Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu một số phương pháp tách chiết adn từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định adn

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu một số phương pháp tách chiết adn từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Đặng Thị Thu Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Hà
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Nội dung nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự
• 2.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự
• 2.2.1. Khái niệm về máu
• 2.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu
• 2.2.3. Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu
• 2.2.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng
• 2.3. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải
• 2.4. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài
• 2.5. Tách chiết ADN từ dấu vết máu
• 2.5.1. Định lượng ADN
• 2.5.2. Khuếch đại ADN (PCR)
• 2.5.3. Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lượng ADN
• 2.6. Kỹ thuật điện di
• 2.6.1. Nguyên lý của kỹ thuật điện di
• 2.6.2. Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer
• 2.7. Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn
• 2.8. Vấn đề nhiễm ADN
• 2.9. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực nghiên cứu của đề tài
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thiết bị máy móc
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải
• 3.2.2. Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu
• 3.2.3. Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép – Ouchterlony
• 3.2.4. Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu
• 3.2.5. Định lượng ADN
• 3.2.6. Phương pháp PCR
• 3.2.7. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis - CE)
• 3.2.8. Thiết kế bố trí thí nghiệm
• 3.2.9. Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra
• 3.2.10. Các mẫu tạo ra được ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B, được tiến hành các bước thí nghiệm như sau
• 3.2.11. Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kít PrepFiler
• 3.2.12. Thử nghiệm kết quả tách chiết bằng bộ kít PrepFiler trên các mẫu từ các vụ án cụ thể
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu
• 4.1.1. Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung dịch phenolphthalein
• 4.1.2. Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép theo Ouchterlony
• 4.1.3. Kết quả thực nghiệm tách chiết bằng phương pháp sử dụng chelex 5% và tách chiết bằng bộ kít PrepFiler
• 4.1.4. Kết quả tách chiết bằng phương pháp PrepFiler ứng dụng vào mẫu vụ án thực tế
• 4.1.5. Hình ảnh điện di một số mẫu thực nghiệm, mẫu án thực tế
• 4.2. Thảo luận kết quả nghiên cứu
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải

Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải là một lĩnh vực quan trọng trong điều tra hình sự. Việc phân tích ADN giúp xác định danh tính nạn nhân và thủ phạm trong các vụ án. Dấu vết máu trên vải thường gặp trong các vụ án hình sự, nhưng việc tách chiết ADN từ những dấu vết này gặp nhiều khó khăn do ảnh hưởng của xà phòng và các chất tẩy rửa.

1.1. Khái niệm về dấu vết máu trong điều tra hình sự

Dấu vết máu là một trong những loại chứng cứ quan trọng trong điều tra hình sự. Chúng có thể cung cấp thông tin về hiện trường vụ án và danh tính của nạn nhân hoặc thủ phạm. Việc nhận diện dấu vết máu giúp các nhà điều tra xác định mối liên hệ giữa các cá nhân và hiện trường.

1.2. Tầm quan trọng của việc tách chiết ADN

Tách chiết ADN từ dấu vết máu là bước quan trọng trong quy trình giám định hình sự. ADN giúp xác định danh tính cá nhân một cách chính xác. Việc tách chiết hiệu quả từ dấu vết máu trên vải có thể giúp giải quyết nhiều vụ án hình sự.

II. Những thách thức trong tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải

Việc tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải gặp nhiều thách thức. Các chất tẩy rửa như xà phòng có thể làm giảm chất lượng và số lượng ADN thu được. Điều này gây khó khăn trong việc phân tích và xác định danh tính. Các yếu tố như thời gian tồn tại của dấu vết máu và loại vải cũng ảnh hưởng đến quá trình tách chiết.

2.1. Ảnh hưởng của xà phòng đến dấu vết máu

Xà phòng và các chất tẩy rửa có thể làm giảm đáng kể số lượng ADN có trong dấu vết máu. Chúng có thể phá hủy cấu trúc ADN, làm cho việc tách chiết trở nên khó khăn hơn.

2.2. Thời gian tồn tại của dấu vết máu

Thời gian mà dấu vết máu tồn tại trên vải trước khi bị giặt cũng ảnh hưởng đến chất lượng ADN. Dấu vết máu để lâu có thể bị phân hủy, làm giảm khả năng tách chiết ADN.

III. Phương pháp tách chiết ADN hiệu quả từ dấu vết máu

Có nhiều phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu, trong đó phương pháp tách chiết bằng Chelex 5% và bộ kít PrepFiler được sử dụng phổ biến. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Phương pháp tách chiết bằng Chelex 5

Phương pháp Chelex 5% là một trong những phương pháp tách chiết ADN phổ biến. Nó đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu chất lượng ADN ban đầu phải tốt.

3.2. Phương pháp tách chiết bằng bộ kít PrepFiler

Bộ kít PrepFiler cho hiệu quả tách chiết cao hơn, đặc biệt đối với các mẫu có hàm lượng ADN thấp. Tuy nhiên, chi phí cao và dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp tách chiết ADN

Kết quả từ việc tách chiết ADN có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ điều tra hình sự đến xác định quan hệ huyết thống. Việc tách chiết thành công ADN từ dấu vết máu trên vải giúp cung cấp chứng cứ quan trọng trong các vụ án.

4.1. Ứng dụng trong điều tra hình sự

Việc tách chiết ADN từ dấu vết máu giúp xác định danh tính nạn nhân và thủ phạm, từ đó hỗ trợ quá trình điều tra và giải quyết vụ án.

4.2. Ứng dụng trong xác định quan hệ huyết thống

ADN tách chiết từ dấu vết máu cũng có thể được sử dụng để xác định quan hệ huyết thống giữa các cá nhân, cung cấp thông tin quan trọng trong các vụ án liên quan đến gia đình.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu tách chiết ADN

Nghiên cứu về phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vải là rất cần thiết trong bối cảnh hiện nay. Việc cải tiến các phương pháp tách chiết sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong công tác giám định ADN, từ đó hỗ trợ tốt hơn cho công tác điều tra hình sự.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tách chiết ADN

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tìm kiếm các phương pháp tách chiết hiệu quả hơn, nhằm nâng cao chất lượng và số lượng ADN thu được từ dấu vết máu trên vải.

5.2. Đề xuất cải tiến quy trình tách chiết

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến quá trình tách chiết ADN, từ đó đề xuất các cải tiến quy trình tách chiết để đạt hiệu quả cao nhất.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong công tác điều tra tội phạm hình sự, giám định sinh học pháp lý đóng vai trò quyết định trong việc xác định danh tính nạn nhân, truy nguyên thủ phạm và làm sáng tỏ sự thật khách quan của vụ án. Theo thống kê năm 2014 tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an, cơ quan này đã tiếp nhận 421 vụ án có trưng cầu giám định ADN, trong đó có 146 vụ án yêu cầu giám định từ dấu vết máu. Đáng chú ý, có 54 vụ án với 144 mẫu giám định xuất hiện dấu vết máu trên các vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm.

Thách thức lớn nhất trong thực tiễn điều tra là thủ phạm thường cố tình hoặc vô tình ngâm giặt các vật chứng này bằng xà phòng và các chất tẩy rửa nhằm xóa sạch dấu vết. Tác động hóa lý từ chất hoạt động bề mặt và enzyme trong bột giặt đã rửa trôi đáng kể lượng hồng cầu và bạch cầu, làm biến tính cấu trúc tế bào và suy giảm nghiêm trọng chất lượng ADN. Đồng thời, hóa chất tẩy rửa còn tồn lưu trên sợi vải đóng vai trò là chất ức chế mạnh đối với phản ứng khuếch đại gen. Phương pháp tách chiết truyền thống bằng dung dịch Chelex 5% thường thất bại do không thu hồi đủ nồng độ ADN khuôn và không loại bỏ triệt để chất ức chế, dẫn đến hiện tượng mất alen hoặc sai lệch kiểu gen.

Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý thuộc Viện Khoa học hình sự nhằm đánh giá, so sánh hiệu quả giữa phương pháp Chelex 5% và bộ kit PrepFiler sử dụng hạt từ tính. Mục tiêu trọng tâm là tối ưu hóa quy trình thu nhận ADN từ dấu vết máu trên vải đã qua giặt tẩy, nâng tỷ lệ thành công của phản ứng PCR khuếch đại 16 locus gen hệ STR từ mức dưới 30% lên trên 85%, góp phần cung cấp nguồn chứng cứ vật chất vững chắc cho công tác tố tụng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng nguyên lý tiếp xúc kinh điển của Edmund Locard trong khoa học hình sự: mọi sự tương tác vật chất đều để lại dấu vết. Trong lĩnh vực sinh học pháp lý, máu người là mô liên kết lỏng chứa trung bình khoảng 6.000 bạch cầu trên mỗi microlit máu, mỗi tế bào bạch cầu chứa từ 5 đến 6 picogram ADN, tương đương khả năng thu hồi từ 20 đến 50 nanogram ADN trên 1 mililit máu toàn phần. ADN nhân tế bào mang tính cá biệt cao và bền vững, là cơ sở để phân tích tính đa hình di truyền qua các đoạn lặp lại ngắn (STR).

Cơ chế tác động của xà phòng và chất giặt rửa dựa trên cấu trúc phân tử gồm đầu ưa nước và đuôi kỵ nước, kết hợp với các enzyme phân giải như protease, lipase ở nhiệt độ thường. Các chất này phá vỡ màng tế bào bạch cầu, phân cắt chuỗi polypeptide của protein màng và hòa tan lipid, khiến vật liệu di truyền bị rửa trôi hoặc đứt gãy. Khi nồng độ ADN khuôn giảm xuống dưới ngưỡng 0,125 nanogram hoặc mẫu bị nhiễm ion kim loại và chất hoạt động bề mặt, phản ứng PCR sẽ bị ức chế nghiêm trọng. Khung lý thuyết tích hợp phân tích huỳnh quang đa locus (Multiplex STR Typing) tại 15 locus gen nhân và 1 locus xác định giới tính Amelogenin, đánh giá độ tin cậy thông qua đơn vị huỳnh quang tương đối (RFU) và tỷ lệ khả dĩ (Likelihood Ratio).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thiết kế thực nghiệm trên 16 mẫu khảo nghiệm nhân tạo được chia thành 7 nhóm biến số độc lập, kết hợp với các mẫu vật chứng thực tế từ các vụ án hình sự do cơ quan điều tra công an các tỉnh gửi về:

• Nhóm khảo nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của 3 loại chất giặt rửa phổ biến (OMO, Tide, Ariel); phương thức giặt (giặt tay với 10 gam bột giặt trong 0,5 lít nước và giặt máy 7 kg với 50 gam bột giặt); thể tích máu ban đầu (0,5 mililit và 3,0 mililit); thời gian bám dính trước khi giặt (24 giờ và 72 giờ); màu sắc vải (đen, đỏ, trắng); và bản chất cơ lý của sợi vải (90% polyester mỏng mềm và 90% cotton dày cứng).
• Quy trình phân tích:
  1. Giám định định hướng máu bằng phản ứng phenolphthalein 1% với hydrogen peroxide 3%.
  2. Xác định protein đặc hiệu loài người qua kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép Ouchterlony trên thạch agarose trong thời gian 8 đến 12 giờ.
  3. Tách chiết so sánh song song giữa Chelex 5% và bộ kit PrepFiler ứng dụng hạt từ tính resin.
  4. Định lượng nồng độ ADN bằng Real-time PCR trên hệ thống ABI 7500 với kit Quantifiler Human DNA.
  5. Khuếch đại gen qua hệ thống máy luân nhiệt ABI 9700 bằng kit AmpFlSTR Identifiler Direct qua 28 chu kỳ nhiệt.
  6. Điện di mao quản trên máy giải trình tự gen tự động ABI Prism 3130 Genetic Analyzer và phân tích kiểu gen bằng phần mềm GeneMapper ID phiên bản 3.2.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm trên 16 nhóm mẫu khảo nghiệm và các mẫu án thực tế đã mang lại các phát hiện khoa học mang tính bước ngoặt:

Thứ nhất, phương pháp tách chiết bằng bộ kit PrepFiler sử dụng hạt từ tính vượt trội hoàn toàn so với phương pháp Chelex 5%. Đối với các mẫu máu bị giặt tẩy, Chelex 5% cho nồng độ ADN cực thấp (đa số dưới 0,02 nanogram/microlit), dẫn đến tỷ lệ nhân gen thất bại hoặc xuất hiện hiện tượng mất alen (allelic drop-out) lên tới trên 70% số locus. Ngược lại, bộ kit PrepFiler thu hồi nồng độ ADN ổn định từ 0,15 đến 0,65 nanogram/microlit, loại bỏ hoàn toàn các chất ức chế màu nhuộm và xà phòng, cho phép giải mã đầy đủ 16/16 locus gen với đỉnh huỳnh quang sắc nét đạt từ 500 đến 2.000 RFU.

Thứ hai, phương thức giặt và loại chất tẩy rửa ảnh hưởng trực tiếp đến sự suy giảm ADN. Mẫu giặt bằng máy làm giảm hơn 80% lượng ADN so với giặt tay do lực ma sát cơ học và lượng nước xả lớn. Nước giặt chứa enzyme hoạt tính cao (Ariel, OMO) phân hủy tế bào mạnh hơn bột giặt thông thường, khiến lượng tế bào bám dính giảm mạnh.

Thứ ba, bản chất sợi vải và thời gian khô của vết máu quyết định khả năng lưu giữ mẫu. Vải 90% cotton dày lưu giữ lượng ADN cao gấp 2,5 đến 3 lần so với vải 90% polyester nhờ cấu trúc mao dẫn tự nhiên giữ chặt tế bào máu bên trong sợi. Các vết máu tồn tại 72 giờ trước khi giặt bám dính bền vững hơn, cho sản lượng ADN sau giặt cao hơn khoảng 35% so với mẫu chỉ để khô 24 giờ.

Thảo luận kết quả

Cơ chế phân tử giải thích sự khác biệt giữa hai phương pháp nằm ở khả năng tinh sạch của hạt từ tính resin trong môi trường đệm ly giải chuyên dụng. Dung dịch Chelex 5% chỉ hoạt động như một chất tạo phức bắt giữ các ion kim loại đa hóa trị nhằm ngăn chặn sự thoái hóa ADN ở 100 độ C, nhưng hoàn toàn bất lực trước các phân tử hoạt động bề mặt anionic và protease của xà phòng. Các tạp chất này đi thẳng vào hỗn hợp phản ứng PCR, làm bất hoạt enzyme Taq polymerase.

Dữ liệu điện di mao quản biểu diễn trên electropherogram cho thấy các mẫu xử lý bằng PrepFiler có đường nền phẳng, các đỉnh peak cân bằng hoàn hảo giữa các locus có kích thước phân tử ngắn như D8S1179, D3S1358 và các locus dài như FGA, D18S51. Trái lại, bảng kết quả của Chelex 5% thể hiện rõ hiện tượng mất cân bằng đỉnh alen (heterozygote peak imbalance) và xuất hiện nhiều đỉnh giả (stutter peak) do khuếch đại không hoàn chỉnh. Điều này khẳng định PrepFiler là giải pháp kỹ thuật tối ưu để xử lý triệt để các mẫu dấu vết sinh học biến tính nặng.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao chất lượng công tác giám định sinh học pháp lý và hỗ trợ hiệu quả cho hoạt động tố tụng hình sự, các đề xuất cụ thể được đưa ra như sau:

• Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật: Viện Khoa học hình sự và các phòng kỹ thuật hình sự công an địa phương cần ban hành hướng dẫn áp dụng bộ kit tách chiết hạt từ PrepFiler làm quy trình chuẩn đối với 100% các mẫu dấu vết sinh học nghi bị tẩy rửa, thay thế hoàn toàn phương pháp Chelex truyền thống cho nhóm mẫu này trong thời gian 6 đến 12 tháng tới.
• Nâng cao nghiệp vụ khám nghiệm hiện trường: Tổ chức các đợt tập huấn chuyên sâu trong vòng 2 năm cho đội ngũ điều tra viên và cán bộ kỹ thuật hình sự tại 63 tỉnh, thành phố. Hướng dẫn kỹ năng soi tìm dấu vết máu tiềm ẩn bằng nguồn sáng chuyên dụng (ALS) tại các vị trí khuất như đường chỉ may, mặt trong cạp quần, nẹp áo và lớp đệm bông lót bên trong.
• Tối ưu hóa điều kiện phòng xét nghiệm: Thiết lập hệ thống phòng sạch đạt tiêu chuẩn kiểm soát nhiễm ADN tự do với quy trình một chiều nghiêm ngặt (phân tách độc lập 4 phòng: xử lý mẫu, tách chiết, chuẩn bị PCR và điện di mao quản), đảm bảo tỷ lệ tạp nhiễm đạt mức 0,00%.
• Tích hợp kỹ thuật tinh sạch bổ trợ: Khuyến nghị trang bị thêm các cột lọc siêu vi (như MinElute) để cô đặc sản phẩm tách chiết từ thể tích 50 microlit xuống còn 10 microlit đối với các mẫu vết máu cực mờ, giúp nâng cao độ nhạy phát hiện cho các trường hợp ADN có nồng độ cực thấp dưới 0,05 nanogram.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang giá trị thực tiễn và học thuật cao đối với 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

• Giám định viên sinh học pháp lý và kỹ thuật viên xét nghiệm: Tài liệu cung cấp thông số kỹ thuật chuẩn xác về thể tích hóa chất, chu trình nhiệt và phương pháp xử lý mẫu máu bị biến tính, giúp nâng cao tỷ lệ giám định thành công các ca án khó.
• Điều tra viên và cán bộ khám nghiệm hiện trường: Giúp hiểu rõ cơ chế phân hủy của dấu vết sinh học trên vật mang là vải, từ đó có phương pháp phát hiện, bảo quản và thu giữ mẫu vật đúng quy trình, tránh làm mất dấu vết quý giá.
• Giảng viên, học viên và nghiên cứu sinh ngành Sinh học, Công nghệ sinh học và Y pháp: Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị về ứng dụng sinh học phân tử trong khoa học hình sự, cung cấp các mô hình thực nghiệm đối chứng chi tiết và phương pháp phân tích STR.
• Cơ quan tiến hành tố tụng (Kiểm sát viên, Thẩm phán, Luật sư): Nắm vững cơ sở khoa học của bản kết luận giám định gen, từ đó đánh giá tính chính xác, hợp pháp của nguồn chứng cứ vật chất phục vụ công tác truy tố và xét xử đúng người, đúng tội.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao dấu vết máu trên vải sau khi giặt bằng xà phòng lại khó tách chiết ADN?
Bột giặt chứa các chất hoạt động bề mặt và enzyme protease phân giải protein, làm vỡ màng tế bào bạch cầu và rửa trôi phần lớn vật liệu di truyền. Đồng thời, hóa chất tẩy rửa còn bám lại trên sợi vải sẽ ức chế enzyme khuếch đại gen trong phản ứng PCR, khiến nồng độ ADN thu được thường dưới ngưỡng phát hiện thông thường.

Ưu điểm vượt trội của bộ kit PrepFiler so với phương pháp Chelex 5% là gì?
PrepFiler sử dụng các hạt từ tính resin chuyên dụng để liên kết chọn lọc với phân tử ADN, cho phép loại bỏ hoàn toàn các chất ức chế hữu cơ, phẩm màu và ion kim loại qua các bước rửa từ tính. Phương pháp này bảo tồn tối đa chuỗi ADN nguyên vẹn, nâng cao hiệu suất thu hồi hơn 80% so với phương pháp Chelex.

Loại vải nào giữ lại dấu vết máu tốt nhất sau khi bị giặt tẩy?
Vải sợi tự nhiên như cotton 90% có khả năng giữ lại tế bào máu tốt hơn đáng kể so với vải tổng hợp polyester 90%. Do sợi cotton có cấu trúc rỗng và khả năng thấm hút mao dẫn cao, các phân tử máu ngấm sâu vào lõi sợi và khó bị cuốn trôi hoàn toàn dưới tác động ma sát của nước giặt.

Phản ứng Phenolphthalein và kỹ thuật Ouchterlony có vai trò gì trước khi tách chiết ADN?
Phản ứng Phenolphthalein giúp định hướng nhanh sự hiện diện của hemoglobin trong dấu vết nghi vấn thông qua phản ứng đổi màu. Tiếp đó, kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép Ouchterlony xác định chính xác protein đặc hiệu của loài người, tránh lãng phí hóa chất tách chiết và thời gian giám định đối với máu động vật.

Làm thế nào để xử lý khi hình ảnh điện di mao quản xuất hiện hiện tượng mất alen (drop-out)?
Khi xảy ra hiện tượng mất alen do lượng mẫu thấp, giám định viên cần sử dụng tỷ lệ khả dĩ (Likelihood Ratio) để biện luận kết quả, đồng thời thực hiện cô đặc sản phẩm tách chiết, tăng chu kỳ luân nhiệt PCR lên 30 đến 34 chu kỳ, hoặc phân tích lặp lại nhiều lần để xây dựng kiểu gen đồng thuận chính xác nhất.

Kết luận

• Luận văn đã chứng minh tính ưu việt tuyệt đối của phương pháp tách chiết bằng bộ kit hạt từ tính PrepFiler so với dung dịch Chelex 5% đối với các mẫu máu bị giặt tẩy bằng xà phòng.
• Xác định rõ mức độ ảnh hưởng của các yếu tố cơ lý: sợi vải cotton và thời gian khô 72 giờ giữ lại lượng ADN cao nhất; giặt máy và xà phòng chứa enzyme hoạt tính mạnh làm hao hụt vật liệu di truyền nhiều nhất.
• Chuẩn hóa thành công quy trình định lượng và khuếch đại tổ hợp 16 locus gen STR theo hệ Identifiler, đảm bảo độ phân giải tín hiệu huỳnh quang đạt chuẩn giám định pháp y.
• Giải quyết triệt để vấn đề ức chế phản ứng PCR trong thực tế điều tra án hình sự, mở ra hướng đi hiệu quả cho các ca án bế tắc do chứng cứ sinh học bị tẩy xóa.
• Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác, đóng góp trực tiếp vào quy trình giám định sinh học pháp lý tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.

Để tiếp tục nâng cao hiệu quả giám định trong giai đoạn tới, các viện nghiên cứu và phòng thí nghiệm pháp y cần mở rộng thử nghiệm phương pháp hạt từ tính trên các loại chất mang phức tạp khác như da thuộc, gỗ mục và kim loại rỉ sét. Các đơn vị nghiệp vụ hãy chủ động áp dụng quy trình chuẩn hóa này vào thực tiễn để nâng cao tỷ lệ phá án và bảo đảm tính nghiêm minh của pháp luật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài Phân tích dấu vết ADN đã trở thành một phần không thể thiếu trong công tác giám định hình sự nói chung và giám định dấu vết sinh học nói riêng và là một công cụ quan trọng cho các nhà điều tra phá án. Thông qua phân tích ADN có thể truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa… hoặc xác định quan hệ huyết thống. Mỗi năm Viện Khoa học hình sự nhận được hàng trăm trưng cầu giám định ADN từ các vụ án, chủ yếu là từ dấu vết máu, tinh trùng, tóc, tế bào, răng xương, mô và tổ chức cơ thể, móng tay móng chân… Thống kê năm 2014 tại Viện Khoa học hình sự có 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong đó số lượng trưng cầu giám định ADN từ dấu vết máu là 146 vụ và số vụ án có dấu vết máu trên vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm… là 54 vụ với 144 mẫu cần giám định, trong số đó có nhiều vụ án vật mang dấu vết máu là vải được đưa đến giám định trong tình trạng đã qua ngâm giặt bằng xà phòng, dấu vết trên vật mang không còn nguyên vẹn, giảm đáng kể về số lượng và chất lượng ADN.

Gây khó khăn rất lớn trong công tác giám định. Trong các vụ án hình sự việc khẳng định dấu vết máu của nạn nhân để lại trên quần áo của đối tượng gây án hay máu của đối tượng bám dính trên các vật mang là vải để lại hiện trường là một nguồn chứng cứ rất quan trọng, thủ phạm có thể do vô tình hay cố ý đã dùng hóa chất như xà phòng, chất tẩy rửa để giặt quần áo, hay các vật mang là vải có bám dính dấu vết máu trên đó. Vì vậy việc tách chiết ADN từ các dấu vết máu này gặp rất nhiều khó khăn. Do chất tẩy rửa tác động lên dấu vết phá hủy và rửa trôi dấu vết.

Trong thực tế khi gặp những trường hợp như vậy mà áp dụng phương pháp tách chiết thông thường như đối với các dấu vết máu có chất lượng tốt thì tỉ lệ thành K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang công là rất thấp. Hơn nữa do phải tách chiết, PCR, chạy điện di nhiều lần gây tốn kém hóa chất và mất rất nhiều thời gian, mặt khác do lượng dấu vết thường không nhiều nên đòi hỏi phải có phương pháp tách chiết hiệu quả để tránh sử dụng hết dấu vết mà không cho kết quả phân tích ADN dẫn đến không góp phần giải quyết được vụ án. Trong thực tế các vụ án có dấu vết máu trên các vật mang là vải theo như lời khai của đối tượng là đã qua ngâm giặt bằng xà phòng và thực tế trong giám định quan sát bằng mắt cũng thấy vật mang dấu vết tương đối sạch, lượng dấu vết bám dính trên vật mang là khá mờ nhạt thì với phương pháp tách chiết thông thường hiện nay là dùng chelex 5% không cho hiệu quả cao với lý do: - Lượng ADN tách chiết được không đủ để thực hiện phản ứng PCR. - Không loại bỏ được hết các chất ức chế ảnh hưởng đến chất lượng ADN.

- Hình ảnh điện di kém: Mất alen, nhiều alen lặp ảnh hưởng đến việc phân tích kiểu gen. Trong quá trình giải quyết các vụ án thực tế thấy rằng nhiều khi dấu vết máu để lại trên vật mang là nguồn chứng cứ duy nhất nếu không tách chiết được ADN có chứa trên đó để phân tích giám định thì vụ án sẽ đi vào bế tắc. Trước tình hình đó, chúng tôi thấy rằng việc nghiên cứu thử nghiệm các phương pháp tách chiết khác nhau đối với dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng là rất cần thiết, nhằm tạo ra quy trình ổn định trong tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án, góp phần giải quyết yêu cầu thực tế đặt ra, cũng như góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN đối với loại dấu vết khó thường gặp và có giá trị này. Vì vậy việc tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN” là một yêu cầu cấp thiết.

K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang 2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% và bộ kít tách chiết PrepFiler để tách chiế t ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng với trang thiết bị, phương tiện, hóa chất của phòng thí nghiệm Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân tích, đánh giá sự tác động qua lại của một số yếu tố lý, hóa như: xà phòng, chất liệu vải, thời gian tồn tại của dấu vết máu trên vải trước khi bị giặt, cách thức giặt … lên dấu vết máu bám dính trên các vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm…. Chất lượng và số lượng của ADN tách chiết được từ các dấu vết máu trên các vật mang là vải như quần áo chăn ga gối đệm….

sau khi đã bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án cụ thể và trên các mẫu khảo nghiệm. Kết quả nghiên cứu giúp đưa ra nhận định với phương pháp tách chiết nào thì tối ưu nhất đối với dấu vết máu trên vải đã bị giặt bằng xà phòng, phục vụ tốt nhất công tác giám định gen hình sự, góp phần hoàn thiện cơ sở lý luận hiện có về quy trình tách chiết ADN nói chung cũng như tách chiết ADN từ những dấu vết có chất lượng kém nói riêng phục vụ cho công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Kết quả đánh giá ADN tách chiết từ dấu vết máu thể hiện qua các bảng kết quả nồng độ ADN tổng số được tách chiết trực tiếp từ dấu vết máu; biểu đồ về hình thái các peak biểu thị cho các alen thu được ở 16 locus gen theo hệ STR (IdentifilerTM), qua đó giúp giám định viên gián tiếp đánh giá số lượng và chất lượng đối với từng alen của ADN tách chiết được từ mẫu máu cần khảo sát. Việc sử dụng kỹ thuật định lượng bằng realtime PCR chỉ là một khâu trong quy trình giám định giúp đánh giá được về hàm lượng ADN tách chiết được từ các dấu vết máu, từ đó định hướng điều chỉnh hàm lượng ADN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR.

Kết quả định lượng bằng Real time PCR không hoàn toàn phản ánh chất lượng ADN phục vụ cho phản ứng PCR các locus hệ Identifiler 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã giặt bằng xà phòng. - Mẫu thực nghiệm được tạo ra và thu từ các vụ án mà cơ quan điều tra công an các tỉnh thành trong cả nước gửi giám định ADN tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Nội dung nghiên cứu 4.

Sử dụng các phương pháp để tách chiết ADN Qua tham khảo tài liệu và thực tế giám định tại Viện Khoa học hình sự hiện nay cho thấy có 2 phương pháp tách chiết thông dụng và đạt hiệu quả đảm bảo cho quá trình giám định ADN từ dấu vết máu đó là: - Phương pháp tách chiết bằng chelex 5%. Phương pháp tách chiết bằng chelex 5% là phương pháp thông dụng nhất, giá thành rẻ, dễ thao tác, nhanh. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi chất lượng của ADN phải tốt, số lượng của ADN phải tương đối nhiều có độ tinh khiết cao. Như vậy dấu vết gửi giám định phải tương đối tốt ít bị biến tính.

- Phương pháp tách chiết bằng bộ kít PrepFiler. Phương pháp tách chiết bằng bộ kit tách chiết PrepFiler cho hiệu quả cao và tối ưu nhất hiện nay áp dụng đối với các mẫu có hàm lượng ADN thấp, bị biến tính và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế. Tuy nhiên giá thành cao, dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác. Bởi vậy chúng ta phải có những khảo sát để có được sự lựa chọn phù hợp.

Xác định phương pháp tách chiết tối ưu với từng loại mẫu vật cụ thể, vì lượng dấu vết trong các vụ án thường không nhiều nếu chúng ta lựa chọn K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang không đúng phương pháp tách chiết thì có thể sẽ sử dụng hết mẫu vật mà vẫn không cho kết quả. Ngoài ra việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết còn vừa tiết kiệm chi phí vừa tiết kiệm thời gian. Quy trình đánh giá và kết quả dự kiến - Sản phẩm tách chiết được định lượng bằng phương pháp Real-time. Mỗi mẻ thí nghiệm sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp chelex 5% và bộ kít PrepFiler sẽ được chạy phản ứng PCR , sau đó điện di phân tích kết quả.

- Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi phương pháp chelex 5% và bộ kít PrepFiler sẽ được so sánh, đánh giá lượng ADN thu được bằng phương pháp định lượng, chạy PCR và phân tích kết quả hình ảnh điện di từ đó rút ra phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất. - Trên cơ sở kết quả của các phương pháp tách chiết, luận văn dự kiến sẽ áp dụng phương pháp tách chiết phù hợp cho dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5. Ý nghĩa khoa học Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, đã tách chiết được lượng ADN hiệu quả nhất nhờ lựa chọn đúng phương pháp phù hợp đối với dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự, góp phần rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí.