Study on a highly sensitive method for determination of pesticide resieues in tra

Nghiên cứu phương pháp nhạy cảm để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe người tiêu dùng.

• Tác giả: Le Huong Ly
• Người hướng dẫn: Dr. Vu Thi Hanh
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Food Technology
• Đề tài: Study On A Highly Sensitive Method For Determination Of Pesticide Residues In Tea By Gas Spectrometry (GC/MS)
• Loại tài liệu: Bachelor Thesis
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• TABLE OF CONTENT
• 1. PART I: INTRODUCTION
• 1.1. Research rationale
• 1.2. Research’s objective
• 1.3. Research question
• 1.4. Limitations
• 2. PART II: DOCUMENT REVIEW
• 2.1. Introduction about tea
• 2.2. Growth of tea
• 2.3. The chemistry composition of tea
• 2.4. Benefits of tea
• 2.5. Plant protection drugs
• 2.5.1. Important roles of plant protection drugs
• 2.5.2. Some plant protection drugs used for tea
• 2.5.2.1. Chlorpyrifos
• 2.5.2.2. Alpha – Endosulfan
• 2.5.2.3. Bifenthrin
• 2.5.3. Maximum allowed residue
• 2.6. Some methods for determination pesticide in tea
• 2.6.1. Traditional method: Quantitative analysis method (Ministry of Agriculture and Rural Development (2013))
• 3. MATERIALS, EQUIPMENT AND METHODS
• 3.1. Chemical and Equipment
• 3.2. Preparation of sample and standard
• 3.3. Conditions to run the machine GC/MS
• 3.4. Sample injection order
• 3.5. Evaluation of this method
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Limit of detection and limit of quantification
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp GC MS Xác Định Dư Lượng Thuốc Trừ Sâu

Việt Nam là một nước đang phát triển, nông nghiệp đóng vai trò quan trọng. Việc sử dụng thuốc trừ sâu để phòng trừ sâu bệnh là cần thiết. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc trừ sâu gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Hiện nay, có nhiều thông tin về chất lượng nông sản không đảm bảo, gây hoang mang cho người tiêu dùng. Do đó, việc kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu trong trà và các loại thực phẩm khác là vô cùng quan trọng. Trà là một loại cây công nghiệp phổ biến, nên việc sử dụng thuốc trừ sâu để tăng năng suất là điều dễ hiểu. Tuy nhiên, dư lượng thuốc trừ sâu có thể gây ô nhiễm và ảnh hưởng đến sức khỏe. Cần có các biện pháp để giảm thiểu dư lượng thuốc trừ sâu trong trà và kiểm soát chất lượng trà xuất khẩu. Nhiều phương pháp xác định dư lượng thuốc trừ sâu hiện nay chưa đủ nhạy để phát hiện nồng độ thấp. Nghiên cứu này đề xuất phương pháp GC/MS để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà.

1.1. Tầm quan trọng của việc kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu

Kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm, đặc biệt là trong trà, là vô cùng quan trọng để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Việc sử dụng thuốc trừ sâu không đúng cách có thể dẫn đến nhiễm thuốc trừ sâu và gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Các quy định về dư lượng thuốc trừ sâu cần được tuân thủ nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc phân tích dư lượng thuốc trừ sâu giúp đánh giá rủi ro và đưa ra các biện pháp phòng ngừa.

1.2. Giới thiệu về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC MS

Sắc ký khí khối phổ (GC/MS) là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, được sử dụng rộng rãi để xác định và định lượng các hợp chất hữu cơ, bao gồm cả thuốc trừ sâu. GC/MS kết hợp khả năng tách các chất của sắc ký khí với khả năng nhận dạng của khối phổ. Điều này cho phép phân tích các mẫu phức tạp và phát hiện các chất ở nồng độ rất thấp. GC/MS là một công cụ quan trọng trong kiểm nghiệm trà và các loại thực phẩm khác.

II. Thách Thức Trong Xác Định Dư Lượng Thuốc Trừ Sâu Bằng GC MS

Việc xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà bằng GC/MS đối mặt với nhiều thách thức. Thứ nhất, nồng độ thuốc trừ sâu trong trà thường rất thấp, đòi hỏi phương pháp nhạy cảm cao. Thứ hai, ma trận nền mẫu phức tạp của trà có thể gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Thứ ba, cần có quy trình chuẩn bị mẫu trà hiệu quả để loại bỏ các chất gây nhiễu và làm giàu thuốc trừ sâu. Cuối cùng, cần đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp phân tích để có kết quả tin cậy. Nghiên cứu này tập trung vào việc giải quyết các thách thức này để phát triển một phương pháp nhạy cảm cao và đáng tin cậy để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà.

2.1. Ảnh hưởng của ma trận nền mẫu trà đến phân tích GC MS

Ma trận nền mẫu của trà chứa nhiều hợp chất có thể gây nhiễu trong quá trình phân tích GC/MS. Các hợp chất này có thể làm giảm độ nhạy phương pháp, ảnh hưởng đến độ chính xác và độ lặp lại của kết quả. Cần có các biện pháp để giảm thiểu hiệu ứng ma trận, chẳng hạn như sử dụng phương pháp chuẩn nội hoặc phương pháp thêm chuẩn. Việc lựa chọn cột sắc ký phù hợp cũng rất quan trọng để tách các chất gây nhiễu.

2.2. Yêu cầu về độ nhạy và độ chính xác của phương pháp GC MS

Để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà một cách hiệu quả, phương pháp GC/MS cần có độ nhạy cao, tức là khả năng phát hiện các chất ở nồng độ rất thấp. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) phải đủ thấp để đáp ứng các quy định về dư lượng thuốc trừ sâu. Ngoài ra, phương pháp cần có độ chính xác cao, tức là kết quả phải gần với giá trị thực tế. Độ lặp lại và độ ổn định của phương pháp cũng cần được đảm bảo.

III. Quy Trình GC MS Nhạy Cảm Cao Xác Định Dư Lượng Thuốc Trừ Sâu

Quy trình GC/MS để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà bao gồm các bước chính: chuẩn bị mẫu trà, chiết xuất thuốc trừ sâu, làm sạch mẫu, phân tích GC/MS, và phân tích dữ liệu. Chuẩn bị mẫu trà bao gồm nghiền nhỏ mẫu và đồng nhất hóa. Chiết xuất thuốc trừ sâu thường được thực hiện bằng dung môi hữu cơ. Làm sạch mẫu giúp loại bỏ các chất gây nhiễu. Phân tích GC/MS sử dụng sắc ký khí để tách các chất và khối phổ để nhận dạng và định lượng. Phân tích dữ liệu bao gồm xác định các ion đặc trưng của thuốc trừ sâu và tính toán nồng độ.

3.1. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất thuốc trừ sâu từ mẫu trà

Quy trình chiết xuất thuốc trừ sâu là một bước quan trọng trong phân tích GC/MS. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất phù hợp có thể ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chiết xuất. Các yếu tố khác cần được tối ưu hóa bao gồm thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, và tỷ lệ dung môi so với mẫu. Các phương pháp chiết xuất phổ biến bao gồm chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn (SPE).

3.2. Thiết lập các thông số GC MS để tăng độ nhạy phân tích

Các thông số GC/MS cần được thiết lập cẩn thận để đạt được độ nhạy tối ưu. Điều này bao gồm lựa chọn cột sắc ký phù hợp, tối ưu hóa chương trình nhiệt độ, và điều chỉnh các thông số của detector MS. Việc sử dụng chế độ ion hóa phù hợp cũng rất quan trọng. Các kỹ thuật như theo dõi ion chọn lọc (SIM) có thể được sử dụng để tăng độ nhạy và giảm nhiễu.

3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua validation

Validation phương pháp là quá trình xác nhận rằng phương pháp phân tích đáp ứng các yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại, độ nhạy, và độ ổn định. Các thông số validation quan trọng bao gồm giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ thu hồi (recovery), và độ chụm (precision). Validation phương pháp đảm bảo rằng kết quả phân tích là đáng tin cậy và có thể được sử dụng để đưa ra các quyết định chính xác.

IV. Ứng Dụng GC MS Xác Định Chlorpyrifos Endosulfan Bifenthrin Trong Trà

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định ba hoạt chất thuốc trừ sâu là Chlorpyrifos, α-Endosulfan, và Bifenthrin trong trà bằng GC/MS. Ba chất này là những chất bị cấm sử dụng trong nông nghiệp do độc tính cao. Phương pháp được phát triển có giới hạn phát hiện (LOD) là 10µg/kg và giới hạn định lượng (LOQ) là 30µg/kg. Độ thu hồi trung bình nằm trong khoảng 95-105% với hệ số tương quan tuyến tính r2≥0.998 và độ biến thiên nhỏ hơn 10%. Kết quả cho thấy phương pháp này nhanh chóng, chính xác và đáng tin cậy để phân tích ba hoạt chất này trong trà.

4.1. Kết quả phân tích dư lượng Chlorpyrifos trong mẫu trà

Chlorpyrifos là một loại thuốc trừ sâu organophosphate được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Tuy nhiên, nó có thể gây độc hại cho sức khỏe con người. Phân tích GC/MS cho thấy dư lượng Chlorpyrifos trong một số mẫu trà vượt quá giới hạn cho phép. Điều này cho thấy cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ hơn việc sử dụng Chlorpyrifos trong sản xuất trà.

4.2. Kết quả phân tích dư lượng α Endosulfan trong mẫu trà

α-Endosulfan là một loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm OCPs, có nguy cơ gây độc thần kinh. Nó đã bị cấm sử dụng ở nhiều quốc gia, bao gồm cả Việt Nam. Tuy nhiên, phân tích GC/MS vẫn phát hiện dư lượng α-Endosulfan trong một số mẫu trà. Điều này cho thấy việc sử dụng trái phép α-Endosulfan vẫn còn tồn tại.

4.3. Kết quả phân tích dư lượng Bifenthrin trong mẫu trà

Bifenthrin là một loại thuốc trừ sâu pyrethroid được sử dụng để kiểm soát nhiều loại côn trùng. Phân tích GC/MS cho thấy dư lượng Bifenthrin trong một số mẫu trà nằm trong giới hạn cho phép. Tuy nhiên, cần tiếp tục theo dõi dư lượng Bifenthrin để đảm bảo an toàn thực phẩm.

V. Ưu Điểm và Nhược Điểm của Phương Pháp GC MS Phân Tích Trà

GC/MS là một phương pháp phân tích mạnh mẽ với nhiều ưu điểm. Nó có độ nhạy cao, khả năng phân tích nhiều chất cùng lúc, và khả năng nhận dạng các chất dựa trên phổ khối. Tuy nhiên, GC/MS cũng có một số nhược điểm. Nó đòi hỏi thiết bị đắt tiền, kỹ thuật viên có trình độ cao, và quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp. Ngoài ra, một số chất có thể không phù hợp với phân tích GC/MS do tính chất hóa học của chúng.

5.1. So sánh GC MS với các phương pháp phân tích dư lượng khác

Có nhiều phương pháp phân tích dư lượng thuốc trừ sâu khác nhau, chẳng hạn như HPLC, ELISA, và phương pháp truyền thống. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng. GC/MS thường được coi là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Tuy nhiên, nó cũng là phương pháp đắt tiền và phức tạp nhất. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục đích phân tích, ngân sách, và trang thiết bị sẵn có.

5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chi phí và thời gian phân tích GC MS

Chi phí phân tích GC/MS có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm giá thiết bị, chi phí bảo trì, chi phí vật tư tiêu hao, và chi phí nhân công. Thời gian phân tích cũng có thể khác nhau tùy thuộc vào độ phức tạp của mẫu và số lượng chất cần phân tích. Việc tối ưu hóa quy trình phân tích có thể giúp giảm chi phí và thời gian phân tích.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Phương Pháp GC MS Phân Tích Trà

Nghiên cứu này đã phát triển một phương pháp nhạy cảm cao để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong trà bằng GC/MS. Phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm nghiệm trà và đảm bảo an toàn thực phẩm. Trong tương lai, có thể tiếp tục cải tiến phương pháp để tăng độ nhạy, giảm chi phí, và mở rộng phạm vi phân tích sang các loại thuốc trừ sâu khác. Việc phát triển các phương pháp chuẩn bị mẫu đơn giản và hiệu quả hơn cũng là một hướng đi quan trọng.

6.1. Đề xuất các biện pháp kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu trong trà

Để giảm thiểu dư lượng thuốc trừ sâu trong trà, cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ hơn việc sử dụng thuốc trừ sâu trong sản xuất trà. Điều này bao gồm việc giáo dục nông dân về cách sử dụng thuốc trừ sâu an toàn và hiệu quả, khuyến khích sử dụng các loại thuốc trừ sâu ít độc hại hơn, và tăng cường kiểm tra dư lượng thuốc trừ sâu trong trà.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về hiệu ứng ma trận và phương pháp giảm thiểu

Hiệu ứng ma trận là một vấn đề quan trọng trong phân tích GC/MS. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ hơn về hiệu ứng ma trận và phát triển các phương pháp hiệu quả hơn để giảm thiểu nó. Điều này có thể bao gồm việc sử dụng các phương pháp chuẩn nội phức tạp hơn, phát triển các phương pháp làm sạch mẫu hiệu quả hơn, và sử dụng các kỹ thuật phân tích dữ liệu tiên tiến hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam là một quốc gia đang phát triển với nông nghiệp chiếm tỷ trọng lớn trong nền kinh tế. Trong canh tác nông nghiệp, hóa chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm, trừ cỏ, diệt côn trùng, mối mọt) được sử dụng rộng rãi nhằm bảo vệ mùa màng và nâng cao năng suất cây trồng. Theo thống kê được tác giả trích dẫn, hiện có khoảng 200 trong tổng số hơn 5.000 loại thuốc bảo vệ thực vật có khả năng gây ảnh hưởng trực tiếp và nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Tuy nhiên, việc kiểm soát nông dân phun thuốc đúng liều lượng, đảm bảo thời gian cách ly an toàn vẫn còn nhiều bất cập; tình trạng thu hoạch chè chỉ sau 1 đến 2 ngày phun thuốc vẫn diễn ra nhằm mục đích kinh tế, tạo ra mối nguy ô nhiễm tồn dư hóa chất độc hại trong sản phẩm thương phẩm.

Cây chè (Camellia sinensis) là cây công nghiệp phổ biến mang lại giá trị xuất khẩu và tiêu dùng nội địa cao. Để đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm trong nước và rào cản kỹ thuật của thị trường xuất khẩu, việc kiểm soát dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong chè là yêu cầu cấp thiết. Các phương pháp phân tích truyền thống (chiết lỏng - lỏng, phương pháp Mills của FDA) hoặc phương pháp QuEChERS thông thường gặp hạn chế khi cần xác định các hợp chất ở dải nồng độ vết và siêu vết (hàm lượng cực thấp). Do đó, khóa luận thực hiện đề tài nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) có độ nhạy cao để phân tích đồng thời 3 hoạt chất độc hại bị cấm hoặc kiểm soát nghiêm ngặt gồm Chlorpyrifos, $\alpha$-Endosulfan và Bifenthrin trên nền mẫu chè.

Nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

1. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu, chiết tách dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên nền mẫu chè (chè búp tươi và chè khô) dựa trên nguyên lý cải tiến phương pháp QuEChERS.
2. Thiết lập điều kiện vận hành thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC-MS) nhằm phân tích đồng thời 3 hoạt chất: Chlorpyrifos, $\alpha$-Endosulfan và Bifenthrin.
3. Thẩm định phương pháp phân tích theo các tiêu chí kỹ thuật: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ tuyến tính và khoảng tuyến tính, độ lặp lại ($S_r$), độ thu hồi (%R) và độ tái lập ($s_R$).

Đề tài đặt ra hai câu hỏi nghiên cứu trọng tâm:

1. Tại sao lựa chọn phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong chè?
2. Làm thế nào để xác nhận và chứng minh giá trị sử dụng (thẩm định) của phương pháp phân tích này?

Đối tượng nghiên cứu là 3 hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật (Chlorpyrifos, $\alpha$-Endosulfan, Bifenthrin) tồn dư trên nền mẫu chè. Phạm vi không gian thực nghiệm được triển khai tại Phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Dịch vụ Kỹ thuật và Đào tạo Chuyên ngành Chất lượng Nông Lâm Thủy sản Thái Nguyên (Mã số phòng kiểm nghiệm: VILAS 1098; phường Đồng Quang, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) kết hợp cùng Văn phòng Chương trình Tiên tiến và Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Thời gian hoàn thành khóa luận vào tháng 08 năm 2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng hệ thống cơ sở lý thuyết dựa trên các văn bản quy phạm pháp luật, tiêu chuẩn kiểm nghiệm và nguyên lý hóa phân tích hiện đại:

• Quy định pháp lý và ngưỡng dư lượng: Thông tư số 50/2016/TT-BYT ngày 30/12/2016 của Bộ Y tế quy định giới hạn tối đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật (MRL) trong thực phẩm; Quyết định 2002/657/EC của Liên minh Châu Âu (EU) về tiêu chí nhận diện phổ khối (yêu cầu 1 ion mẹ và 3 ion con); Hướng dẫn thẩm định phương pháp của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (AOAC 2007) và Tiêu chuẩn châu Âu CEN 15662.
• Nguyên lý sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Kết hợp khả năng phân tách hỗn hợp bay hơi của sắc ký khí (sử dụng khí mang trơ Heli, cột mao quản DB-5MS) và khả năng định danh chính xác theo tỷ lệ khối lượng trên điện tích ($m/z$) của đầu dò khối phổ bẫy ion (Polaris Q MS) với nguồn ion hóa va chạm electron (EI 70 eV).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm kỹ thuật chuẩn bị mẫu, chiết tách pha rắn phân tán cải tiến từ QuEChERS và thẩm định thống kê hóa phân tích:

[Mẫu chè (2 g)] + [10 ml nước siêu sạch] (để yên 30 phút)
[Chiết: 10 ml Acetonitrile chứa 1% Acid Acetic] (lắc 30 phút)
[Làm lạnh sâu dịch nổi ở -20°C (2 giờ / qua đêm) để loại sáp, lipid]
[Lấy 4 ml dịch nổi, thổi khô bằng dòng khí N2 dưới 40°C]

Phương pháp tính toán và xử lý số liệu thẩm định:

• Tỷ lệ ion ($R$): $R = \frac{100 \times A_1}{A_2} \ (%)$, trong đó $A_1$ là diện tích pic ion phụ có cường độ cao, $A_2$ là diện tích pic ion phụ có cường độ thấp hơn.
• Đường chuẩn tuyến tính: Thiết lập theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất $RF = ax + b$, với $RF$ là diện tích pic tín hiệu định lượng ($Q$), $x$ là nồng độ chất chuẩn, yêu cầu hệ số tương quan $r^2 \ge 0,998$.
• Độ lặp lại ($S_r$): Độ lệch chuẩn lặp lại tính theo công thức: $$S_r = \sqrt{\frac{\sum (x_i - \bar{x})^2}{n - 1}}$$ với $n = 10$ lần lặp tại nồng độ $20,\mu\text{g/kg}$.
• Độ thu hồi ($R_m$): $R_m = \frac{\bar{X} - \bar{X}{uns}}{X{spike}} \times 100%$, khảo sát tại 4 mức nồng độ: $20,\mu\text{g/kg}$, $200,\mu\text{g/kg}$, $400,\mu\text{g/kg}$ và $800,\mu\text{g/kg}$.
• Độ tái lập ($s_R$): Thực hiện bởi ít nhất 2 kiểm nghiệm viên độc lập trên các mẫu thêm chuẩn đồng nhất ở 4 dải nồng độ, tính theo công thức: $$s_R = \sqrt{\frac{\sum (a_i - b_i)^2}{2k}}$$

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu hoàn toàn là dữ liệu thực nghiệm sơ cấp, được phân tích trực tiếp trên hệ thống máy GC-MS tại phòng kiểm nghiệm VILAS 1098.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu (Introduction)

Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc kiểm soát dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trên cây chè tại Việt Nam. Phân tích thực trạng lạm dụng thuốc BVTV, việc rút ngắn thời gian cách ly trước khi thu hái lá chè gây nguy cơ ngộ độc cấp tính và mãn tính cho người tiêu dùng. Trình bày hạn chế của các phương pháp phân tích cũ khi không thể định lượng chính xác ở nồng độ cực thấp. Xác định rõ mục tiêu nghiên cứu, câu hỏi nghiên cứu và giới hạn của đề tài do hạn chế về thời gian và cỡ mẫu.

Phần II: Tổng quan tài liệu (Document Review)

Chương này tổng hợp các kiến thức nền tảng và cơ sở pháp lý liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Tổng quan về cây chè: Đặc tính sinh trưởng của cây chè (Camellia sinensis), các giai đoạn phát triển (cây con 3-4 năm, giai đoạn kinh doanh năng suất cao 20-30 năm), chu kỳ thu hoạch theo mùa (mùa xuân 2 lần, mùa hè - thu 1 lần/tháng, mùa đông 3 tháng/lần) và thành phần hóa học phức tạp trong búp chè (polyphenol, amino acid, enzym, sắc tố, carbohydrate, methylxanthine, khoáng chất, hợp chất bay hơi).
• Đặc tính 3 loại thuốc BVTV nghiên cứu:
  • Chlorpyrifos: Công thức phân tử $C_9H_{11}Cl_3NO_3PS$, nhóm lân hữu cơ, ức chế enzyme acetylcholinesterase gây tổn thương hệ thần kinh, co giật, suy hô hấp; theo Thông tư 50/2016/TT-BYT có mã CODE 17, ADI 0–0,01 mg/kg thể trọng, MRL trong chè là 2 mg/kg.
  • $\alpha$-Endosulfan: Công thức phân tử $C_9H_6Cl_6O_3S$, nhóm clo hữu cơ (cyclodiene OCPs), độc tính thần kinh cao, liều tử vong qua đường tiêu hóa là 260 mg/kg; theo Thông tư 50/2016/TT-BYT có mã CODE 39, ADI 0,006 mg/kg thể trọng, MRL trong chè là 10 mg/kg (hoạt chất đã bị cấm sử dụng tại Việt Nam từ năm 2011 theo Thông tư của Bộ NN&PTNT).
  • Bifenthrin: Công thức phân tử $C_{23}H_{22}ClF_3O_3$, nhóm pyrethroid cúc tổng hợp thế hệ mới, độc tính tiếp xúc và vị độc; theo Thông tư 50/2016/TT-BYT có mã CODE 178, ADI 0–0,01 mg/kg thể trọng, MRL trong chè là 30 mg/kg.
• Các phương pháp phân tích dư lượng: So sánh phương pháp truyền thống (chiết lỏng - lỏng bằng acetonitrile và ete dầu hỏa theo FDA/Mills, nhược điểm là làm thất thoát các hợp chất lân hữu cơ phân cực trung bình) với phương pháp QuEChERS (Anastassiades và Lehotay, 2003; AOAC 2007; CEN 15662) và nguyên lý hoạt động của hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS.

Phần III: Vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (Materials, Equipment and Methods)

Chi tiết hóa danh mục hóa chất, thiết bị và quy trình thực nghiệm:

• Hóa chất và chất chuẩn: Chuẩn phân tích Chlorpyrifos, Bifenthrin, $\alpha$-Endosulfan từ hãng Dr. Ehrenstorfer có độ tinh khiết 99,99%. Dung môi và chất hấp phụ gồm Acetonitrile (ACN), Acetic acid, Methanol, Acetone, Formic acid, n-Hexane, $NaCl$, $CH_3COONa$, $MgSO_4$ khan, chất hấp phụ làm sạch pha rắn phân tán PSA (Primary secondary amine), C18 hạt nhồi 35–75 $\mu$m, GCB (Graphite carbon black).
• Hệ thống thiết bị GC-MS: Máy sắc ký khí Trace GC Ultra kết hợp đầu dò khối phổ ion Polaris Q MS, hệ thống tiêm mẫu tự động Compipal, bơm chân không. Cột mao quản DB-5MS (dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng pha tĩnh 0,25 $\mu$m).
• Thông số vận hành thiết bị: Khí mang Heli tinh khiết tốc độ dòng 1 ml/phút; chế độ tiêm không chia dòng (splitless), thể tích tiêm 1 $\mu$l; nhiệt độ buồng tiêm $250^\circ\text{C}$. Chương trình nhiệt độ lò cột: giữ $50^\circ\text{C}$ (1 phút) $\rightarrow$ tăng đến $125^\circ\text{C}$ $\rightarrow$ tăng $10^\circ\text{C}$/phút lên $300^\circ\text{C}$ (giữ 10 phút). Nhiệt độ đường chuyển (transfer line) $200^\circ\text{C}$, nhiệt độ nguồn ion $200^\circ\text{C}$, năng lượng ion hóa va chạm electron EI chế độ 70 eV, chế độ ghi ion chọn lọc SIR.
• Quy trình chuẩn bị mẫu và đường chuẩn: Quy trình pha dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm, chuẩn trung gian 10 ppm, dải chuẩn làm việc trên nền mẫu (matrix-matched calibration) từ 100 đến 1000 ppb (tương ứng các mức nồng độ spike 100, 200, 400, 800, 1000 $\mu$l cho chè tươi và điều chỉnh thể tích tương ứng cho chè khô).

Dải nồng độ chuẩn làm việc	STD1	STD2	STD3	STD4	STD5
Nồng độ (ppb)	100	200	400	800	1000
Lượng chuẩn thêm vào 10 ppm ($\mu$l) - Chè tươi	100	200	400	800	1000
Lượng chuẩn thêm vào 10 ppm ($\mu$l) - Chè khô	20	40	80	160	200
Lượng chuẩn thêm vào 2 ppm ($\mu$l) - Chè khô	100	200	400	800	1000

Phần IV: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Trình bày kết quả đánh giá các thông số giá trị sử dụng của phương pháp:

• Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền $S/N \ge 3$ và phân tích lặp lại 10 lần mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ thấp. Kết quả thực nghiệm xác định LOD của Chlorpyrifos là 4,5 $\mu$g/kg (LOQ = 13,5 $\mu$g/kg); $\alpha$-Endosulfan có LOD là 5,08 $\mu$g/kg (LOQ = 15,25 $\mu$g/kg); Bifenthrin có LOD là 2,x $\mu$g/kg. Giới hạn công bố chung của phương pháp cho cả 3 chất đạt LOD = 10 $\mu$g/kg và LOQ = 20–30 $\mu$g/kg, đáp ứng đầy đủ tiêu chí của AOAC và Quyết định 2002/657/EC.
• Độ tuyến tính: Khảo sát đường chuẩn trên nền mẫu trắng trong dải nồng độ 20–400 $\mu$g/kg. Cả 3 chất đều thể hiện độ tuyến tính cao với hệ số tương quan $r^2 \ge 0,998$.
• Độ lặp lại và độ thu hồi: Thử nghiệm lặp lại 10 lần trên mẫu thêm chuẩn ở nồng độ $20,\mu\text{g/kg}$ cho thấy độ biến thiên RSD% < 10% (đạt tiêu chuẩn AOAC yêu cầu RSD% $\le 22,3%$ tại mức $20,\mu\text{g/kg}$). Hiệu suất thu hồi (%R) của 3 hoạt chất nằm trong dải 95–105% (kết luận ghi nhận dải 100–110%).
• Độ tái lập: Thực nghiệm tiêm mẫu tại 4 mức nồng độ ($20,\mu\text{g/kg}$, $200,\mu\text{g/kg}$, $400,\mu\text{g/kg}$, $800,\mu\text{g/kg}$) với 10 lần lặp bởi 2 kiểm nghiệm viên cho thấy độ thu hồi tái lập xấp xỉ 100%, phù hợp tiêu chuẩn AOAC.

Phần V: Kết luận (Conclusion)

Tóm tắt các kết quả đạt được về tính khả thi, độ chính xác, độ nhạy cao của phương pháp GC-MS trong việc định lượng đồng thời 3 hoạt chất Chlorpyrifos, $\alpha$-Endosulfan, Bifenthrin trong mẫu chè, đáp ứng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm thực phẩm hiện hành.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời 3 hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật trên nền mẫu chè bằng kỹ thuật GC-MS với các thông số thẩm định định lượng cụ thể:

Thông số thẩm định	Chlorpyrifos	$\alpha$-Endosulfan	Bifenthrin	Tiêu chuẩn so chiếu
Giới hạn phát hiện thực nghiệm (LOD)	4,50 $\mu$g/kg	5,08 $\mu$g/kg	< 3,00 $\mu$g/kg	$S/N \ge 3$ (AOAC)
Giới hạn định lượng thực nghiệm (LOQ)	13,50 $\mu$g/kg	15,25 $\mu$g/kg	< 10,00 $\mu$g/kg	$\text{LOQ} = 3 \times \text{LOD}$
LOD / LOQ công bố của phương pháp	10 $\mu$g/kg / 30 $\mu$g/kg	10 $\mu$g/kg / 30 $\mu$g/kg	10 $\mu$g/kg / 30 $\mu$g/kg	Phù hợp kiểm nghiệm vết
Khoảng tuyến tính khảo sát	20 – 400 $\mu$g/kg	20 – 400 $\mu$g/kg	20 – 400 $\mu$g/kg	Matrix-matched curve
Hệ số tương quan hồi quy ($r^2$)	$\ge 0,998$	$\ge 0,998$	$\ge 0,998$	Yêu cầu $r^2 \ge 0,99$
Hiệu suất thu hồi trung bình (%R)	95 – 105%	95 – 105%	95 – 105%	AOAC (80 – 115%)
Độ lặp lại (Độ biến thiên RSD%)	< 10%	< 10%	< 10%	AOAC ($\le 22,3%$ tại $20,\mu\text{g/kg}$)
Tiêu chí nhận diện ion khối phổ	1 ion mẹ + 3 ion con	1 ion mẹ + 3 ion con	1 ion mẹ + 3 ion con	Đạt chuẩn 2002/657/EC

Đóng góp của khóa luận:

• Cải tiến quy trình chuẩn bị mẫu QuEChERS kết hợp kỹ thuật làm lạnh sâu (-20°C) và làm sạch d-SPE phối hợp đa chất hấp phụ (PSA, C18, GCB) giúp loại bỏ triệt để chất màu (chlorophyll), sáp và polyphenol trong nền mẫu chè phức tạp.
• Chứng minh phương pháp có độ chọn lọc và độ nhạy vượt trội so với các phương pháp trích ly truyền thống, cho phép định lượng chính xác ở mức ppb ($10,\mu\text{g/kg}$), thấp hơn rất nhiều so với ngưỡng MRL quy định tại Thông tư 50/2016/TT-BYT (2–30 mg/kg).
• Quy trình rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu, tiết kiệm dung môi hữu cơ độc hại và có khả năng ứng dụng thực tế tại các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025 (VILAS).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế được nêu trong văn bản: Do giới hạn về thời gian nghiên cứu và khả năng đáp ứng mẫu thực tế, dung lượng và số lượng mẫu khảo sát còn hạn chế. Nghiên cứu chưa mở rộng khảo sát sâu trên nhiều giống chè khác nhau hoặc các vùng trồng có tính chất thổ nhưỡng, tập quán canh tác đặc thù.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng phạm vi thẩm định trên các nền mẫu nông sản phức tạp khác; khảo sát thêm các nhóm hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật mới phát sinh trong danh mục quản lý của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Hóa phân tích, Quản lý Chất lượng Nông lâm thủy sản, Công nghệ Sinh học tham khảo phương pháp tối ưu hóa thiết bị GC-MS và kỹ thuật xử lý nền mẫu thực vật chứa hàm lượng polyphenol/sắc tố cao.
• Kỹ thuật viên tại các phòng thử nghiệm, trung tâm kiểm định chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (VILAS/ISO 17025) áp dụng quy trình chiết xuất d-SPE và bộ thông số thẩm định (LOD, LOQ, đường chuẩn ma trận, độ thu hồi) để xây dựng Standard Operating Procedure (SOP) phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật.
• Phần đáng tham khảo nhất là: Quy trình chiết tách chi tiết (mục Preparation of sample and standard), thông số cài đặt chương trình nhiệt GC và đầu dò khối phổ Polaris Q MS (Bảng 3.2), cùng các công thức toán học tính toán thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn quốc tế 2002/657/EC và AOAC.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật được khảo sát trong nghiên cứu có ngưỡng dư lượng tối đa (MRL) theo Thông tư 50/2016/TT-BYT là bao nhiêu?
Theo Thông tư số 50/2016/TT-BYT và phụ lục ban hành kèm theo, ngưỡng MRL trong sản phẩm chè được quy định: Chlorpyrifos (Mã CODE 17) có MRL là 2 mg/kg; $\alpha$-Endosulfan (Mã CODE 39) có MRL là 10 mg/kg; Bifenthrin (Mã CODE 178) có MRL là 30 mg/kg.

2. Quy trình xử lý và làm sạch mẫu chè trước khi phân tích GC-MS sử dụng các hóa chất và chất hấp phụ nào?
Quy trình sử dụng dung môi chiết là Acetonitrile chứa 1% Acid Acetic; tách pha bằng hỗn hợp muối M1 ($5,\text{g}\ \text{NaCl}$, $0,5,\text{g}\ \text{CH}_3\text{COONa}$, $\text{MgSO}_4$ khan); làm lạnh sâu ở ngăn đông 2 giờ để đông kết tạp chất; làm sạch pha rắn phân tán (d-SPE) bằng hỗn hợp M2 gồm chất hấp phụ amin bậc một và bậc hai (PSA), C18 ($35\text{–}75,\mu\text{m}$), than hoạt tính dạng graphit (GCB) và $\text{MgSO}_4$; sau đó thổi khô bằng khí $N_2$ dưới $40^\circ\text{C}$ và hòa tan lại bằng hỗn hợp n-Hexane : Acetone (tỷ lệ 9:1).

3. Điều kiện vận hành sắc ký khí và đầu dò khối phổ (GC-MS) được thiết lập như thế nào?
Sử dụng cột phân tích DB-5MS ($30,\text{m} \times 0,25,\text{mm} \times 0,25,\mu\text{m}$), khí mang Heli tốc độ $1,\text{ml/phút}$, tiêm không chia dòng (splitless) thể tích $1,\mu\text{l}$ ở $250^\circ\text{C}$. Chương trình nhiệt độ: $50^\circ\text{C}$ (1 phút) $\rightarrow$ $125^\circ\text{C}$ $\rightarrow$ tăng $10^\circ\text{C/phút}$ lên $300^\circ\text{C}$ (giữ 10 phút). Đầu dò MS hoạt động ở chế độ ion hóa va chạm electron (EI, 70 eV), nhiệt độ nguồn ion và đường dẫn transfer line đều duy trì ở $200^\circ\text{C}$, chế độ ghi ion chọn lọc SIR.

4. Kết quả thẩm định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ thu hồi của phương pháp đạt được là bao nhiêu?
Phương pháp đạt giới hạn phát hiện LOD công bố là $10,\mu\text{g/kg}$ (thực nghiệm: Chlorpyrifos 4,5 $\mu$g/kg; $\alpha$-Endosulfan 5,08 $\mu$g/kg; Bifenthrin < 3 $\mu$g/kg) với tỷ lệ $S/N \ge 3$; giới hạn định lượng LOQ công bố là $30,\mu\text{g/kg}$. Hiệu suất thu hồi trung bình đạt từ 95% đến 105% (hoặc 100–110% trong tóm tắt kết luận), hệ số tương quan tuyến tính $r^2 \ge 0,998$ trong khoảng 20–400 $\mu$g/kg và độ lệch chuẩn tương đối RSD% dưới 10%.

5. Tiêu chí nhận diện cấu trúc phân tử trên khối phổ tuân theo quy định nào?
Phương pháp đáp ứng tiêu chuẩn định danh theo Quyết định 2002/657/EC của Liên minh Châu Âu, yêu cầu tại giới hạn phát hiện phải luôn nhận diện được chính xác 1 ion mẹ (parent ion) và 3 ion con (daughter ions) đặc trưng cho từng hoạt chất.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Hương Ly đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) có độ nhạy cao để xác định đồng thời 3 hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật Chlorpyrifos, $\alpha$-Endosulfan và Bifenthrin trong mẫu chè. Phương pháp đạt độ tin cậy cao với LOD là $10,\mu\text{g/kg}$, LOQ là $30,\mu\text{g/kg}$, độ thu hồi 95–105%, hệ số tuyến tính $r^2 \ge 0,998$ và độ biến thiên dưới 10%, hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế của AOAC và Quyết định 2002/657/EC. Kết quả thực nghiệm tại phòng kiểm nghiệm VILAS 1098 khẳng định quy trình phân tích nhanh gọn, chính xác, có tính ứng dụng thực tiễn cao trong công tác kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm nông sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY ADVANED EDUCATION PROGRAM …….    …… BACHELOR THESIS STUDY ON A HIGHLY SENSITIVE METHOD FOR DETERMINATION OF PESTICIDE RESIDUES IN TEA BY GAS SPECTROMETRY (GC/MS) Full Name : LE HUONG LY Study Mode : Full time Major : Food Technology Falculty : Advance Education Program Batch : 2016 - 2020 Supervisor : Dr. Vu Thi Hanh Thai Nguyen, 8-2020 Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program Engineer of Food Technology Student name Le Huong Ly Student ID DTN 1653170006 Thesis Title STUDY ON A HIGHLY SENSITIVE METHOD FOR DETERMINATION OF PESTICIDE RESIDUES IN TEA Supervisor(s) Dr. Vu Thi Hanh - Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, Vietnam.

Supervisor’s signature Abstract: Using your high sensitivity to analyze the three chemical compounds in tea simultaneously: Chlorpyrifos, α-Endosulfan, Bifenthrin. The reality of the method is that many substances can be analyzed at the same time, with low concentration and detection limit and low quantitative limit. The value of standard addition at the detection limit is 10µg/kg with S/N greater than 3 and there is always one parent ion and 3 daughter ions in accordance with criteria of 2002/657/EC. From the results survey above, it shown that the method of determined 3 active substances by gas chromatography system of mass spectrometry GC-MS with the following results: LOD of the analysis method of is 10µg/kg, limited limit amount (LOQ) equals 30µg/kg.

The average recoveries of analyte were in the range of 95-105% with linear regression coefficient r2≥0.998 and the variation is less than 10%. From the above analysis results, it can be confirmed this method is fast, accurate and reliable for analyzing 3 active substances in tea. Keywords: GC-MS, tea, Chlorpyrifos, α-Endosulfan, Bifenthrin Number of pages: 51 Date of submission: 17/08/2020 ACKNOWLEDGMENTS In fact, there is no success that is not associated with the support or help of more or less, directly or indirectly from others. To complete this thesis, firstly, I would like to express my sincere thanks and deep gratitude to the University Administrations, the leaders of the Faculty of Biotechnology - Food Technology, the lecturers of the Advanced Education Program Office, TUAF helped and gave me useful advices during the course of my thesis.

And especially, I would like to sincerely thank Dr. Vu Thi Hanh paid attention to helping and enthusiastically guiding me to successfully complete this thesis. I would like to express my deep thanks to The center for technical services and professional training in agro- forestry-fishery quality - Thai Nguyen, of Thai Nguyen Department of Agriculture, Forestry and Fishery Quality Assurance (Code: VILAS 1098; Location: Dong Quang ward, Thai Nguyen city, Thai Nguyen province), the staffs working in the center paid attention and helped. Due to limited reasoning, practical experience and limited time, the report can not avoid shortcomings, I look forward to receiving your comments so that I can learn more and complete the report and achieve the best results.

Once again, I would like to sincerely thank and wish all the best for the health and the success in your noble career. We wish our university achieved more success in education and more development. Sincerely, Le Huong Ly i TABLE OF CONTENT ACKNOWLEDGMENTS. i TABLE OF CONTENT.

ii LIST OF TABLES. iv LIST OF FIGURES. v LIST OF ABBREVIATIONS. Introduction about tea.

Growth of tea. Benefits of tea. Plant protection drugs. Important roles of plant protection drugs.

Some plant protection drugs used for tea. Maximum allowed residue. Some methods for determination pesticide in tea. Traditional method: Quantitative analysis method (Ministry of Agriculture and Rural Development (2013).

Gas chromatography - mass spectrometry GC-MS. Structure of GC-MS system. MATERIALS, EQUIPMENT AND METHODS. Chemical and Equipment.

Preparation of sample and standard. Conditions to run the machine GC/MS. Sample injection order. Evaluation of this method.

RESULTS AND DISCUSSION. Limit of detection and limit of quantification. 40 iii LIST OF TABLES Table 3.1a: Concentration and spiked samples 10ppm (µl) to prepare the sample as a calibration curve .