Luận văn: Định lượng Coixol trong cam thảo đất bằng HPLC - Phạm Thị Minh Hải

Tài liệu luận văn thạc sĩ trình bày quy trình định tính và định lượng Coixol trong cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) bằng phương pháp HPLC.

• Tác giả: Phạm Thị Minh Hải
• Người hướng dẫn: PGS. Phương Thiện Thương
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định tính và định lượng Coixol trong Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Coixol và Cam thảo đất

Coixol là một hoạt chất sinh học quan trọng được tìm thấy trong cây cam thảo đất (Scoparia dulcis L.), một loại dược liệu truyền thống có giá trị cao trong y học. Coixol sở hữu nhiều tác dụng dược lý nổi bật, bao gồm hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn và hỗ trợ sức khỏe tổng thể. Cây cam thảo đất được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc nam truyền thống và hiện đại. Để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm chứa coixol, việc phát triển phương pháp phân tích định tính và định lượng trở nên cực kỳ cần thiết. Luận văn thạc sĩ dược học từ Trường Đại học Dược Hà Nội đã đề cập đến việc xây dựng phương pháp HPLC chuyên biệt nhằm xác định chính xác hàm lượng coixol trong các mẫu dược liệu.

1.1. Đặc điểm và công dụng cam thảo đất

Cam thảo đất là một cây thuộc họ Scrophulariaceae, phân bố rộng rãi ở các vùng khí hậu ấm. Cây có thành phần hóa học đa dạng bao gồm coixol, alkaloid, sterol và các hợp chất phenolic. Trong y học cổ truyền, cam thảo đất được dùng để chữa trị viêm, hạ sốt và hỗ trợ hệ miễn dịch. Ngoài ra, cây còn có tác dụng kháng oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương.

1.2. Vai trò của coixol trong dược liệu

Coixol là một marker compound quan trọng để đánh giá chất lượng cam thảo đất. Hoạt chất này có khả năng chống viêm rõ rệt và tác dụng kháng khuẩn đáng kể. Việc định lượng coixol chính xác giúp đảm bảo hiệu lực của các sản phẩm chiết xuất từ cam thảo đất và các công thức dược phẩm chứa dược liệu này.

II. Phương pháp HPLC trong phân tích Coixol

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích hiện đại được sử dụng rộng rãi để định tính và định lượng các hợp chất trong các mẫu tự nhiên. HPLC cho phép tách biệt, nhận dạng và đo lường nồng độ coixol với độ chính xác cao và tái lập tốt. Phương pháp này vượt trội hơn các kỹ thuật truyền thống vì có khả năng phân giải tốt, thời gian phân tích nhanh và độ nhạy cao. Trong nghiên cứu của Phạm Thị Minh Hải, phương pháp HPLC đã được xây dựng, thẩm định và áp dụng để phân tích coixol trong cam thảo đất ở các vùng khác nhau tại Việt Nam.

2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm các thành phần chính như hệ thống bơm cao áp, cột sắc ký, bộ dò phát hiện (thường là UV-VIS), và bộ kiểm soát nhiệt độ. Nguyên lý hoạt động dựa trên sự phân chia khác nhau giữa pha động (dung dịch chuyển động) và pha tĩnh (chất để trong cột). Các thành phần trong mẫu sẽ được tách biệt dựa trên sức hút khác nhau với pha tĩnh.

2.2. Điều kiện tối ưu hóa phương pháp HPLC

Để định lượng coixol chính xác, cần tối ưu hóa các tham số như nhiệt độ cột, thành phần pha động, pH dung dịch và tốc độ dòng chảy. Qua khảo sát thực nghiệm, các điều kiện tối ưu được xác định để đạt độ phân giải cao, hệ số đối xứng tốt và số đĩa lý thuyết tối đa. Các tham số chất lượng như LOD (Limit of Detection) và LOQ (Limit of Quantitation) cũng được xác định cụ thể.

III. Quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp

Xây dựng phương pháp HPLC để định tính và định lượng coixol là một quá trình khoa học, có hệ thống gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, cần lựa chọn chất chuẩn coixol độ tinh khiết cao để xây dựng đường chuẩn. Tiếp theo, phương pháp xử lý mẫu được tối ưu hóa để chiết xuất coixol hiệu quả từ cam thảo đất. Sau đó, phương pháp HPLC được thiết lập với các điều kiện tối ưu. Cuối cùng, thẩm định phương pháp được thực hiện để đánh giá độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và tái lập lại của quy trình. Các mẫu thực tế từ các vùng địa lý khác nhau được sử dụng để xác nhận áp dụng của phương pháp.

3.1. Chuẩn bị mẫu và chế tạo dung dịch chuẩn

Mẫu cam thảo đất được thu hái từ các vùng khác nhau tại Việt Nam, bao gồm toàn cây và các bộ phận riêng rẽ (lá, thân, rễ). Các mẫu được sấy khô, nghiền nhuyễn để tăng tính đồng nhất. Chất chuẩn coixol được cân chính xác và hòa tan trong dung môi thích hợp (thường là methanol) để tạo dung dịch chuẩn với nồng độ xác định.

3.2. Đánh giá chất lượng phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp HPLC bao gồm đánh giá độ đặc hiệu (xác nhận coixol không can thiệp với chất khác), xác định độ tuyến tính trên khoảng nồng độ xác định, đánh giá độ chính xác (recovery), khảo sát lặp lại trong ngày (RSD <2%), và lặp lại khác ngày. Các tiêu chí chất lượng được so sánh với tiêu chuẩn AOAC để đảm bảo phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích.

IV. Kết quả định lượng Coixol trong các mẫu cam thảo đất

Các kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng coixol trong cam thảo đất thay đổi tùy thuộc vào vùng địa lý, bộ phận của cây và điều kiện trồng trọt. Qua phân tích HPLC, hàm lượng coixol được xác định chính xác trong các mẫu toàn cây từ các vùng khác nhau. Lá cam thảo đất thường có nồng độ coixol cao hơn so với các bộ phận khác. Các kết quả định tính xác nhận sự hiện diện của coixol qua so sánh thời gian lưu giữ (retention time) với chất chuẩn. Các dữ liệu định lượng cung cấp thông tin quý báu cho kiểm soát chất lượng dược liệu, giúp đảm bảo hiệu lực của các sản phẩm chứa cam thảo đất.

4.1. Hàm lượng coixol ở các vùng địa lý khác nhau

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng coixol trong cam thảo đất thay đổi đáng kể giữa các vùng địa lý khác nhau. Các mẫu từ vùng có khí hậu ấm ẩm thường chứa nồng độ coixol cao hơn. Sự khác biệt về hàm lượng có thể liên quan đến điều kiện độc lập, mùa vụ thu hái, và phương pháp chế biến. Việc xác định chính xác các khác biệt này rất quan trọng cho tiêu chuẩn hóa dược liệu.

4.2. So sánh hàm lượng coixol trong các bộ phận cây

Phân tích HPLC cho thấy lá cam thảo đất chứa nồng độ coixol cao nhất (khoảng 0.5-1.5%), trong khi thân và rễ có nồng độ thấp hơn. Sự phân bố không đều của coixol trong các bộ phận cho hàm ý về việc sử dụng bộ phận nào để tối đa hóa hiệu lực. Các kết quả này giúp hướng dẫn quy trình chế biến và tiêu chuẩn hóa sản phẩm từ cam thảo đất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, có nhiều điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng và phong phú các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, nhiều cây thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Vì vậy việc nghiên cứu các cây thuốc có vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị bệnh hiện nay. Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) là một cây thông dụng ở các nước nhiệt đới.

Ở nước ta cây mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam, cây thường gặp ở những vùng đất hoang, ven đường, bờ sông… Cam thảo đất có tác dụng giải độc do say sắn [7], rong kinh, ban chẩn, phế nhiệt gây ho, viêm họng, tiêu chảy, thấp cước khí, rôm sởi trẻ em, chàm (thấp chẩn) [5], làm thuốc giảm đau và chống viêm [16]. Trong cam thảo đất chứa nhiều hoạt chất amellin, coixol, mannitol, glucose…Một trong những hoạt chất quan trọng là coixol, nó có tác dụng như một thuốc giãn cơ và chống co giật [17], ức chế cơ vân, ức chế tim ếch cô lập, làm biên độ co bóp giảm, nhịp đập chậm lại, thí nghiệm trên thỏ bằng đường tiêm tĩnh mạch huyết áp hạ trong một thời gian ngắn, mặt khác coixol còn có tác dụng làm hạ đường huyết nhẹ [3, 4, 6, 21, 22]. Ngoài ra coixol còn ảnh hưởng đến việc sản xuất và bài tiết chất nhầy, bằng cách tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn khí [18]. Cam thảo đất đã được xây dựng thành một chuyên luận trong DĐVN V, tuy nhiên mới chỉ đề cập đến chỉ tiêu định tính mà chưa có đề cập đến phương pháp định lượng các hoạt trong chất trong cây.

Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu cam thảo đất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính và định lượng coixol trong cây cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. 1 Với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng coixol trong cây cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng coixol trong các mẫu cam thảo đất thu thập được ở các địa phương khác nhau để bước đầu đưa ra giới hạn và hàm lượng coixol trong dược liệu này.

Tổng quan về cây cam thảo đất Cây cam thảo đất hay còn gọi là cây cam thảo nam, cây dã cam thảo. Tên khoa học: Scoparia dulcis L. Thuộc họ hoa mõm chó: Scophulariaceae [5]. Đặc điểm thực vật Cây thảo cứng, mọc thẳng, gốc hóa gỗ, phân nhánh nhiều, cao 0,3-1m.

Thân nhẵn, hình trụ, hơi có cạnh. Lá mọc vòng 3 cái một hay mọc đối, có cuống ngắn, hình mác hay bầu dục, hẹp dần ở gốc, đầu tù hoặc hơi nhọn, mép lá nửa phía trên khía răng tù. Hoa trắng 3-5 cái, mọc ở kẽ lá, cuống hoa dài, mảnh như sợi tóc; lá đài 4, hẹp ngang; tràng có ống ngắn hình bánh xe gồm 4 thùy gần bằng nhau; nhị 4. Quả nang nhỏ, gần hình cầu, chỉ hơi vượt quá đài tồn tại; hạt rất nhỏ, nhăn nheo.

Mùa hoa quả: Tháng 5 - 7 Dược liệu là toàn cây. Thu hái quanh năm, rửa sạch. Dùng tươi hay phơi sấy khô. Hình ảnh cây cam thảo đất Scoparia dulcis L.

Phân bố, thu hái, chế biến Tại Việt Nam, cây mọc khắp nơi ở đất hoang ven các đường đi, bờ ruộng. Trên thế giời, cam thảo đất có nhiều ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…[11] Thu hái toàn cây, rửa sạch, thái nhỏ dùng tươi hoặc phơi khô [3, 6] 1. Thành phần hóa học Cây có chứa một lượng alcaloid và một chất đắng; ngoài ra còn có nhiều acid silicic và một hoạt chất là amellin. Phần của cây trên mặt đất chứa một chất dầu sền sệt, mà trong thành phần có dulciol, scopariol, có manitol và glucose.

Rễ chứa manitol, tanin, alcaloid, một hợp chất triterpen. Vỏ rễ có chứa hexcoxinol, b-sitosterol và manitol[3, 6]. Các hoạt chất chính bao gồm acid scopadulcic A và B, scopadiol, scopadulciol, scopadulin, acid scoparic A - C và acid betulinic[20], [21], [26]. Các hoạt chất khác bao gồm: acacetin, amyrin, apigenin, benzoxazin, benzoxazolin, benzoxazolinone, cirsimarin, cirsitakaoside, coixol, acid coumaric, cynaroside, daucosterol, dulcinol, acid dulcioic, acid gentisic, glutinol, hymenoxin, linarin, luteolin, mannitol, scoparinol, scutellarein, scutellarin, sitosterol, stigmasterol, taraxerol, vicenin và vitexin.

Tác dụng và công dụng của cây cam thảo đất - An thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột [3]. - Làm giãn cơ trung tâm, chống co giật [17]. - Hạ đường huyết thông qua ức chế α-glucosidase, kiềm chế PPAR-và tăng tiết insulin [25]. Trên chuột đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ insulin trong huyết tương tăng đáng kể sau 15 ngày điều trị bằng scoparic acid D phân lập từ cao chiết ethanol của cam thảo đất [23].

- Chống oxy hóa và các gốc tự do [27]. 4 - Chống độc tính trên thận, từ nghiên cứu của Jose S. và cộng sự đã cho thấy sự bảo vệ thận đáng kể của Scoparia dulcis chống lại độc tính trên thận do cisplatin [20]. - Kháng khuẩn kháng nấm, gây độc với tế bào.

Từ nghiên cứu của Zulfiker và cộng sự cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram (- ) và Gram (+), kháng nấm, gây độc tế bào từ cao chiết ethanol của cam thảo đất [31]. - Gây độc với tế bào ung thư, hợp chất N – methylbenzoxazolinon, một alkaloid lần đầu được phân lập thể hiện độc tính tế bào ung thư cơ vân RD với IC50 là 67,0 μM [9]. - Điều hòa và kích thích sự miễn dịch đối với miễn dịch qua trung gian tế bào và dịch thể ở chuột Wistar [30]. Tổng quan về hoạt chất Coixol Công thức cấu tạo: H N O O O C8H7NO3 Danh pháp:  Tên IUPAC: 6-methoxy3H-1,3-benzoxazol-2-one  Tên khác: 6-MBOA, 6-methoxybenzoxazolinone, coixol,.

 Trọng lượng phân tử: 165,043 [24]. Tính chất Coixol là bột kết tinh hình kim, không màu, là hợp chất có hàm lượng cao trong cây Cam thảo đất [10], nhiệt độ nóng chảy 151 – 152oC, hòa tan trong hydroxyd kiềm. Coixol bị phân hủy bởi acid hydrocloric đặc. Tác dụng sinh học của coixol - Tác dụng giãn cơ, chống co giật [17].

- Tác dụng hạ đường huyết nhẹ [21]. - Ngăn chặn sự biểu hiện của gen mucin MUC5AC và sản xuất protein mucin MUC5AC gây ra bởi EGF hoặc TNF-a. Coixol làm giảm bài tiết MUC5AC mucin được kích thích bởi PMA [18]. - Có thể điều chỉnh sự biểu hiện gen, sản xuất và bài tiết chất nhầy của đường thở, bằng cách tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn khí.

Coixol có cấu trúc tương tự melatonin (5-methoxy- N-acetyltryptamine), melatonin liên kết với màng tử cung và niêm mạc có thể bị thay thế bởi coixol và bởi các tác nhân adrenergic khác. Nên coixol được coi như một chất chủ vận-adrenergic và một chất tương tự melatonin có thể giải thích cho tác dụng kích thích và ức chế của hợp chất này đối với sự phát triển sinh dục [28]. - Các hoạt tính kháng nấm và kháng enzym phiên mã ngược HIV-1 có thể có giá trị trong điều trị bệnh nấm và nhiễm HIV ở bệnh nhân AIDS [29]. Các nghiên cứu định lượng coixol đã công bố: Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng coixol đã công bố T L TT Phương pháp phân tích Xử lý mẫu Kết quả T K I Các nghiên cứu trên thế giới HPLC-MS/MS: Chiết trực (LOD: 0,26 + Cột: MS Agilent Poroshell tiếp pg/µl.

Dung môi 0,78 pg/µl. dulcis có nguồn Chế độ gradient. gốc từ Nepalese + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. + Detector MS: ESI (+) – SIM 7 HPLC – UV: Chiết trực LOD: 11,64 + Cột: ProntoSIL C18 UHC- tiếp pg/µl.

520 (50x2 mm, 3 µm) Dung môi LOQ: 35,28 + Nhiệt độ cột: 30°C MeOH : pg/µl. + Pha động: Lượng coixol H2O (85:15) Kênh A: water – TFA trong mẫu: 220,2 (100:0,1; tt/tt); Kênh B: Tác động: ± 2,1 mg / kg Methanol. Siêu âm trong Scoparia 2 [13] Chế độ gradient (15% B từ 0- dulcis có nguồn 1 phút, 15-50% B từ 1-2 phút, gốc từ Nepalese 50-95% B từ 2-6 phút, duy trì ở 95% từ 6-7 phút, 95-15% B từ 7-8 phút). + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

+ Bước sóng phát hiện: 280 nm. HPLC - UV: Chiết trực + Pha tĩnh: cột C18 Unison tiếp US (4.6 × 250 mm , 5 µm) Dung môi LOD: 0,07 mg/ + Nhiệt độ cột: 30°C ml và LOQ: 0,25 Ethanol + Pha động: acid 3 Phương mg / ml. Độ thu trifluoroacetic trong [19] acetonitril 0. Chế pháp chiết: hồi từ 98,36 đến độ gradient.

chiết áp suất 100,30% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. giảm + Bước sóng phát hiện: 290 nm. HPLC – UV: Chiết trực Phương pháp có + Pha tĩnh: Cột HC-C18 tiếp độ tuyến tính tốt Agilent (4.6 mm × 250 mm, Dung môi (r2 = 0. chính xác cao acetone 4 + Nhiệt độ cột: 30°C (RSD 0,96%), độ [15] Phương + Pha động: acetonitril - lăp lại tốt (RSD pháp chiết: 0,1% acid phosphoric (tt/tt : 0,33%).

Tỷ lệ thu 25/75), Soxhlet hồi cao 97.48% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút, 8 + Bước sóng phát hiện: 232 Hàm lượng nm. coixol trong mẫu ở rễ > thân > vỏ hạt Tại Tỉnh Sơn Tây: Hàm lượng coixol trong rễ HPLC – UV: và thân cây là + Pha tĩnh: Cột C18 cao nhất với + Nhiệt độ cột: 25°C 16,1155 mg/g và + Pha động: axetonitril - 5,6659 mg/g. 5 0,1% acid phosphoric (tt:tt = Hàm lượng [33] 50: 50), coixol trong lá là + Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút, cao nhất với + Bước sóng phát hiện: 232 10,6258 mg/g. Hàm lượng coixol trong rễ giảm từ tháng 6 đến tháng 11 II Nghiên cứu trong nước Chiết trực Phương pháp HPLC – UV: tiếp cho độ lặp lại tốt, + Pha tĩnh: Cột nhồi C18 Dung môi đường chuẩn có (4.6 mm × 250 mm, 5 µm), Methanol độ tuyến tính cao + Nhiệt độ cột: 30°C Phương (R²= 0,9999), 6 + Pha động: acetonitril - Hàm lượng pháp chiết: [8] 0,1% acid phosphoric.

Chế coixol thấp nhất chiết độ gradient. là 1,86µg/1g hạt, + Tốc độ dòng: 0,8 ml / phút, Soxhlet kết Hàm lượng cao + Bước sóng phát hiện: 232 hợp cô quay nhất trong mẫu là nm. dưới áp suất 23,64µg/1g hạt. Tổng quan về sắc kí lỏng hiệu năng cao 1.

Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].