ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, có nhiều điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng và phong phú các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, nhiều cây thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Vì vậy việc nghiên cứu các cây thuốc có vai trò quan trọng trong việc phòng và điều trị bệnh hiện nay. Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) là một cây thông dụng ở các nước nhiệt đới.
Ở nước ta cây mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam, cây thường gặp ở những vùng đất hoang, ven đường, bờ sông… Cam thảo đất có tác dụng giải độc do say sắn [7], rong kinh, ban chẩn, phế nhiệt gây ho, viêm họng, tiêu chảy, thấp cước khí, rôm sởi trẻ em, chàm (thấp chẩn) [5], làm thuốc giảm đau và chống viêm [16]. Trong cam thảo đất chứa nhiều hoạt chất amellin, coixol, mannitol, glucose…Một trong những hoạt chất quan trọng là coixol, nó có tác dụng như một thuốc giãn cơ và chống co giật [17], ức chế cơ vân, ức chế tim ếch cô lập, làm biên độ co bóp giảm, nhịp đập chậm lại, thí nghiệm trên thỏ bằng đường tiêm tĩnh mạch huyết áp hạ trong một thời gian ngắn, mặt khác coixol còn có tác dụng làm hạ đường huyết nhẹ [3, 4, 6, 21, 22]. Ngoài ra coixol còn ảnh hưởng đến việc sản xuất và bài tiết chất nhầy, bằng cách tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn khí [18]. Cam thảo đất đã được xây dựng thành một chuyên luận trong DĐVN V, tuy nhiên mới chỉ đề cập đến chỉ tiêu định tính mà chưa có đề cập đến phương pháp định lượng các hoạt trong chất trong cây.
Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu cam thảo đất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính và định lượng coixol trong cây cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. 1 Với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng coixol trong cây cam thảo đất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng coixol trong các mẫu cam thảo đất thu thập được ở các địa phương khác nhau để bước đầu đưa ra giới hạn và hàm lượng coixol trong dược liệu này.
Tổng quan về cây cam thảo đất Cây cam thảo đất hay còn gọi là cây cam thảo nam, cây dã cam thảo. Tên khoa học: Scoparia dulcis L. Thuộc họ hoa mõm chó: Scophulariaceae [5]. Đặc điểm thực vật Cây thảo cứng, mọc thẳng, gốc hóa gỗ, phân nhánh nhiều, cao 0,3-1m.
Thân nhẵn, hình trụ, hơi có cạnh. Lá mọc vòng 3 cái một hay mọc đối, có cuống ngắn, hình mác hay bầu dục, hẹp dần ở gốc, đầu tù hoặc hơi nhọn, mép lá nửa phía trên khía răng tù. Hoa trắng 3-5 cái, mọc ở kẽ lá, cuống hoa dài, mảnh như sợi tóc; lá đài 4, hẹp ngang; tràng có ống ngắn hình bánh xe gồm 4 thùy gần bằng nhau; nhị 4. Quả nang nhỏ, gần hình cầu, chỉ hơi vượt quá đài tồn tại; hạt rất nhỏ, nhăn nheo.
Mùa hoa quả: Tháng 5 - 7 Dược liệu là toàn cây. Thu hái quanh năm, rửa sạch. Dùng tươi hay phơi sấy khô. Hình ảnh cây cam thảo đất Scoparia dulcis L.
Phân bố, thu hái, chế biến Tại Việt Nam, cây mọc khắp nơi ở đất hoang ven các đường đi, bờ ruộng. Trên thế giời, cam thảo đất có nhiều ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…[11] Thu hái toàn cây, rửa sạch, thái nhỏ dùng tươi hoặc phơi khô [3, 6] 1. Thành phần hóa học Cây có chứa một lượng alcaloid và một chất đắng; ngoài ra còn có nhiều acid silicic và một hoạt chất là amellin. Phần của cây trên mặt đất chứa một chất dầu sền sệt, mà trong thành phần có dulciol, scopariol, có manitol và glucose.
Rễ chứa manitol, tanin, alcaloid, một hợp chất triterpen. Vỏ rễ có chứa hexcoxinol, b-sitosterol và manitol[3, 6]. Các hoạt chất chính bao gồm acid scopadulcic A và B, scopadiol, scopadulciol, scopadulin, acid scoparic A - C và acid betulinic[20], [21], [26]. Các hoạt chất khác bao gồm: acacetin, amyrin, apigenin, benzoxazin, benzoxazolin, benzoxazolinone, cirsimarin, cirsitakaoside, coixol, acid coumaric, cynaroside, daucosterol, dulcinol, acid dulcioic, acid gentisic, glutinol, hymenoxin, linarin, luteolin, mannitol, scoparinol, scutellarein, scutellarin, sitosterol, stigmasterol, taraxerol, vicenin và vitexin.
Tác dụng và công dụng của cây cam thảo đất - An thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột [3]. - Làm giãn cơ trung tâm, chống co giật [17]. - Hạ đường huyết thông qua ức chế α-glucosidase, kiềm chế PPAR-và tăng tiết insulin [25]. Trên chuột đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ insulin trong huyết tương tăng đáng kể sau 15 ngày điều trị bằng scoparic acid D phân lập từ cao chiết ethanol của cam thảo đất [23].
- Chống oxy hóa và các gốc tự do [27]. 4 - Chống độc tính trên thận, từ nghiên cứu của Jose S. và cộng sự đã cho thấy sự bảo vệ thận đáng kể của Scoparia dulcis chống lại độc tính trên thận do cisplatin [20]. - Kháng khuẩn kháng nấm, gây độc với tế bào.
Từ nghiên cứu của Zulfiker và cộng sự cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram (- ) và Gram (+), kháng nấm, gây độc tế bào từ cao chiết ethanol của cam thảo đất [31]. - Gây độc với tế bào ung thư, hợp chất N – methylbenzoxazolinon, một alkaloid lần đầu được phân lập thể hiện độc tính tế bào ung thư cơ vân RD với IC50 là 67,0 μM [9]. - Điều hòa và kích thích sự miễn dịch đối với miễn dịch qua trung gian tế bào và dịch thể ở chuột Wistar [30]. Tổng quan về hoạt chất Coixol Công thức cấu tạo: H N O O O C8H7NO3 Danh pháp: Tên IUPAC: 6-methoxy3H-1,3-benzoxazol-2-one Tên khác: 6-MBOA, 6-methoxybenzoxazolinone, coixol,.
Trọng lượng phân tử: 165,043 [24]. Tính chất Coixol là bột kết tinh hình kim, không màu, là hợp chất có hàm lượng cao trong cây Cam thảo đất [10], nhiệt độ nóng chảy 151 – 152oC, hòa tan trong hydroxyd kiềm. Coixol bị phân hủy bởi acid hydrocloric đặc. Tác dụng sinh học của coixol - Tác dụng giãn cơ, chống co giật [17].
- Tác dụng hạ đường huyết nhẹ [21]. - Ngăn chặn sự biểu hiện của gen mucin MUC5AC và sản xuất protein mucin MUC5AC gây ra bởi EGF hoặc TNF-a. Coixol làm giảm bài tiết MUC5AC mucin được kích thích bởi PMA [18]. - Có thể điều chỉnh sự biểu hiện gen, sản xuất và bài tiết chất nhầy của đường thở, bằng cách tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô đường dẫn khí.
Coixol có cấu trúc tương tự melatonin (5-methoxy- N-acetyltryptamine), melatonin liên kết với màng tử cung và niêm mạc có thể bị thay thế bởi coixol và bởi các tác nhân adrenergic khác. Nên coixol được coi như một chất chủ vận-adrenergic và một chất tương tự melatonin có thể giải thích cho tác dụng kích thích và ức chế của hợp chất này đối với sự phát triển sinh dục [28]. - Các hoạt tính kháng nấm và kháng enzym phiên mã ngược HIV-1 có thể có giá trị trong điều trị bệnh nấm và nhiễm HIV ở bệnh nhân AIDS [29]. Các nghiên cứu định lượng coixol đã công bố: Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng coixol đã công bố T L TT Phương pháp phân tích Xử lý mẫu Kết quả T K I Các nghiên cứu trên thế giới HPLC-MS/MS: Chiết trực (LOD: 0,26 + Cột: MS Agilent Poroshell tiếp pg/µl.
Dung môi 0,78 pg/µl. dulcis có nguồn Chế độ gradient. gốc từ Nepalese + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. + Detector MS: ESI (+) – SIM 7 HPLC – UV: Chiết trực LOD: 11,64 + Cột: ProntoSIL C18 UHC- tiếp pg/µl.
520 (50x2 mm, 3 µm) Dung môi LOQ: 35,28 + Nhiệt độ cột: 30°C MeOH : pg/µl. + Pha động: Lượng coixol H2O (85:15) Kênh A: water – TFA trong mẫu: 220,2 (100:0,1; tt/tt); Kênh B: Tác động: ± 2,1 mg / kg Methanol. Siêu âm trong Scoparia 2 [13] Chế độ gradient (15% B từ 0- dulcis có nguồn 1 phút, 15-50% B từ 1-2 phút, gốc từ Nepalese 50-95% B từ 2-6 phút, duy trì ở 95% từ 6-7 phút, 95-15% B từ 7-8 phút). + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Bước sóng phát hiện: 280 nm. HPLC - UV: Chiết trực + Pha tĩnh: cột C18 Unison tiếp US (4.6 × 250 mm , 5 µm) Dung môi LOD: 0,07 mg/ + Nhiệt độ cột: 30°C ml và LOQ: 0,25 Ethanol + Pha động: acid 3 Phương mg / ml. Độ thu trifluoroacetic trong [19] acetonitril 0. Chế pháp chiết: hồi từ 98,36 đến độ gradient.
chiết áp suất 100,30% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. giảm + Bước sóng phát hiện: 290 nm. HPLC – UV: Chiết trực Phương pháp có + Pha tĩnh: Cột HC-C18 tiếp độ tuyến tính tốt Agilent (4.6 mm × 250 mm, Dung môi (r2 = 0. chính xác cao acetone 4 + Nhiệt độ cột: 30°C (RSD 0,96%), độ [15] Phương + Pha động: acetonitril - lăp lại tốt (RSD pháp chiết: 0,1% acid phosphoric (tt/tt : 0,33%).
Tỷ lệ thu 25/75), Soxhlet hồi cao 97.48% + Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút, 8 + Bước sóng phát hiện: 232 Hàm lượng nm. coixol trong mẫu ở rễ > thân > vỏ hạt Tại Tỉnh Sơn Tây: Hàm lượng coixol trong rễ HPLC – UV: và thân cây là + Pha tĩnh: Cột C18 cao nhất với + Nhiệt độ cột: 25°C 16,1155 mg/g và + Pha động: axetonitril - 5,6659 mg/g. 5 0,1% acid phosphoric (tt:tt = Hàm lượng [33] 50: 50), coixol trong lá là + Tốc độ dòng: 1,0 ml / phút, cao nhất với + Bước sóng phát hiện: 232 10,6258 mg/g. Hàm lượng coixol trong rễ giảm từ tháng 6 đến tháng 11 II Nghiên cứu trong nước Chiết trực Phương pháp HPLC – UV: tiếp cho độ lặp lại tốt, + Pha tĩnh: Cột nhồi C18 Dung môi đường chuẩn có (4.6 mm × 250 mm, 5 µm), Methanol độ tuyến tính cao + Nhiệt độ cột: 30°C Phương (R²= 0,9999), 6 + Pha động: acetonitril - Hàm lượng pháp chiết: [8] 0,1% acid phosphoric.
Chế coixol thấp nhất chiết độ gradient. là 1,86µg/1g hạt, + Tốc độ dòng: 0,8 ml / phút, Soxhlet kết Hàm lượng cao + Bước sóng phát hiện: 232 hợp cô quay nhất trong mẫu là nm. dưới áp suất 23,64µg/1g hạt. Tổng quan về sắc kí lỏng hiệu năng cao 1.
Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].