MỞ ĐẦU Các cuộc chiến tranh bảo vệ tổ quốc của dân tộc Việt Nam đã lùi xa nhiều năm nhưng những hậu quả của cuộc chiến vẫn vô cùng nặng nề, nó ảnh hưởng rất lớn đến đời sống văn hoá tinh thần của người dân, nhất là những người có người thân đã hi sinh trong sự nghiệp đấu tranh giành độc lập của dân tộc. Ở nước ta hiện nay, một số lượng lớn hài cốt các chiến sĩ đã hi sinh trong các cuộc chiến tranh giành độc lập của dân tộc vẫn chưa xác định được danh tính. Vì vậy, vấn đề cấp bách được đặt ra đối với đảng, nhà nước và nhân dân ta là xác xác định danh tính hài cốt liệt sĩ còn thiếu thông tin. Do sự thiếu hụt các thông tin cá nhân liên quan cũng như hồ sơ y tế và dữ liệu răng hàm mặt, nên việc xác định danh tính liệt sĩ - nhận dạng pháp y chủ yếu phụ thuộc vào việc giám định ADN từ các bộ xương có sẵn, bao gồm xương và răng [1-3].
Mẫu hài cốt liệt sĩ Việt Nam được thu thập tại các nghĩa trang khác nhau trên cả nước nên độ phân hủy cũng khác nhau, mức độ phân huỷ tùy thuộc vào điều kiện khí hậu thổ nhưỡng từng vùng. Tuổi của mẫu khác nhau theo từng thời kỳ kháng chiến nên mẫu có tuổi càng lớn thì mức độ bị phân hủy mẫu do môi trường tác động càng mạnh. Hơn nữa, điều kiện mai táng và tác động của vi sinh vật trong đất cũng là những yếu tố ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự toàn vẹn của ADN trong mẫu [1, 4-6]. Những mẫu hài cốt này thường có chất lượng kém nên gây khó khăn trong nhận dạng pháp y.
Vì vậy, việc lựa chọn phương pháp giám định ADN là rất cần thiết, giúp giảm thời gian, công sức và chi phí giám định. Trên thế giới và Việt Nam hiện nay, các phương pháp giám định ADN chủ yếu dựa vào các chỉ thị phân tử trên ADN ty thể (vùng D-loop) và ADN gen nhân (STR, SNP. Để áp dụng được các phương pháp giám định này trên mẫu xương hài cốt thì ADN tách chiết từ các mẫu này phải có chất lượng tốt và đồng đều. Các mẫu xương hài cốt ở Việt Nam thường có chất lượng và mức độ phân hủy khác nhau nên gây rất nhiều khó khăn cho việc tách chiết ADN.
Đã có rất nhiều các phương pháp tách chiết khác nhau đã được nghiên cứu và đưa ra bởi các nhà khoa học trên thế giới, trong đó mỗi phương pháp tách chiết lại tối ưu cho từng loại mẫu khác nhau [3]. Do đó, việc đánh giá và phân loại mẫu 2 dựa trên hình thái xương là rất cần thiết cho việc tối ưu hoá tách chiết ADN và xa hơn là nâng cao hiệu quả giám định. Xuất phát từ các cơ sở khoa học và thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Hoàn thiện phương pháp phân loại nhanh mẫu xương dựa trên hình thái nhằm phục vụ công tác giám định hài cốt liệt sĩ tại Việt Nam”. Nghiên cứu này sẽ cung cấp các thông tin có giá trị cho phục vụ công tác giám định tại Trung tâm Giám định ADN.
Mục tiêu của đề tài: 1. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng tiêu chí đánh giá bên ngoài mẫu bao gồm: vị trí lấy mẫu và thang điểm Beyensmeyer đối với khả năng thu hồi ADN của mẫu hài cốt lâu năm. Góp phần hoàn thiện phương pháp phân loại nhanh mẫu xương dựa trên hình thái nhằm phục vụ công tác giám định hài cốt liệt sĩ tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Thu thập và phân loại mẫu hài cốt tại nghĩa trang liệt sĩ Quốc tế Việt Lào, huyện Anh Sơn, tỉnh Nghệ An.
Nội dung 2: Đánh giá độ phong hóa mẫu dựa trên thang điểm Behrensmeyer. Nội dung 3: Đánh giá khả năng thu hồi ADN từ các mẫu nghiên cứu và đánh giá mối tương quan giữa hình thái mẫu và các kết quả ADN thu được. Nội dung 4: Phân tích trình tự ADN ty thể mẫu nghiên cứu. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.
TỔNG QUAN HỆ XƯƠNG NGƯỜI 1. Giải phẫu hệ xương người Xương là những bộ phận rắn được cấu tạo bởi mô liên kết rắn có 4 chức năng: Nâng đỡ: tạo 1 khung cứng để nâng đỡ cơ thể và là nơi bám của các cơ Bảo vệ: xương đầu mặt bảo vệ não, lồng ngực bảo vệ tim phổi, khung chậu bảo vệ bàng quang, tử cung. Vận động: các cơ bám vào xương, khi cơ co sẽ làm xương chuyển động quanh các khớp. Tạo máu và trao đổi các chất: tủy xương tạo hồng cầu, bạch cầu hạt và tiểu cầu.
Xương cũng là nơi dự trữ và trao đổi mỡ, canxi, phốt pho khi cần cơ thể có thể huy động lấy ra. Bộ xương người nhìn từ phía trước và sau [7] 4 Bộ xương người trưởng thành gồm 206 xương phần lớn là xương đôi được phân thành 3 nhóm chính (hình 1. Mỗi chi có 3 đoạn: cánh tay hoặc đùi, cẳng tay hoặc cẳng chân, bàn tay hoặc bàn chân (gồm có cổ tay hoặc cổ chân, bàn tay hoặc bàn chân, ngón tay hoặc ngón chân). Cấu trúc xương được tạo thành từ hai loại mô xương: xương vò và xương ống.
Xương mình gồm cột sống (hình 1.2) và lồng ngực (hình 1. Cột sống có 32 đốt sống, trong đó có 5 đốt sống cùng dính liền nhau tạo nên xương cùng và 3 đốt sống cụt cũng dính liền nhau tạo nên xương cụt. Lồng ngực gồm có đoạn cột sống ngực, xương ức và 12 đôi xương sườn. Xương cột sống của con người [9] 5 Hình 1.
Xương lồng ngực của con người [9] Xương sọ mặt gồm 8 xương sọ và 14 xương mặt hợp thành hộp sọ và khối xương mặt (hình 1. Xương sọ của con người [9] Về mặt đại thể, xương gồm 2 dạng (loại) cấu tạo (hình 1.5): Xương dẹt và đầu của xương dài: gồm có một lớp bên ngoài vững chắc (vỏ xương) bao quanh một mạng lưới chịu lực hình thành từ lá xương tạo thành một hệ thống vách mỏng không đều được gọi là bè xương, xếp theo nhiều hướng khác nhau và có thể nối với nhau gọi là mô xốp. Giữa các bè có những hốc chứa tủy xương. 6 Xương dài: Phần thân xương có các lá xương xếp đồng tâm tạo thành những cấu trúc đặc biệt được gọi là hệ thống Havers.
Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm những lá xương xếp vòng, ở chính giữa khối trụ đó là ống Havers chứa mạch máu, mô liên kết [10, 11]. Giải phẫu vỏ xương [11] Ở mức độ hiển vi, xương cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên trong hoặc xen lẫn giữa chúng là bốn loại tế bào: tiền tạo cốt bào, tạo cốt bào, cốt bào và hủy cốt bào (hình 1. Tiền tạo cốt bào (Osteoprogenitor cells) là các tế bào gốc xương không chuyên biệt có nguồn gốc từ trung mô. Chúng là những tế bào xương duy nhất trải qua quá trình phân chia tế bào; các tế bào này sẽ phát triển thành các nguyên bào xương.
Các tế bào tiền thân xương được tìm thấy dọc theo phần bên trong của màng xương, ở lớp nội mạc và trong các ống chứa mạch máu trong xương. Tạo cốt bào (Osteoblasts) là tế bào tạo xương. Chúng tổng hợp, tiết ra các sợi collagen và các thành phần hữu cơ khác cần thiết để xây dựng ma trận ngoại bào của mô xương và chúng bắt đầu quá trình vôi hóa. Khi ma trận ngoại bào bao quanh các nguyên bào xương, chúng bị mắc kẹt trong chất tiết và trở thành tế bào xương.
7 Cốt bào (Osteocyte), tế bào xương trưởng thành là những tế bào chính trong mô xương và duy trì quá trình trao đổi chất hàng ngày của nó, chẳng hạn như trao đổi chất dinh dưỡng và chất thải bằng máu. Giống như các nguyên bào xương, tế bào xương không trải qua quá trình phân chia tế bào. Hủy cốt bào (Osteoclasts) là những tế bào khổng lồ có nguồn gốc từ sự hợp nhất của khoảng 50 tế bào đơn nhân (một loại tế bào bạch cầu) và tập trung ở nội mạc, nằm trên vách xương trong một cấu trúc gọi là ổ Howship (hay hố tái hấp thu), trong bào tương có nhiều ti thể, các bào quan khác kém phát triển. Chúng là tế bào tiêu hủy xương và hủy sụn nhiễm can xi với cường độ cao, đóng vai trò quyết định trong việc tu sửa xương.
Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt trong tủy xương [12-14] Hình 1. Các loại tế bào trong mô xương [14] 1. Thành phần hóa học của xương Xương là một vật liệu tổng hợp bao gồm cả thành phần vô cơ và hữu cơ. Thành phần vô cơ chủ yếu là hydroxyapatite (HA): Ca5(PO4)3(OH).
Thành phần hữu cơ của xương bao gồm hơn 30 protein với collagen loại I chiếm nhiều nhất (>90%). Theo trọng lượng, thành phần vô cơ chiếm khoảng 60% trong khi thành phần hữu cơ chiếm khoảng 30%, 10% còn lại là nước. Theo thể tích, thành phần vô cơ, thành phần hữu cơ và nước lần lượt là khoảng 40%, 35% và 25% [15-17]. 8 Thành phần hữu cơ của xương được tạo thành từ khoảng 90% sợi collagen loại I và 10% protein khác, chẳng hạn như glycoprotein, osteocalcin và proteoglycans [10].
Nó tạo thành khung cho xương, được làm cứng lại thông qua sự lắng đọng canxi và các khoáng chất khác xung quanh các sợi [18]. Thành phần vô cơ là muối khoáng được lắng đọng giữa các khoảng trống trong các lớp collagen, sau khi các khoảng trống này được lấp đầy, các khoáng chất sẽ tích tụ xung quanh các sợi collagen, kết tinh và làm cho mô cứng lại; quá trình này được gọi là cốt hóa [19]. Độ cứng của xương phụ thuộc vào loại và số lượng khoáng chất mà cơ thể có thể sử dụng; hydroxyapatite là một trong những khoáng chất chính có trong xương. Mặc dù xương cần đủ khoáng chất để tăng cường sức mạnh nhưng chúng cũng cần tránh bị gãy bằng cách duy trì đủ độ dẻo để chịu được các lực tác động hàng ngày lên chúng.
Tính mềm dẻo và độ cứng của xương có được từ các sợi collagen. Quá trình khoáng hóa quá mức của các sợi hoặc sản xuất collagen bị suy giảm có thể làm tăng độ giòn của xương như với chứng rối loạn di truyền tạo xương không hoàn hảo [20]. Xương khô còn 2/3 là chất vô cơ và 1/3 là chất hữu cơ: - Chất hữu cơ (33,30%): chủ yếu là chất cốt giao (osseine), gồm các sợi keo và các tế bào xương. - Chất vô cơ (66,70%): chủ yếu là các chất muối vôi.
Canxi photphat: 51,04% Canxi cacbonat: 11,30% Canxi florua: 2.