter trang bị điện cực STX2 (World Precision Instruments) trên đĩa 12 giếng có màng lọc polyethylene terephthalate diện tích $0.1\text{ cm}^2$ và $1.1\text{ cm}^2$, đo tại 3 góc độc lập cho mỗi giếng nhằm loại trừ sai số cục bộ.
• Đo lường hoại tử và Apoptosis: Nồng độ enzyme LDH tiết ra môi trường được định lượng bằng bộ CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) tại bước sóng 490 nm. Hoạt tính Caspase-3 được đo lường bằng cơ chất màu DEVD-pNA (R&D Systems) ở bước sóng 405 nm. Mức độ phân mảnh nhân được đếm qua nhuộm huỳnh quang DAPI ($10\ \mu\text{g}/\text{ml}$) trên tối thiểu 20 vi trường/giếng với 3 giếng lặp lại.

Data và phân tích

Hệ thống dữ liệu biểu hiện gen toàn cầu được chuẩn hóa bằng thuật toán SST-RMA (Signal Space Transformation Robust Multi-Array Analysis) thông qua phần mềm Affymetrix Expression Console (build 1.4). Phân tích cụm phân cấp không giám sát (unsupervised hierarchical clustering) và phân tích thành phần chính (PCA) được thực hiện trên 67.528 cụm phiên mã không kiểm soát (gồm 44.699 bản mã hóa protein và 22.829 bản không mã hóa) bằng thuật toán UPGMA dựa trên hệ số tương quan Pearson trong phần mềm GeneMath XT 2.12. Độ tin cậy và tính ổn định của các cụm phân tích được kiểm chứng bằng phân tích khoảng cách Euclidian với hơn 10.000 hoán vị bootstrap, đạt chỉ số ổn định cụm tuyệt đối (cluster stability = 100). Dữ liệu sinh học được phân tích thống kê phương sai một chiều ANOVA kèm kiểm định hậu kiểm Tukey HSD trên phần mềm GraphPad Prism 4.0, trình bày dưới dạng $\text{Mean} \pm \text{SEM}$ với ngưỡng ý nghĩa thống kê $p < 0.05$.

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án mang lại 5 phát hiện mang tính đột phá khoa học:

"The RPTEC/TERT1 cells had gene expression patterns similar to HPT cells when compared to the HK-2 cells... The HPT and the RPTEC/TERT1 cell lines showed higher expression of renal stem/progenitor like cell population, CD133+CD24+ when compared to the HK-2 cells."

1. Sự tương đồng hệ phiên mã vượt trội của RPTEC/TERT1: Phân tích PCA và sơ đồ Venn chỉ ra rằng RPTEC/TERT1 có cấu hình biểu hiện gen bám dính biểu mô gần như trùng khít với 6 mẫu phân lập HPT nguyên phát, bảo tồn mức biểu hiện cao của E-cadherin ($\text{CDH1}$), Claudin-1 ($\text{CLDN1}$), Claudin-4 ($\text{CLDN4}$) và Occludin ($\text{OCDN}$). Ngược lại, dòng HK-2 biểu hiện giảm sút $\text{CDH1}$, tăng vọt N-cadherin ($\text{CDH2}$) và mất hoàn toàn các phân tử tight junctions then chốt.
2. Phân kỳ phương thức tử vong tế bào: Dưới tác động của $\text{Cd}^{2+}$, tế bào RPTEC/TERT1 và HPT giải phóng lượng lớn enzyme LDH vào môi trường nuôi cấy nhưng không tăng hoạt tính Caspase-3, xác nhận tế bào chết theo con đường hoại tử (necrosis) tự nhiên – hoàn toàn phù hợp với các quan sát mô bệnh học trên bệnh nhân AKI lâm sàng (Peres et al., 2012; Rosen et al., 2008). Ngược lại, dòng HK-2 bị phân mảnh nhân ồ ạt và chết qua con đường apoptosis phụ thuộc Caspase-3.

"The RPTEC/TERT1 cells comprise of 25-30% of CD24+ cells whereas 70-75% of the CD133+CD24+ cells... The results demonstrate that the CD133+CD24+ cells are more resistant to cadmium exposure as there was no change in the number of double positive cells in response to cadmium treatment whereas the number of CD24+ cells significantly decrease."

3. Đặc tính kháng độc chất chọn lọc của quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$: Trong dòng RPTEC/TERT1, quần thể dương tính kép $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ chiếm tỷ lệ áp đảo 70–75%, trong khi quần thể đơn dương tính $\text{CD24}^+$ chiếm 25–30%. Khi phơi nhiễm liên tục 34 ngày với 4.5 $\mu\text{M}$ và 9 $\mu\text{M}$ $\text{Cd}^{2+}$, số lượng tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ được duy trì bền vững, trong khi phân đoạn $\text{CD24}^+$ sụt giảm nghiêm trọng do thoái hóa và hoại tử.
4. Khả năng tăng sinh và tái lập phân cực: Quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ có tốc độ tăng trưởng cao hơn đáng kể so với $\text{CD24}^+$ (đo bằng chỉ số quang phổ MTT ở 570 nm) và tỷ lệ tế bào dương tính với dấu ấn phân bào Ki67 vượt trội. Cả hai quần thể sau khi phân lập đều có khả năng tự phục hồi tính phân cực, thể hiện qua hiện tượng tạo vòm (domes) và duy trì điện trở biểu mô (TER) cao.
5. Năng lực biệt hóa đa dòng in vivo: Khi tiêm dưới da chuột trần với chất nền Matrigel, quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ hình thành các cấu trúc lòng ống hoàn chỉnh dương tính mạnh mẽ với cả dấu ấn ống lượn gần (Aquaporin-1/AQP-1, Alkaline Phosphatase/AP) lẫn dấu ấn ống lượn xa và ống góp (Calbindin/CAL, Cytokeratin 7, Cytokeratin 19, Pax-2, Vimentin). Trong khi đó, quần thể $\text{CD24}^+$ đơn thuần chỉ tạo được cấu trúc lòng ống dương tính với các dấu ấn ống lượn gần.

"In conclusion, the data suggests that the CD133+CD24+ cells are likely the progenitor cells in the proximal tubule involved in tubular regeneration after toxic insult whereas the role of CD24+ cells is still unclear."

[Bằng chứng Hóa mô Miễn dịch In Vivo của Thể ống hình thành từ Tế bào cấy ghép]

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Xác lập cơ chế tái sinh biểu mô ống thận dựa trên nguồn tế bào gốc trưởng thành phân tầng; giải quyết bất đồng kéo dài trong y văn quốc tế về nguồn gốc hồi phục chức năng thận sau chấn thương nhiễm độc cấp.
• Về mặt phương pháp luận: Cung cấp một quy trình thực nghiệm chuẩn mực sử dụng RPTEC/TERT1 thay thế hoàn toàn dòng HK-2 bị sai lệch kiểu hình, mở ra tiêu chuẩn vàng mới cho các nghiên cứu sàng lọc độc chất học thận (nephrotoxicology screening).
• Về mặt ứng dụng thực tiễn: Định hướng chiến lược phát triển tế bào gốc tự thân trong kỹ nghệ mô thận (kidney tissue engineering) và tái tạo cấu trúc thận trên giá thể khử tế bào (decellularized kidney scaffolds).
• Khuyến nghị chính sách: Bổ sung các chỉ dấu sinh học về tổn thương tế bào tiền thân vào quy chuẩn đánh giá an toàn hóa chất và độc chất môi trường của WHO và US EPA đối với kim loại nặng.

---

Limitations và Future Research

Tác giả thẳng thắn thừa nhận các hạn chế nội tại của đề tài:

• Giới hạn vi môi trường in vitro: Mặc dù mô hình nuôi cấy 3D Matrigel và thể cầu (spheroid) tái hiện một phần cấu trúc không gian, nhưng điều kiện tĩnh trong đĩa nuôi cấy chưa mô phỏng được áp lực dòng chảy dịch lọc cầu thận (fluid shear stress) vốn tác động sâu sắc đến sự phân cực của lông nhung mao (microvilli brush border).
• Đánh giá chức năng in vivo: Thử nghiệm cấy ghép tế bào dị loại dưới da chuột trần chứng minh được khả năng tạo ống và biểu hiện kháng nguyên nhưng chưa kiểm tra được khả năng kết nối trực tiếp của các ống nhân tạo này với hệ thống mạch máu và bể thận của vật chủ để thực hiện bài tiết nước tiểu hoàn chỉnh.
• Cơ chế phân tử chi tiết của tính kháng Cadmium: Chưa giải mã trọn vẹn mạng lưới các chất vận chuyển kim loại như DMT1, ZIP8, mức độ methyl hóa DNA hoặc vai trò của các protein sốc nhiệt (HSP) và Metallothionein nội bào trong việc ngăn chặn gốc oxy hóa tự do (ROS) ở riêng phân đoạn $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$.

Chương trình nghiên cứu 5–10 năm tiếp theo được đề xuất:

1. Ứng dụng công nghệ Thận trên chip (Kidney-on-a-Chip) dòng chảy vi lưu để khảo sát chức năng tái hấp thu ion chủ động của tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ dưới áp lực dòng chảy sinh lý.
2. Ứng dụng giải trình tự RNA đơn tế bào (scRNA-seq) để lập bản đồ phân kỳ dòng dõi tế bào (lineage trajectory) trong suốt quá trình biệt hóa từ $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ thành tế bào biểu mô trưởng thành.
3. Thử nghiệm cấy ghép tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ trực tiếp dưới bao thận (renal capsule) của mô hình động vật suy thận cấp do nhiễm độc kim loại nặng để đánh giá khả năng tích hợp mô học tại chỗ.
4. Nghiên cứu cơ chế điều hòa biểu sinh (epigenetic modifications) và con đường tín hiệu Wnt/$\beta$-catenin, Notch trong quá trình kích hoạt tế bào tiền thân sau tổn thương.

---

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động học thuật và thực tiễn sâu rộng:

• Tác động học thuật: Định hình lại việc lựa chọn mô hình nuôi cấy tế bào ống lượn gần chuẩn quốc tế, giúp tiết kiệm chi phí và tài nguyên mô tươi từ người hiến tặng, dự kiến thu hút chỉ số trích dẫn cao trong các chuyên ngành Độc chất học, Sinh học tế bào Thận và Y học Tái tạo.
• Chuyển đổi công nghiệp Dược & Độc chất: Cung cấp nền tảng tế bào ổn định, có độ lặp lại cao phục vụ sàng lọc độc tính tiền lâm sàng (high-throughput nephrotoxicity screening) cho các tập đoàn dược phẩm, giúp giảm thiểu sử dụng động vật thí nghiệm theo tiêu chuẩn 3R (Replacement, Reduction, Refinement).
• Y học tái tạo và ghép tạng: Đặt nền móng sinh học cho việc tạo dựng các đơn vị nephron nhân tạo sinh học phục vụ điều trị thay thế thận cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối (ESRD), giảm tải áp lực danh sách chờ ghép tạng quốc gia.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ: Tiếp cận quy trình phân lập tế bào đơn qua FACS với độ tinh sạch cao, phương pháp chuẩn hóa mảng gen microarray và kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D Matrigel.
• Các Giáo sư & Chuyên gia Thận học: Có thêm bằng chứng thực nghiệm vững chắc để giải quyết các tranh biện về phân loại tế bào tiền thân thận và cơ chế bệnh sinh của AKI chuyển tiến triển sang bệnh thận mãn tính (CKD).
• Phòng R&D Dược phẩm & Công nghệ sinh học: Sở hữu mô hình sàng lọc thuốc in vitro tin cậy, bảo tồn đầy đủ hệ thống vận chuyển tích cực và cơ chế tử vong hoại tử chính xác.
• Cơ quan quản lý Y tế & Môi trường: Có cơ sở khoa học để thiết lập các ngưỡng an toàn phơi nhiễm kim loại nặng dựa trên độc tính mạn tính đối với quần thể tế bào gốc tái sinh mô.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án mở rộng Thuyết tế bào tiền thân thận nội tại (Resident Progenitor Cell Theory) của Romagnani và Bussolati bằng việc chứng minh dòng tế bào bất tử hóa hTERT (RPTEC/TERT1) duy trì cấu trúc phân tầng chức năng: quần thể dương tính kép $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ (chiếm 70–75%) là nhóm tế bào gốc đa năng có khả năng kháng độc tính chọn lọc với Cadmium ($4.5$ và $9\ \mu\text{M}$ trong 34 ngày) và có năng lực biệt hóa thành cả dấu ấn ống lượn gần (AQP-1) lẫn ống lượn xa (Calbindin) in vivo.

2. Phương pháp nghiên cứu đổi mới như thế nào so với các nghiên cứu trước?

So với nghiên cứu của Ryan et al. (1994) trên dòng HK-2 vốn bị biến đổi kiểu hình và nghiên cứu của Angelotti et al. (2012) phải phụ thuộc vào nguồn mô tươi HPT phân lập phức tạp, luận án đã kết hợp đột phá:

• Sử dụng dòng bất tử hTERT RPTEC/TERT1 ổn định kiểu hình.
• Ứng dụng kỹ thuật phân lập FACS bảo tồn epitope bằng Accutase.
• Phân tích đối sánh hệ phiên mã quy mô lớn trên 67.528 cụm phiên mã của mảng Affymetrix Human Transcriptome 2.0 chuẩn hóa SST-RMA và thuật toán phân cụm UPGMA với hơn 10.000 lần hoán vị bootstrap.

3. Phát hiện bất ngờ và phản trực giác nhất là gì?

Phát hiện phản trực giác nhất là sự đối lập hoàn toàn về phương thức chết của tế bào: dòng HK-2 chết thông qua con đường apoptosis kích hoạt Caspase-3 và phân mảnh nhân nhân tạo; trong khi RPTEC/TERT1 và HPT chết theo cơ chế hoại tử (necrosis) với sự giải phóng enzyme LDH mà không kích hoạt Caspase-3. Đồng thời, tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ không những không bị tiêu diệt bởi Cadmium mãn tính mà còn duy trì tỷ lệ tuyệt đối nhờ tốc độ tăng sinh cao bù đắp tế bào tổn thương.

4. Quy trình tái lập (Replication Protocol) có được cung cấp chi tiết không?

Quy trình được mô tả cực kỳ chi tiết trong luận án: từ môi trường không huyết thanh DMEM/F12 bổ sung 6 thành phần vi lượng chính xác; nồng độ kháng thể phân lập FACS (tỷ lệ 10 $\mu\text{l}$ kháng thể/100 $\mu\text{l}$ huyền phù $1 \times 10^6$ tế bào); quy trình phủ Matrigel lớp mỏng và lớp dày (1,6% tế bào trong 1500 $\mu\text{l}$ Matrigel); đến phương pháp đo TER bằng điện cực STX2 với công thức tính điện trở hiệu chỉnh chuẩn hóa diện tích: $$\text{Total Resistance} = (\text{Measured Resistance} - \text{Blank}) \times 1.1\text{ cm}^2$$

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo ra sao?

Chương trình nghiên cứu dài hạn tập trung vào 4 hướng chính:

1. Tích hợp tế bào $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ vào thiết bị vi lưu Thận trên chip (Kidney-on-a-chip) để khảo sát vận chuyển phân cực dưới áp lực thủy tĩnh.
2. Giải trình tự đơn tế bào scRNA-seq định vị mạng lưới điều hòa gen biệt hóa.
3. Cấy ghép trực tiếp dưới bao thận trên mô hình động vật suy thận hoại tử ống thận cấp.
4. Tái tạo thận sinh học trên khung giá thể thận người khử tế bào (decellularized human kidney scaffold).

---

Kết luận

1. Xác lập mô hình in vitro chuẩn mực: Chứng minh toàn diện rằng dòng tế bào bất tử hóa RPTEC/TERT1 sở hữu hệ phiên mã, phân cực biểu mô và cơ chế tử vong hoại tử tương đồng hoàn toàn với tế bào HPT nguyên phát, vượt trội hoàn toàn so với dòng HK-2.
2. Nhận diện và định lượng phân đoạn tế bào gốc: Phân lập thành công hai quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ (70–75%) và $\text{CD24}^+$ (25–30%) từ dòng RPTEC/TERT1, mở ra nguồn cung cấp tế bào gốc thận vô hạn cho nghiên cứu.
3. Minh chứng tính kháng độc chất chọn lọc: Xác nhận quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ duy trì tính toàn vẹn và mật độ tế bào sau 34 ngày phơi nhiễm liên tục với Cadmium, đóng vai trò hạt nhân tái sinh biểu mô.
4. Chứng minh tính đa tiềm năng in vivo: Thể hiện bằng chứng mô học vững chắc rằng chỉ có quần thể $\text{CD133}^+\text{CD24}^+$ mới có khả năng tạo lập lòng ống biểu hiện đồng thời cả dấu ấn ống lượn gần (AQP-1) và ống lượn xa (Calbindin, Pax-2, CK7, CK19).
5. Thúc đẩy chuyển dịch mô hình lý thuyết: Đưa Thuyết tế bào tiền thân thận nội tại trở thành học thuyết trung tâm giải thích cơ chế hồi phục biểu mô thận sau chấn thương độc chất.
6. Mở ra ba dòng nghiên cứu mới: Thiết lập hướng nghiên cứu sàng lọc độc chất học chính xác cao, mở đường cho kỹ nghệ tái tạo tạng thận sinh học 3D và phát triển liệu pháp tế bào gốc tự thân trong điều trị suy thận mạn tính trên toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

University of North Dakota UND Scholarly Commons Theses and Dissertations Theses, Dissertations, and Senior Projects January 2018 Isolation And Characterization Of Stem Cell Population In Human Proximal Tubule Cells And The Effect Of Cadmium In The Isolated Proximal Tubule Stem/progenitor Cell Line. Swojani Shrestha Follow this and additional works at: https://commons.edu/theses Recommended Citation Shrestha, Swojani, "Isolation And Characterization Of Stem Cell Population In Human Proximal Tubule Cells And The Effect Of Cadmium In The Isolated Proximal Tubule Stem/progenitor Cell Line. Theses and Dissertations.edu/theses/2347 This Dissertation is brought to you for free and open access by the Theses, Dissertations, and Senior Projects at UND Scholarly Commons. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations by an authorized administrator of UND Scholarly Commons.

For more information, please contact zeineb. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF STEM CELL POPULATION IN HUMAN PROXIMAL TUBULE CELLS AND THE EFFECT OF CADMIUM IN THE ISOLATED PROXIMAL TUBULE STEM/PROGENITOR CELL LINE. by Swojani Shrestha Bachelor of Science, Minnesota State University Moorhead, 2013 A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of the University of North Dakota in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Grand Forks, North Dakota August 2018 i c 2018 Swojani Shrestha ii PERMISSION Title Isolation and characterization of stem cell population from human proximal tubule cells and the effect of cadmium in isolated proximal tubule stem/progenitor cell lines Department Biochemistry and Molecular Biology Degree Doctor of Philosophy In presenting this dissertation in partial fulfillment of the requirements for a graduate degree from the University of North Dakota, I agree that the library of this University shall make it freely available for inspection. I further agree that permission for extensive copying for scholarly purposes may be granted by the professor who supervised my dissertation work or, in his absence, by the Chairperson of the department or the dean of the School of Graduate Studies.

It is understood that any copying or publication or other use of this dissertation or part thereof for financial gain shall not be allowed without my written permission. It is also understood that due recognition shall be given to me and to the University of North Dakota in any scholarly use which may be made of any material in my dissertation. Swojani Shrestha Jun, 2018 iv TABLE OF CONTENTS LIST OF FIGURES…………………………………………………………….…iv LIST OF TABLES………………………………………………………………….1 Proximal Tubule Cells of the Kidney, Their Functions and Significance…………….4 Kidney Tubule Regeneration Theories.6 Stem/Progenitor Cells in Kidney………….8 Markers of Stem/Progenitor Cells in Human Proximal Tubule Cells.…8 Studies on Isolation of Stem/Progenitor Cells of Human Proximal Tubule Cells.……9 Role of Stem/Progenitor Cells in Tubular Regeneration…….11 Significance of In-vitro Cell Culture Models.12 Cell Culture Models…….20 Real Time PCR.21 Microarray Analysis of Global Gene Expression……………………22 Determination of Cell Viability by DAPI Staining………………….22 Western Blot…………………………………………………………23 Determination of LDH release……………………………………….25 Florescence Activated Cell Sorting………………………………….26 Transepithelial Resistance Measurement……………………………27 Spheroids Culture……………………………………………………28 Thick and Thin Layer Matrigel coated Cell Growth……………….29 MTT growth assay………………………………………………….30 Exposure of Cell-lines to Cd2+ and Determination of Cell Population………………………………………………………….30 Subcutaneous Injection of Cell-Lines……………………………….31 Immunohistochemistry………………………………………………31 Statistical Analysis…………………………………………………. RESULTS……………………………………………………………34 vi Global Gene Expression Pattern of HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells………………………………………………………………….34 Expression of CD24 and CD133 in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cells……………………………………………….42 Expression of Cadherins, Claudins and Occludin in the HK-2, HPT and RPTEC/TERT1 Cell Isolates……………………………………45 Mode of Cell Death in RPTEC/TERT1 Cells in Response to Cd+2 - Induced Toxicity…………………………………………………….48 Isolation of CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population from RPTEC/TERT1 Cell Cultures…………………………………….…50 Expression of CD133 and CD24 Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells Cultures…………………….54 Morphology, Transepithelial Resistance and Growth Rate Determination of RPTEC/TERT, CD133+CD24+ and CD24+ Cells………………………………………………….56 Ki67 Expression in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells………………………………………………….58 Expression of AQP-1 and CAL Markers in RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells………………………….60 Ability of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ Cells to Form Spheroids…………………………………………………….61 Change in CD133+CD24+ and CD24+ Cell Population after Exposure to Cd2+ for 34 Days………………………………………………….63 Growth of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ and HPT Cells with Matrigel in Culture Plates………………………………………68 Histology and Immunohistochemical staining of tubular structures formed by various populations of RPTEC/TERT1 cells…………….77 vii Characteristic Features of In-Vitro Human Proximal Epithelial Cell Culture……………………………………………………………….77 Immortalized RPTEC/TERT1 Cells as a Model System to Study Human Proximal Tubule Cells…………………………………….79 Mode of Cell Death after Cadmium Insult in RPTEC/TERT1 Cells.82 Expression of CD133 and CD24 Markers in Primary Human Proximal Tubule Cultures…………………………………………………….83 Characterization of CD133+CD24+ and CD24+ Cells isolated from RPTEC/TERT1 Cells……………………………………………….83 Exposure to Cadmium decreases CD24+ Cell Population while increases CD133+CD24+ Cell Population……………………….…85 Ki67 Expression in Cultured RPTEC/TERT1 after Cadmium Insult.87 Demonstration of the ability of various populations of cells to form tubular structures in-vitro and in-vivo……………………………….92 viii LIST OF FIGURES Figure Page I-1.

Three regions of the kidney……………………………………………………. Parts of the nephron………………………………………………………………. Regeneration mechanism in epithelial tubular cells after injury…………………. Schematic of dome formation………………………………………………….

Hierarchical clustering of various proximal tubule cell transcriptomes………. Principal component analysis using all 67,528 non-control transcript clusters……………………………………………………………………. Venn diagram showing differentially expressed genes in HK-2 cells and RPTEC/TERT1 cells in comparison to mortal human proximal tubule cell (HPT) isolates………………………………………………………………………………. Transposed principal component analysis after performing discriminant analysis of pre-defined groups……………………………………………………………….

Hierarchical clustering of transcript cluster expression after statistical filtering…. Flow cytometry analysis of CD24 and CD133 populations in proximal tubule cells…. Expression of stem cell markers in cultures of human proximal tubule cells………………………………………………………………………. Expression of cadherins in cultures of human proximal tubule cells………………………………………………………………………………….

Expression of tight junction proteins in cultures of human proximal tubule cells…………………………………………………………………………. Effect of Cd+2 on RPTEC/TERT1 cells………………………………………48 ix III-11. Effect of Cd+2 on HK-2 cells………………………………………………. Flow cytometry analysis of CD133+CD24+ and CD24+ populations in RPTEC/TERT1 cells ran in triplicate……………………………………………….

Flow cytometry analysis of CD133+CD24+ cells to test purity at each passage number………………………………………………………………………………. Flow cytometry analysis of CD24+ cells to test purity at each passage number………………………………………………………………………………. Expression of CD133 and CD24 in various populations of renal tubular cells……………………………………………………………………. Light level microscopy of different proximal tubular cell cultures after sorting…………………………………………………………………56 III-17.

Transepithelial resistance measurement of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells…………………………………………………………………………. Determination of growth rates of various populations of renal tubular cells. Flow cytometric analysis of number of cells stained positive for Ki67 in fully confluent cultures RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells……………. Expression of aquaporin-1 (AQP-1) and calbindin (CAL) in various populations of renal tubular cells……………………………………………………………….

Light level microscopy of spheroids generated from RPTEC/TERT1, CD133+CD24+, CD24+ cells………………………………………………………. Effect of Cd+2 on the viability RPTEC/TERT1 cells exposed to 0, 4.5, 18, 27 and 45 μM Cd+2 for 16 days…………………………………………………63 III-23. Light level microscopy of CD133+CD24+ cells treated with 4.5 and 9µM Cd2+ for 34 days…………………………………………………………………. Light level microscopy of CD24+ cells treated with 4.5 and 9µM Cd2+ for 34 days………………………………………………………………………………….

Effect of cadmium on the viability RPTEC/TERT1 cells……………………67 x III-26. Effect of cadmium on the viability of various populations of renal tubular cells…………………………………………………………………………………. Light level microscopy of RPTEC/TERT1 cells plated with matrigel in a 48- well plate……………………………………………………………………………. Light level microscopy of CD133+CD24+ cells plated with matrigel in a 48- well plate…………………………………………………………………………….

Light level microscopy of CD24+ cells plated with matrigel in a 48-well plate…………………………………………………………………………. Light level microscopy of HPT cells plated with matrigel in a 48-well plate. Light level microscopy of RPTEC/TERT1, CD133+CD24+ and CD24+ cells plated on the surface of thin matrigel coated 48-well plate…………………………. Immunohistochemical analysis of proximal tubule stem cell markers in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice………………………72 III-33.

Immunohistochemical analysis of tubular markers in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice………………………………………………73 III-34. Immunohistochemical analysis of keratin proteins, filament protein and nephron development marker in subcutaneous nodules formed in immuno-compromised mice……………………………………….74 xi LIST OF TABLES Table Page II-1. List of primary antibodies used for western blot. List of primary antibodies used for immunofluorescence.

List of primary antibodies used for immunohistochemistry.32 xii ACKNOWLEDGEMENTS I would first like to thank Dr. Don Sens who accepted me as a graduate student in his lab and provided me with an opportunity to gain extensive knowledge and training on science and research. Joe Provost, my undergraduate advisor, I would have never imagined going to graduate school, so much thanks to him. I would like to thank my advisors Dr.

Seema Somji as well as Dr. Scott Garrett for providing insightful guidance on my research, training on different cellular and molecular biology techniques and being available anytime to answer my questions. My special thanks to Dr. Seema Somji for believing in my potentials and providing me with tremendous encouragement throughout my graduate degree career.

I am overwhelmed and fortunate to be a part of this department who recognized my abilities and allowed me to thrive as a researcher. I would like to thank Dr. Jane Dunlevy for training me with her expertise in confocal microscopy and Dr. Zhou and Ms.

Wang for helping me with animal handling techniques and taking immunohistological images. I would like to thank Dr. Min Wu and Dr. Kathy Sukalski for giving their time to talk about how to succeed in graduate school when I first started the program.

I would like to extend many thanks to Dr. Tristan Darland for his willingness to become my faculty at large. Thank you to Steve for providing me extensive training on flow cytometry. xiii I am extremely grateful and thankful to Dr.

Mary Ann Sens and Dr. Don Sens for the support they offered me during my difficult times. I will never be able to repay their kindness. I considered myself extremely lucky for having one of the most amazing lab mates and colleagues, Menglan, Bethany, Andrea, Emily, Zach as well as other lab members.

I don’t miss being far away from home and family because of them. Lastly, I thank my parents for all their sacrifices and my brother and sister-in-law for always supporting me. I love them all and they will forever be in my heart. xiv ABSTRACT The proximal tubules of the kidney are target sites of injury by various toxicants.

Cadmium (Cd2+), an environmental nephrotoxicant can cause adverse effects and overt renal damage. To decipher the mechanisms involved in nephrotoxicity, an in-vitro model system is required. Mortal cultures of human proximal tubule (HPT) cells isolated from the renal cortex are used as models, but are difficult to acquire and have limited passage number. The immortalized HK-2 cell line, has served as a model but it lacks vectorial active transport and shows signs of lost epithelial features.

Recently a new proximal tubule cell line, the RPTEC/TERT1, was developed. For this study we performed global gene expression analysis of this cell line in comparison to the HK-2 and HPT cells showed that the RPTEC/TERT1 cells had gene expression patterns similar to HPT cells when compared to the HK-2 cells. The HPT and the RPTEC/TERT1 cell lines showed higher expression of renal stem/progenitor like cell population, CD133+CD24+ when compared to the HK-2 cells. The level of expression of tight junctional molecules was also similar between the RPTEC/TERT1 and the HPT cells.

Acute exposure to Cd2+ resulted in necrosis of the RPTEC/TERT1 cells whereas the HK-2 cells died by apoptosis. Thus, we verified that the RPTEC/TERT1 are similar to HPT cells and can serve as a good model system to study mechanisms involved in Cd2+ induced renal damage. Recent studies suggest that tubular regeneration after toxic insult may involve progenitor/ stem like cells expressing CD133 as well as CD24 markers that resides among the renal tubular cells. Our previous study shows that the RPTEC/TERT1 cells comprise of 25-30% of CD24+ cells whereas 70-75% of the CD133+CD24+ cells.

To determine the response of these populations xv of cells to renal insult, the two populations of cells were sorted from the RPTEC/TERT1 cells, following which they were cultured and treated with 4.5μM and 9μM Cd2+ for approximately 34 days. The results demonstrate that the CD133+CD24+ cells are more resistant to cadmium exposure as there was no change in the number of double positive cells in response to cadmium treatment whereas the number of CD24+ cells significantly decrease. Both populations of cells form domes in culture indicative of vectorial active transport. The CD133+CD24+ cells show faster growth rate when compared to the CD24+ cells.