Luận văn: Nghiên cứu phương pháp loại cafein và làm giàu catechin từ cao lá chè xanh

Luận văn thạc sỹ dược học nghiên cứu phương pháp loại cafein, làm giàu catechin từ cao lá chè xanh. Trình bày quy trình và kết quả thực nghiệm chi tiết.

• Tác giả: Trần Trọng Biên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Hân
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm & bào chế thuốc
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp loại cafein và làm giàu catechin từ cao lá chè xanh
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Dược học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Các thành phần quan trọng trong lá chè xanh

Lá chè xanh chứa nhiều thành phần sinh học quý giá, trong đó cafein và catechin là hai chất có tác dụng sức khỏe vượt trội. Cafein là alkaloid tự nhiên tác động kích thích hệ thần kinh trung ương, mang lại cảm giác tỉnh táo nhưng có thể gây bất lợi cho sức khỏe ở nồng độ cao. Ngược lại, catechin, đặc biệt là EGCG (Epigallocatechin gallate), là hợp chất polyphenol có tính chất chống oxy hóa mạnh mẽ. Những catechin này có khả năng bảo vệ tế bào, hỗ trợ tim mạch và tăng cường sức đề kháng. Việc loại cafein từ chè xanh đồng thời làm giàu catechin là mục tiêu công nghệ hiện đại, tạo ra các sản phẩm chè có lợi ích sức khỏe tối ưu hơn. Quá trình này đòi hỏi kỹ thuật chiết xuất và xử lý tiên tiến.

1.1. Cấu trúc hóa học của cafein và catechin

Cafein (C₈H₁₀N₄O₂) là một xanthine alkaloid có khả năng hòa tan tốt trong nước nóng. Catechin, đặc biệt là EGCG, là polyphenol có cấu trúc phức tạp với nhiều nhóm hydroxyl, tạo nên tính chống oxy hóa. Sự khác biệt về tính chất hóa học này cho phép các kỹ thuật tách chiết chọn lọc áp dụng hiệu quả.

1.2. Lợi ích sức khỏe của catechin trong chè xanh

Catechin đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ sức khỏe tim mạch, giảm viêm, chống oxy hóa và hỗ trợ quản lý cân nặng. Các nghiên cứu chứng minh rằng làm giàu catechin tăng cường công dụng dự phòng bệnh, khiến sản phẩm chè xanh không cafein trở nên lý tưởng cho những người nhạy cảm với cafein.

II. Phương pháp loại cafein từ chè xanh

Loại cafein từ chè xanh có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó sử dụng montmorillonit (MMT) là một kỹ thuật tiên tiến và hiệu quả. MMT là một khoáng sét tự nhiên có cấu trúc slicate lớp, với diện tích bề mặt rộng lớn phù hợp cho quá trình hấp phụ. Quá trình hấp phụ cafein trên MMT dựa trên sự tương tác giữa cafein và các vị trí hoạt động trên bề mặt khoáng sét. Điều kiện chiết xuất như pH dịch chiết, nhiệt độ và nồng độ ethanol ảnh hưởng lớn đến hiệu suất loại cafein. Phương pháp này giữ được hầu hết catechin quý giá, vì khoáng sét chọn lọc hấp phụ caffein mà không ảnh hưởng đáng kể đến các polyphenol khác.

2.1. Nguyên lý hấp phụ cafein trên montmorillonit

Montmorillonit (MMT) hoạt động qua cơ chế hấp phụ vật lý, nơi phân tử cafein được giữ lại trên bề mặt và trong các lỗ xốp của khoáng sét. Động học hấp phụ có thể được mô tả bằng mô hình Langmuir hoặc Freundlich, cho phép tối ưu hóa điều kiện để đạt hiệu suất loại cafein cao nhất.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại cafein

pH dịch chiết, nhiệt độ và nồng độ ethanol là ba yếu tố chính kiểm soát hiệu suất loại cafein. pH thấp (3-5) thường tối ưu hóa sự tan của cafein và hấp phụ trên MMT. Nhiệt độ cao (50-80°C) tăng tốc độ hấp phụ nhưng phải cân bằng để tránh phá hủy catechin.

III. Phương pháp làm giàu catechin từ chè xanh

Làm giàu catechin từ chè xanh thường sử dụng nhựa macroporous (macroporous resin), một vật liệu tổng hợp có đặc tính hấp phụ độc đáo. Nhựa macroporous có cấu trúc lỗ xốp kiểm soát, cho phép catechin xâm nhập vào bên trong hạt nhựa nơi bề mặt hoạt động được phân bố đều. Quá trình hấp phụ, giải hấp phụ diễn ra ở cả điều kiện tĩnh và động để tối ưu hóa lấy lại catechin. Phương pháp này có ưu điểm là chọn lọc cao đối với EGCG và các catechin khác, đồng thời cho phép tái sử dụng nhựa nhiều lần. Dịch chiết được xử lý bằng nhựa macroporous để loại bỏ các tạp chất trong khi tập trung hóa các polyphenol quý giá, tạo ra sản phẩm chè xanh giàu catechin có nồng độ catechin tăng gấp 2-3 lần.

3.1. Đặc tính và phân loại nhựa macroporous

Nhựa macroporous được phân loại dựa trên loại polymer (polystyrene, polyacrylate) và tính chất bề mặt (ưa nước, ưa dầu). Các đặc tính lý hóa như diện tích bề mặt, kích thước lỗ xốp và độ bền cơ học ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hấp phụ catechin.

3.2. Quá trình hấp phụ và giải hấp phụ catechin

Quá trình hấp phụ ở điều kiện tĩnh giúp xác định các thông số tối ưu như thời gian tiếp xúc, tỉ lệ dịch chiết-nhựa và nhiệt độ. Giải hấp phụ sử dụng các dung môi thích hợp (ethanol, methanol) để lấy lại catechin tập trung từ nhựa, tạo ra dịch chiết giàu polyphenol.

IV. Quy trình chiết xuất tổng hợp loại cafein và làm giàu catechin

Quy trình tổng hợp để loại cafein và làm giàu catechin từ lá chè xanh bao gồm các bước liên tiếp, bắt đầu từ chiết xuất dịch từ lá chè xanh tươi hoặc khô. Dịch chiết thô được xử lý bằng montmorillonit trong điều kiện được tối ưu hóa (pH 4.0, 60°C, 30 phút) để loại bỏ cafein hiệu quả. Sau đó, dịch chiết được lọc và xử lý tiếp bằng nhựa macroporous được chọn lựa sẵn (ví dụ AB-8 hoặc XAD-7) để hấp phụ và tập trung hóa catechin. Điều kiện hấp phụ-giải hấp phụ được thiết kế để đạt hiệu suất lấy lại catechin cao nhất. Dịch giàu catechin sau đó có thể được sấy phun hoặc cô cạn để tạo ra sản phẩm cuối cùng. Quy trình này đảm bảo sản phẩm chè xanh không cafein với nồng độ catechin được làm giàu, mang lại lợi ích sức khỏe tối đa cho người tiêu dùng.

4.1. Các bước chiết xuất và điều chế dịch chiết thô

Chiết xuất dịch được thực hiện bằng nước nóng (70-95°C) trong 10-30 phút để hòa tan các thành phần hòa tan. Cơ chế quá trình chiết xuất liên quan đến khuếch tán các chất hòa tan từ mô chè vào dung dịch. Dịch chiết thô sau lọc chứa cafein, catechin và các tạp chất khác, là nguyên liệu cho các bước xử lý tiếp theo.

4.2. Tái sử dụng vật liệu hấp phụ và kiểm soát chất lượng

Nhựa macroporous và montmorillonit có thể được tái sử dụng sau các chu kỳ tái tạo bằng cách rửa với dung môi thích hợp. Định lượng cafein và EGCG bằng HPLC xác minh hiệu suất loại cafein và làm giàu catechin, đảm bảo sản phẩm đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng yêu cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Chè (Trà, Camellia sinensis L.) là một trong những đồ uống phổ biến nhất ở Việt Nam và trên thế giới do hương vị đặc trưng và các tác dụng sinh học quan trọng của các hợp chất polyphenol (chủ yếu là các catechin) trong lá như chống oxy hóa [43], chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn [84], chống ung thư [55]. Trong các catechin Chè xanh, epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần có hàm lượng lớn nhất và có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất. Trong công nghiệp dược phẩm, cao chiết Chè xanh chuẩn hóa (Polyphenon® E, Theaphenon® E) đã được sản xuất đã và đang trải qua nhiều thử nghiệm lâm sàng quan trọng [25]. Một trong các thuốc đã được FDA chấp nhận trong điều trị mụn cóc sinh dục (Condyloma acuminata) từ năm 2006 dưới tên thương mại Veregen® (hoạt chất Sinecatechins) [51].

Ngoài ra lá Chè chứa 2-5% cafein - một alcaloid có tác dụng kích thích thần kinh mà nếu sử dụng thường xuyên và quá mức sẽ gây nhiều tác dụng bất lợi như kích ứng đường tiêu hóa; hồi hộp, mất ngủ [4]; nhịp tim nhanh, tăng huyết áp [34]; nguy cơ dị tật thai nhi, sẩy thai và thai chết lưu [50]. Do đó, hiện nay nhu cầu về các sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ cây Chè nói riêng và các loại đồ uống nói chung đang ngày càng tăng. Lá Chè loại cafein và polyphenol Chè xanh loại cafein là những sản phẩm nổi bật nhất trong xu hướng này [11, 80]. Trên thế giới, nhiều công ty đã sản xuất được các sản phẩm loại cafein từ Chè bằng nhiều công nghệ khác nhau như chiết dung môi siêu tới hạn, công nghệ màng lọc và kỹ thuật hấp phụ.

Đây cũng là chủ đề nghiên cứu thu hút được sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc loại cafein đồng thời làm giàu catechin trong điều chế cao lá Chè xanh ứng dụng trong dược phẩm mặc dù Việt Nam là một trong những quốc gia sản xuất và tiêu thụ Chè lớn trên thế giới và Chè Việt Nam được đánh giá là có chất lượng ngang bằng với Chè Trung Quốc, Nhật Bản hay Australia [72]. Do đó đề tài “Nghiên cứu phương pháp loại cafein và làm giàu catechin từ lá Chè xanh” được thực hiện với các mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình chiết xuất, loại cafein và làm giàu catechin từ lá Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm.

Điều chế được 20 g cao khô lá Chè xanh có hàm lượng EGCG và giới hạn cafein đạt tiêu chuẩn USP 41. Cây Chè Cây Chè (Trà, Camellia sinesis L.) thuộc họ Chè - Theaceae, được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một số nước châu Á. Ở nước ta, Chè được trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Đắc Lắc. Năm 2018, tổng diện tích trồng Chè cả nước là trên 130 nghìn hecta, sản lượng chè búp đạt 1 triệu tấn, với trên 500 cơ sở sản xuất, chế biến và rất nhiều loại Chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu là Chè đen, còn lại là Chè xanh và các loại khác.

Bộ phận dùng là búp (tôm) và lá Chè non. Trong lá Chè có polyphenol (30 – 36%), cafein (2-5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng,…. Trong đó polyphenol (chủ yếu là các catechin), cafein, theanin, chlorophyll là những thành phần quyết định màu sắc, hương vị của sản phẩm. Các thành phần quan trọng trong lá Chè 1.

Catechin Catechin là tên gọi chung để chỉ nhóm các hợp chất polyphenol mang khung flavan-3-ol. Trong cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4 đồng phân nên có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin đã được được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè xanh. Về cấu tạo, các catechin có thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân 2R và 3R) và nonepicatechin (catechin), cũng có thể phân thành catechin tự do và catechin ester hóa. Cấu trúc một số catechin trong lá Chè Catechin chè xanh chủ yếu là các epicatechin, trong đó EGCG chiếm 10 - 50% tổng lượng catechin.

Nonepicatechin chỉ chiếm một lượng nhỏ. Hàm lượng mỗi catechin trong các giống Chè và các bộ phận của Chè khác nhau, giảm dần theo thứ tự EGCG > EGC > ECG > EC. * Các tính chất của catechin: + Catechin là các chất không màu, khối lượng phân tử từ 290-458 kDa [56], khi kết tinh có dạng tinh thể hình kim hoặc hình lăng trụ, đa số có vị chát ở các mức độ khác nhau, riêng EGC và EGCG có vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng tụ thành các dicatechin. Các catechin tan trong nước và một số dung môi hữu cơ: methanol, ethanol, aceton, ethyl acetat,….

Tính tan tốt trong nước và trong ethyl acetat đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các catechin từ hỗn hợp polyphenol Chè xanh. + Các catechin có tính khử mạnh nên rất nhạy cảm với tác động của các enzym oxy hóa. Ngoài ra, catechin kém bền với acid mạnh, các chất kiềm và nhiệt độ cao [23]. Catechin bền vững nhất trong môi trường acid nhẹ (pH 3-4) và bị phân hủy nhanh trong khoảng pH từ 5 - 8, đặc biệt kém bền trong môi trường kiềm có pH > 8 [89].

Do đó, để tăng độ ổn định của các catechin trong quá trình chiết xuất, thường bổ sung các chất chống oxy hóa và điều chỉnh pH như acid ascorbic, acid citric [1]. Các epicatechin kém ổn định và dễ bị epime hóa thành các nonepicatechin ở nhiệt độ trên 80°C [7, 41]. Tốc độ epime hóa nhanh hơn trong môi trường nước máy so với nước tinh khiết. Tuy nhiên, ở pH < 6 quá trình epime hóa chậm đi đáng kể [49].

Để hạn chế quá trình này, có thể 3 chiết xuất catechin Chè xanh bằng hỗn hợp cồn - nước, kiểm soát chất lượng nước và nhiệt độ chiết xuất [41], hoặc bổ sung các chất ổn định như EDTA [49]. + Các catechin có thể phản ứng tạo tủa với cafein và protein [48]. Đặc tính này có thể được ứng dụng trong phân lập các catechin từ dịch chiết. Catechin cũng phản ứng với một số enzym như lipoxygenase, α-amylase, pepsin, trypsin và lipase tạo thành các kết tủa đồng thời ức chế hoạt động của các enzym này.

Các catechin ester hóa (EGCG, ECG) có khả năng tạo kết tủa với các enzym mạnh hơn các catechin tự do. Một số catechin có thể liên kết với sắt và cản trở quá trình hấp thu sắt. Do đó cần chú ý khi sử dụng catechin Chè xanh với các thực phẩm chứa nhiều sắt hoặc các chế phẩm bổ sung sắt cho cơ thể. * Các tác dụng của catechin Chè xanh: + Tác dụng chống oxy hóa, trong đó EGCG có hoạt tính cao nhất, hoạt tính chống oxy hóa của EGCG cao gấp 100 lần vitamin C và hơn 25 lần so với vitamin E [43].

+ Tác dụng chống ung thư [35, 55], kháng khuẩn, kháng virus [67, 79, 84], kháng viêm [70], giảm cholesterol [83], chống lão hóa [62]. Do vậy, catechin Chè xanh được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng. Cafein Cafein là alcaloid chiếm hàm lượng lớn nhất (2-5% trọng lượng khô) trong số các chất cùng nhóm methyl xanthin trong lá Chè, bên cạnh theophyllin và theobromin. Công thức cấu tạo của cafein + Tính chất hóa lý: Tinh thể không màu, không mùi, vị đắng, nóng chảy ở 238°C và thăng hoa ở 178°C.

Kích thước phân tử 0,69 nm, khối lượng phân tử 194 kDa [74]. Cafein hơi tan trong nước ở nhiệt độ thường, dễ tan trong nước nóng, chloroform, ít tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm. + Tác dụng dược lý: Cafein có tác dụng kích thích thần kinh trung ương ưu tiên trên vỏ não; kích thích tim làm tim đập nhanh, mạnh, tăng lưu lượng tim và lưu lượng 4 mạch vành; kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch phổi; giảm nhu động ruột, gây táo bón, tăng tiết diệt vị (có thể gây loét dạ dày - tá tràng); giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa; giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu Na+ nên có tác dụng lợi tiểu [52]. + Tác dụng bất lợi của cafein: Cafein là chất kích thích và gây nhiều tác dụng bất lợi như hồi hộp, mất ngủ [4], nhịp tim nhanh, tăng huyết áp [26].

Sử dụng cafein trong thời gian dài làm tăng nguy cơ mắc các bệnh về xương (như loãng xương); rối loạn hấp thu, thải trừ các ion kim loại và các quá trình tái hấp thu ở ruột và thận, bệnh thiếu máu do thiếu sắt và các bệnh mạch vành. Phụ nữ có thai sử dụng thường xuyên cafein có nguy cơ gây dị tật cho thai nhi, sẩy thai và thai chết lưu [50], do đó đây là đối tượng rất nhạy cảm với cafein và cần có các tư vấn cụ thể về lượng cafein có thể sử dụng hàng ngày. Cafein làm tăng cường quá trình chết tự nhiên (apoptosis) của các tế bào biểu bì do tia UVB [45]. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy, nếu sử dụng thường xuyên cafein sẽ gây hội chứng “caffeinism” đặc trưng bởi các triệu chứng như bồn chồn, lo âu, khó chịu, kích động, run cơ, mất ngủ, đau đầu, tiểu tiện nhiều, rối loạn cảm giác (như ù tai), các triệu chứng tim mạch (nhịp tim nhanh, rối loạn nhịp tim) và rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, nôn, tiêu chảy,.

Các thành phần khác Ngoài các thành phần chính trên, lá Chè còn chứa một số thành phần khác như protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng. Trong quy trình chiết xuất các các sản phẩm cao Chè xanh, đây là những tạp chất có thể xuất hiện trong dịch chiết, ảnh hưởng đến hiệu suất quy trình và hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm chiết. Các phương pháp loại cafein Chè xanh Mặc dù có một số tác dụng dược lý nhất định, sử dụng thường xuyên và quá mức cafein gây ra nhiều tác dụng bất lợi như trên. Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội, hiện nay nhu cầu về các loại sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ cây Chè (lá Chè loại cafein, cao Chè loại cafein) là rất lớn.

Nhiều phương pháp loại cafein đã được nghiên cứu và một số đã được ứng dụng trong thưc tiễn, bao gồm: 1. Loại cafein bằng dung môi hữu cơ 5 Phương pháp này sử dụng khả năng hòa tan chọn lọc của các dung môi hữu cơ đối với cafein so với catechin để chiết loại bỏ cafein.