CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về peptid kháng khuẩn 1. Giới thiệu về peptid kháng khuẩn Khái niệm peptid kháng khuẩn AMPs (Antimicrobial Peptides) dùng để chỉ đoạn protein ngắn, thường chứa 12-50 acid amin, có khả năng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh thông qua nhiều cơ chế [5], được tổng hợp trực tiếp từ bộ gen của hầu hết các sinh vật thông qua ribosome và đón vai trò tuyến đầu trong hệ miễn dịch của vật chủ [6-9]. AMP đã được phát hiện từ rất lâu trước đây vào năm 1922 bởi nhà sinh vật học Alexander Fleming, người cũng phát hiện ra penicillin vào năm 1928.
Dù vậy, sự ra đời của penicillin đã khiến các AMP bị quên lãng trong suốt một thời gian dài [5]. Gần đây, khi thế giới đang phải đối mặt với tình trạng kháng kháng sinh gia tăng, AMP một lần nữa nhận được sự chú ý từ các nhà khoa học. Việc khai thác tiềm năng của các peptid này trong phát triển thuốc mới được xem là một hướng đi triển vọng trong việc đối phó với tình trạng kháng thuốc hiện nay. Nguồn gốc của peptid kháng khuẩn Peptid kháng khuẩn là các phân tử sinh học có nguồn gốc tự nhiên, được tổng hợp trực tiếp từ ribosome và phân bố rộng rãi trong nhiều giới sinh vật, từ vi khuẩn, thực vật đến động vật bậc cao.
Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh của sinh vật, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây bệnh. Ở vi sinh vật, AMPs đóng vai trò như cơ chế tự vệ nhằm tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn cạnh tranh trong cùng môi trường sống. Trong thực vật, AMPs được biểu hiện như một phần của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, tham gia bảo vệ cây trước sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm và côn trùng gây hại. Đặc biệt, ở động vật – bao gồm cả con người – AMPs hiện diện ở nhiều mô và dịch sinh học như da, niêm mạc, tuyến nước bọt và bạch cầu, giữ vai trò quan trọng trong việc nhận diện và tiêu diệt mầm bệnh ở giai đoạn sớm của đáp ứng miễn dịch [6].
Nguồn gốc tự nhiên và sự bảo tồn tiến hóa rộng rãi của AMPs cho thấy đây là một nhóm hợp chất sinh học tiềm năng có thể được khai thác trong phát triển các liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh, đặc biệt trong bối cảnh kháng thuốc ngày càng gia tăng trên toàn cầu. Cấu trúc chung của peptid kháng khuẩn Peptid kháng khuẩn (AMPs) là các phân tử có cấu trúc không gian ba chiều đặc trưng với tính lưỡng phần (amphipathicity), thể hiện qua sự phân bố đối xứng giữa các acid amin kỵ nước (như leucin, phenylalanin) và các acid amin ưa nước mang điện tích dương (như lysin, arginin) trên mặt phẳng xoắn α-helix. Cấu trúc này cho phép AMPs tương tác hiệu quả với màng tế bào vi khuẩn, chủ yếu thông qua liên kết với lớp lipid kép và làm mất ổn định cấu trúc màng [10]. Một yếu tố quan trọng khác là moment kỵ 2 nước (đại lượng phản ánh mức độ phân cực giữa hai mặt của peptid), có liên hệ chặt chẽ với khả năng xuyên màng [11], [12].
Ngoài ra, góc kỵ nước (hydrophobic angle) – biểu thị vùng không gian chiếm bởi các acid amin kỵ nước cũng được xem là yếu tố then chốt quyết định hoạt tính kháng khuẩn [13]. Về đặc tính điện tích, AMPs thường mang điện tích dương từ +2 đến +13, phổ biến nhất ở mức +4 đến +7, nhờ chứa nhiều acid amin có tính kiềm như lysin và arginin. Tính chất cation này giúp chúng gắn kết chọn lọc với các thành phần điện tích âm trên màng tế bào vi khuẩn như phospholipid hay lipoteichoic acid [14]. Cuối cùng, tỷ lệ cân bằng giữa phần thân dầu và thân nước, đặc biệt trong khoảng 40–60%, được xác định là tối ưu để duy trì hiệu quả kháng khuẩn cao mà vẫn đảm bảo tính chọn lọc, tránh độc tính với tế bào lành [15].
Các dạng cấu trúc của AMPs Các AMPs có thể tồn tại ở bốn dạng như Hình 1.1 bao gồm dạng xoắn α (a), dạng tự do mở rộng (b), dạng hỗn hợp (c) và dạng tấm β (d). Cấu trúc tồn tại của AMP quyết định đến cơ chế tác động lên tế bào vi sinh vật gây bệnh của AMP [16], [17]. Peptid xoắn α là những AMP được nghiên cứu nhiều nhất đến thời điểm hiện tại. Trong các cấu trúc xoắn α, khoảng cách giữa hai acid amin liền kề là khoảng 0,15 nm và góc giữa chúng so với tâm là khoảng 100° khi nhìn từ trên xuống.
Tuy nhiên, một số AMPs không thuộc bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm này. Hơn nữa, nhiều peptid chỉ hình thành cấu trúc hoạt động khi tương tác với màng tế bào đích. Cơ chế tác động của peptid kháng khuẩn AMPs thể hiện cơ chế tác động đa dạng và phức tạp trên màng tế bào vi sinh vật, phụ thuộc vào đặc tính phân tử của cả peptid và vi sinh vật đích, cũng như thành phần lipid màng và vị trí tác động [14]. Khi đạt đến nồng độ ngưỡng, AMPs có thể gây ra các 3 lỗ hổng và phá vỡ cấu trúc màng tế bào vi khuẩn hoặc màng bào quan thông qua nhiều cơ chế khác nhau.
Các nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử đã xác định ba mô hình chính được trình bày ở Hình 1.2 bao gồm: mô hình "barrel-stave" (thùng-ván) với các peptid xếp thẳng góc tạo lỗ xuyên màng; mô hình "carpet" (thảm) khi peptid phủ kín bề mặt màng theo hướng song song; và mô hình "toroidal" (xoắn ốc) với sự hình thành các lỗ không ổn định [18-20]. Đặc biệt, sự tương tác tĩnh điện giữa AMPs mang điện tích dương và phospholipid mang điện tích âm trên màng vi khuẩn đóng vai trò then chốt trong quá trình này [21]. Các cơ chế tác động của AMPs lên thành tế bào Bên cạnh tác động trên màng, nhiều AMPs còn thể hiện hoạt tính nội bào thông qua việc ức chế các quá trình thiết yếu của tế bào. Một số peptid như indolicidin có khả năng gắn với DNA/RNA và ức chế hoạt động của DNA polymerase [22], trong khi PR- 39 – một peptid giàu proline và arginine, không gây ly giải màng tế bào mà thay vào đó ức chế tổng hợp DNA và protein, dẫn đến cái chết của vi khuẩn [23].
Điều đặc biệt là hoạt tính của AMPs có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào điều kiện môi trường như pH, áp suất thẩm thấu và nhiệt độ [24]. Cụ thể, sự thay đổi pH ảnh hưởng đến cấu trúc và điện tích của peptid từ đó ảnh hưởng đến khả năng tương tác với màng tế bào vi khuẩn. Tương tự, áp suất thẩm thấu và nhiệt độ cũng có thể ảnh hưởng cấu trúc và tính chất của peptid, dẫn đến sự thay đổi trong hoạt tính kháng khuẩn. Điều này phản ánh tính linh hoạt và phức tạp trong cơ chế tác động của AMPs.
Hoạt tính sinh học của peptid kháng khuẩn Các peptid kháng khuẩn (AMPs) hiện đang thu hút sự quan tâm rộng rãi nhờ các tác dụng sinh học đa dạng, bao gồm hoạt tính kháng khuẩn (trên nhiều chủng vi khuẩn 4 Gram âm, Gram dương), kháng nấm và kháng virus, cũng như các vi sinh vật gây bệnh khác như virus, nấm và kí sinh trùng. Đặc biệt, AMPs được đánh giá cao nhờ khả năng tiêu diệt các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc. Với phổ hoạt động phổ rộng cùng hiệu quả diệt khuẩn cao, các peptid này được xem là những ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển các liệu pháp thay thế kháng sinh truyền thống [25]. Hoạt tính kháng khuẩn Hiện nay, AMPs đang được nghiên cứu mạnh mẽ nhờ cơ chế tác động đa mục tiêu vượt trội so với kháng sinh truyền thống.
Khác biệt cơ bản nằm ở khả năng tác động vào đích là lớp lipopolysaccharid (LPS) của màng ngoài vi khuẩn nhờ cấu trúc lưỡng tính đặc trưng với vùng ưa nước giàu lysine/arginine và vùng kỵ nước chứa leucin/ phenylalanin, giúp phá vỡ màng lipid kép hiệu quả [18], [26-29]. Trong khi kháng sinh thông thường chỉ can thiệp vào một cơ chế (ức chế tổng hợp protein, DNA hoặc thành tế bào), AMPs đồng thời tác động lên cả màng tế bào và các quá trình nội bào, khiến vi khuẩn khó phát triển đề kháng lại các peptid này [30-32]. Nghiên cứu lâm sàng ghi nhận AMPs khả năng tiêu diệt hoặc kìm hãm các vi sinh vật kháng thuốc thông thường và ngay cả trên những vi sinh vật kháng thuốc nguy hiểm có khả năng đa kháng thuốc như Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) (Cecropin từ bướm Hyalophora cecropia và persulcatusin từ ve Ixodes persulcatus ức chế mạnh với MIC 2-8 μg/ml [33]), Pseudomonas aeruginosa đa kháng (Defensin từ côn trùng thể hiện hoạt tính ở nồng độ 4-16 μg/ml [34]). Ngoài các tác động trực tiếp lên vi khuẩn, AMPs còn có vai trò điều hòa miễn dịch quan trọng như duy trì cân bằng vi khuẩn chí trên da và niêm mạc ruột [35], điều tiết phản ứng viêm thông qua con đường NF-κB [36], ảnh hưởng đến biểu hiện các cytokine chống nhiễm trùng [37].
Hoạt tính kháng nấm AMPs thể hiện hoạt tính kháng nấm đáng kể thông qua nhiều cơ chế tác động khác nhau. Các nghiên cứu đã chứng minh AMPs có khả năng liên kết đặc hiệu với chitin trong thành tế bào nấm, đồng thời làm tăng tính thấm màng sinh chất bằng cách hình thành các lỗ xuyên màng hoặc phá vỡ cấu trúc màng lipid [38]. Trong số các AMPs kháng nấm, peptid TistH từ nọc bọ cạp với cấu trúc α-helix cho thấy hiệu quả ức chế mạnh trên C. flavus, đồng thời thể hiện tính an toàn cao khi không gây độc tế bào người ở nồng độ điều trị [39].
Một ví dụ khác là indolicidin từ bạch cầu trung tính bò, được ghi nhận có hoạt tính mạnh chống lại T. krusei nhờ khả năng tương tác với màng tế bào nấm gây rối loạn cấu trúc màng dẫn đến cái chết của tế bào nấm [40]. 5 Các AMPs kháng nấm thường có đặc điểm chung là phổ tác dụng rộng, nồng độ ức chế thấp (MIC 1-16 μg/ml) và tính chọn lọc cao dẫn đến tính an toàn được đảm bảo khi sử dụng ở nồng độ điều trị [41], [42], khiến chúng trở thành ứng viên tiềm năng trong điều trị các bệnh nhiễm nấm kháng thuốc. Hoạt tính kháng virus AMPs thể hiện khả năng kháng virus thông qua ba cơ chế chính: gây mất ổn định màng bao virus; ngăn cản sự bám dính virus vào tế bào chủ; cạnh tranh thụ thể tế bào.
Các nghiên cứu đã chứng minh defensin có thể liên kết đặc hiệu với glycoprotein bề mặt của virus herpes simplex (HSV), ngăn chặn sự bám dính và xâm nhập của virus vào tế bào chủ [43].
