Xây dựng phương pháp HPTLC phân tích Ketoconazol, Climbazol trong dầu gội

Khóa luận nghiên cứu, xây dựng phương pháp HPTLC phân tích đồng thời 3 hoạt chất Ketoconazol, Climbazol, Acid Salicylic trong các sản phẩm dầu gội.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ninh
• Người hướng dẫn: TS. Tống Thị Thanh Vượng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời Ketoconazol, Climbazol và Acid Salicylic trong dầu gội đầu bằng HPTLC
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về phương pháp HPTLC trong phân tích dược phẩm

HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) là kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao, được ứng dụng rộng rãi trong phân tích chất lượng các hoạt chất dược phẩm như Ketoconazol, Climbazol và AS. Phương pháp này mang lại độ phân giải cao, thời gian phân tích nhanh và chi phí kinh tế. HPTLC có khả năng phát hiện các tạp chất, xác định hàm lượng và đánh giá độ tinh khiết của mẫu dược phẩm một cách chính xác và đáng tin cậy.

1.1. Định nghĩa và nguyên lý HPTLC

HPTLC là kỹ thuật tách chiết dựa trên sự hấp phụ các chất trên bề mặt chất hỗ trợ. Nguyên lý hoạt động dựa trên sự khác biệt về độ cực và mối liên kết giữa các thành phần với pha tĩnh và pha động. Phương pháp này cho phép phân tách đồng thời nhiều mẫu, cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác cho mục đích kiểm định chất lượng dược phẩm.

1.2. Ứng dụng trong phân tích chất lượng

HPTLC được sử dụng để xác định hàm lượng Ketoconazol, Climbazol và AS trong các sản phẩm dị dỏng, kem bôi và dung dịch khác. Phương pháp này phát hiện các tạp chất có liên quan, đánh giá độ tinh khiết và kiểm tra tính đồng nhất của các mẫu. Với độ chọn lọc cao, HPTLC là công cụ đáng tin cậy cho kiểm soát chất lượng trong ngành dược.

II. Quy trình thực hiện phân tích HPTLC Ketoconazol Climbazol AS

Quy trình phân tích HPTLC bao gồm các bước: chuẩn bị mẫu, lựa chọn dung môi phát triển, chuẩn bị tấm HPTLC, rửa tấm, kích hoạt nhiệt, nạp mẫu, phát triển sắc ký, phát hiện và định lượng. Các hoạt chất được phân tách dựa trên sự khác biệt về hệ số phân bố (Rf) trên tấm silicon dioxide. Thời gian phân tích khoảng 20-30 phút, cho phép xử lý nhiều mẫu trong một chu kỳ kiểm định, nâng cao hiệu suất công việc của phòng kiểm nghiệm.

2.1. Chuẩn bị mẫu và tiêu chuẩn

Mẫu Ketoconazol, Climbazol và AS được hòa tan trong dung môi phù hợp (ethanol hoặc methanol) với nồng độ thích hợp. Các tiêu chuẩn tham chiếu phải có độ tinh khiết cao (≥98%). Mẫu được lọc qua màng lọc 0.45 μm để loại bỏ các hạt lơ lửng. Việc chuẩn bị cẩn thận đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích và tái lập được của phương pháp.

2.2. Lựa chọn dung môi phát triển tối ưu

Dung môi phát triển phải được chọn sao cho đạt được phân giải tốt giữa các hoạt chất. Pha động thường là hỗn hợp các dung môi hữu cơ như hexane, ethyl acetate, methanol với tỷ lệ thích hợp. Qua thực nghiệm, hỗn hợp hexane:ethyl acetate:methanol (6:3:1 v/v) cho kết quả phân tách tối ưu, các Rf riêng biệt và rõ ràng.

2.3. Phát hiện và định lượng kết quả

Sau phát triển, tấm HPTLC được sấy khô và quan sát dưới ánh sáng UV tại bước sóng 254 nm. Ketoconazol, Climbazol và AS xuất hiện dưới dạng các vết sẫm. Hàm lượng được xác định bằng phương pháp quét mật độ ánh sáng (densitometry) hoặc so sánh diện tích vết với chuẩn tham chiếu.

III. Những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích HPTLC

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích HPTLC bao gồm: nhiệt độ phòng, độ ẩm, chất lượng dung môi, tính chất của tấm HPTLC, cách nạp mẫu và điều kiện phát triển. Sự thay đổi nhỏ trong các yếu tố này có thể dẫn đến sai lệch trong giá trị Rf và hàm lượng xác định. Để đảm bảo tính lặp lại và độ chính xác, cần kiểm soát chặt chẽ các điều kiện thực hiện theo quy trình chuẩn hóa.

3.1. Ảnh hưởng của dung môi và điều kiện quán tính

Chất lượng và tỷ lệ dung môi phát triển ảnh hưởng trực tiếp đến Rf của các hoạt chất. Sự bốc hơi của dung môi trong bình phát triển có thể làm thay đổi thành phần của pha động. Cần sử dụng dung môi chuẩn bị mới, giữ kín bình phát triển và để ổn định 30 phút trước khi sử dụng để đạt điều kiện bão hòa không khí tối ưu.

3.2. Tác động của nhiệt độ và độ ẩm

Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung môi và tốc độ phát triển sắc ký. Độ ẩm tương đối (45-65%) là điều kiện lý tưởng để đạt được kết quả tái lập. Sự thay đổi đột ngột của môi trường có thể gây ảnh hưởng đến phân giải và Rf. Khuyến cáo thực hiện phân tích trong phòng có kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm ổn định.

IV. Thẩm định phương pháp HPTLC theo tiêu chuẩn quốc tế

Thẩm định phương pháp HPTLC phải tuân theo các hướng dẫn của ICH (International Council for Harmonisation) và EP (European Pharmacopoeia). Các thông số cần thẩm định bao gồm: độ chuyên biệt, độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại, độ tái lập và phạm vi định lượng. Phương pháp chỉ được xem là hợp lệ khi đáp ứng đủ các tiêu chí thẩm định, đảm bảo độ tin cậy trong kiểm định chất lượng Ketoconazol, Climbazol và AS trong sản phẩm dược phẩm thực tế.

4.1. Độ chuyên biệt và tuyến tính

Độ chuyên biệt được kiểm tra bằng cách phân tích các tạp chất và sản phẩm phân hủy để đảm bảo chúng không can nhiễu đến các pik của hoạt chất chính. Độ tuyến tính được xác định bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn ở nồng độ khác nhau (80-120% nồng độ tính toán), hệ số tương quan R² phải ≥0.99. Cả hai tiêu chuẩn này đảm bảo phương pháp có khả năng phân tách và định lượng chính xác.

4.2. Độ chính xác lặp lại và tái lập

Độ chính xác được kiểm tra bằng recovery test ở ba mức nồng độ (80, 100, 120%), kết quả recovery phải từ 98-102%. Độ lặp lại (RSD ≤5%) được đánh giá qua phân tích cùng mẫu 6 lần trong cùng ngày. Độ tái lập (RSD ≤10%) được kiểm tra qua phân tích mẫu ở các ngày khác nhau, các điều kiện khác nhau. Khi các tiêu chuẩn này được thỏa mãn, phương pháp có thể sử dụng cho mục đích kiểm định thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các sản phẩm mỹ phẩm dần trở nên quen thuộc trong đời sống con người. Đây là một lĩnh vực mang lại lợi nhuận cao, dẫn đến tình trạng sản xuất, buôn bán các mặt hàng mỹ phẩm kém chất lượng, không đảm bảo an toàn vì lợi nhuận xuất hiện ngày càng nhiều. Chính vì vậy, việc đảm bảo chất lượng cho các sản phẩm mỹ phẩm cần phải được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là đối với các cơ quan quản lý. Một trong những sản phẩm mỹ phẩm thiết yếu, được sử dụng hằng ngày trong đời sống là dầu gội đầu.

Thực tế, dầu gội có nhiều công dụng, ngoài việc làm sạch tóc và da đầu, giúp tóc suôn mượt, một số sản phẩm dầu gội được sản xuất nhằm mục đích điều trị các bệnh về da đầu như nấm da đầu, viêm da tiết bã, gàu, … [1], [2], [3]. Vì vậy, trong các sản phẩm dầu gội đầu, đặc biệt là dầu gội trị gàu thường chứa các hoạt chất như climbazol và acid salicylic [4]. Ngoài ra, ketoconazol - một hoạt chất bị cấm trong mỹ phẩm [5], [6] cũng thường xuyên được trộn trái phép để tăng khả năng trị gàu cho sản phẩm. Ketoconazol và climbazol là hai hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất imidazol, có tính kháng nấm, giúp kìm hãm sự phát triển của nấm trên da đầu [4], [7], [8].

Trong khi đó, acid salicylic có tác dụng làm tróc lớp sừng trên da và sát khuẩn nhẹ [7], [9], [10]. Do vậy, việc kết hợp các thành phần trên có tác dụng làm tăng khả năng điều trị các bệnh lý về da đầu. Bên cạnh dó, climbazol và acid salicylic còn đóng vai trò là chất bảo quản trong mỹ phẩm [11]. Theo quy định của Ủy ban Khoa học Mỹ phẩm ASEAN năm 2024 và các quyết định của Nghị viện châu Âu và Hội đồng, climbazol và acid salicylic được sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm với giới hạn tối đa cho phép tùy từng trường hợp cụ thể [5], [12], [13].

Lí do có các quy định về việc sử dụng các hoạt chất trên trong các sản phẩm mỹ phẩm là vì việc sử dụng các hoạt chất này ở nồng độ cao tiềm ẩn nguy cơ gây ra các tác dụng bất lợi trên cơ thể người. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với các ưu điểm tiến hành đơn giản, phân tích được đồng thời nhiều mẫu, tiết kiệm thời gian và chi phí nên ngày càng được ứng dụng nhiều để phân tích các thành phần trong dầu gội nói riêng cũng như mỹ phẩm nói chung. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào được công bố ở Việt Nam và trên thế giới cho phép phân tích đồng thời ketoconazol, climbazol và acid salicylic trong dầu gội bằng HPTLC. Do vậy, đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời ketoconazol, climbazol và acid salicylic trong dầu gội đầu bằng HPTLC” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1.

Xây dựng được phương pháp phân tích đồng thời ketoconazol, climbazol và acid salicylic trong dầu gội đầu bằng HPTLC. Áp dụng phương pháp xây dựng được để kiểm tra một số mẫu dầu gội đầu trên thị trường. Tổng quan về đối tượng phân tích 1. Dầu gội và các thành phần trong dầu gội 1.

Dầu gội Dầu gội là một trong những sản phẩm chăm sóc cá nhân quan trọng trong đời sống hiện đại. Chúng có thể được mô tả như một sản phẩm mỹ phẩm dùng để gội đầu, giúp làm sạch tóc và da đầu khỏi bụi bẩn, cặn của các sản phẩm tạo kiểu tóc đã dùng trước đó và các chất gây ô nhiễm môi trường [1], [2]. Ngoài ra, dầu gội cũng có tác dụng làm mềm tóc, làm cho tóc bóng và suôn mượt [1], [2]. Bên cạnh các sản phẩm dầu gội làm sạch và dưỡng tóc thông thường, hiện nay đã có nhiều sản phẩm dầu gội có thêm các thành phần hoạt tính, được sử dụng trong điều trị các bệnh lý về da đầu như gàu, viêm da tiết bã, bệnh vẩy nến, … [2], [3].

Ngày nay, với nhu cầu sử dụng ngày càng tăng, dầu gội được bào chế dưới nhiều dạng, bao gồm dầu gội dạng lỏng trong suốt, dầu gội dạng kem, dầu gội dạng gel, dầu gội dạng bột, dầu gội dạng phun mù [3]. Các thành phần trong dầu gội Dầu gội đầu có thành phần công thức phức tạp, thường bao gồm các thành phần sau [2], [4], [11]: Chất hoạt động bề mặt là một thành phần quan trọng trong các sản phẩm dầu gội đầu. Các loại chất hoạt động bề mặt chính được sử dụng trong dầu gội đầu gồm: chất hoạt động bề mặt anion, chất hoạt động bề mặt cation, chất hoạt động bề mặt không ion, chất hoạt động bề mặt lưỡng tính. Các thành phần có các chức năng cụ thể gồm: hoạt chất tăng cường bọt, chất làm đặc hoặc hoạt chất kiểm soát độ nhớt, chất điều hòa, chất làm mờ, chất chelat, chất điều chỉnh pH, chất tạo màu, chất tạo hương, … Ngoài các thành phần trên, chất bảo quản là một thành phần không thể thiếu trong các công thức dầu gội.

Vì dầu gội là sản phẩm được sử dụng thường xuyên nên thường được đóng gói thành dạng chai, lọ dùng nhiều lần. Chính vì vậy, khả năng nhiễm vi sinh vật là điều không thể tránh khỏi. Do đó, việc sử dụng các chất bảo quản trong dầu gội đầu là cách để duy trì giới hạn nhiễm vi sinh vật và đảm bảo tính ổn định cho các sản phẩm dầu gội. Có nhiều nhóm chất bảo quản, bao gồm: các acid hữu cơ, muối và este của chúng: nhóm chất bảo quản này gồm các acid hữu cơ trong đó có acid salicylic; các muối và các este của chúng; aldehyd và chất bảo quản giải phóng formaldehyd; phenol và các dẫn xuất; alcol và dẫn xuất; dẫn xuất imidazol, trong đó bao gồm climbazol, … [11].

Tuy nhiên, việc sử dụng các chất bảo quản không đúng cách có thể gây ra các tác dụng không mong muốn như kích ứng da, rối loạn nội tiết, thậm chí ung thư cho người 2 sử dụng [11], do vậy, cần phải kiểm soát sự có mặt cũng như nồng độ của các chất bảo quản trong các sản phẩm dầu gội. Ngoài ra, trong các sản phẩm dầu gội trị gàu thường sử dụng các các thành phần có tác dụng chống gàu, bao gồm các nhóm sau: các tác nhân ức chế sự sản xuất quá mức của các tế bào keratin hóa như ammonium bituminosulfonat, các tác nhân keratolytic giúp phân hủy các khối tế bào, ví dụ, lưu huỳnh keo và acid salicylic, các tác nhân kháng khuẩn ức chế nấm Malassezia spp. Sự phức tạp của thành phần trong dầu gội là một thách thức lớn đối với việc phân tích các thành phần có trong dầu gội đầu. Điều này đòi hỏi các phương pháp phân tích các thành phần trong dầu gội cần giảm thiểu được ảnh hưởng của nền mẫu và hạn chế khả năng nhiễm chéo giữa các lần phân tích.

Đặc điểm cấu trúc, tính chất lý hóa KCZ có tên khoa học là 1-acetyl-4-[4-[[2RS,4SR)-2-(2,4-dicloro-phenyl)-2-(1H- imidazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin [14]. Công thức phân tử của KCZ là C26H28Cl2N4O4 (M = 531,4 g/mol) [14], [15]. Cl Cl O O O N N O H H3C N N Hình 1. Công thức cấu tạo của KCZ [14] KCZ là hợp chất hóa học thuộc dẫn xuất của imidazol, là tinh thể hoặc bột không màu [15].

KCZ là chất thân dầu với hệ số phân bố dầu nước (log P) bằng 4,35 [15], [16]. Thực tế, KCZ không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong MeOH, hơi tan trong ethanol 96% [14]. KCZ là một base yếu với 2 giá trị pKa là pKa1 = 6,51; pKa2 = 2,94 [17], [18]. Tác dụng dược lý và ứng dụng Năm 1979, KCZ được tổng hợp và phát triền bởi Janssen Pharmaceutia và sau đó 2 năm, vào năm 1981, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp thuận sử dụng toàn thân KCZ và trong gần một thập kỷ nó được coi là tiêu chuẩn và là thuốc uống duy nhất có sẵn để điều trị nhiễm nấm toàn thân [19].

3 KCZ có trong Danh mục thuốc thiết yếu tân dược ban hành lần thứ VI, năm 2013 [7], là hoạt tính có phổ kháng khuẩn rộng, có tác dụng trên nhiều loại nấm bai gồm nấm ngoài da, nấm niêm mạc, nấm nội tạng, nấm âm đạo và trên một số vi khuẩn Gram (+) [7], [20], [21]. Do đó, KCZ thường được sử dụng trong các chế phẩm viên nén, kem, gel, dầu gội và một số chế phẩm khác để điều trị bệnh nấm toàn thân, bệnh nấm tại chỗ khi điều trị tại chỗ không kết quả, bệnh nấm ở da và niêm mạc nặng, mạn tính, bệnh nấm nặng đường tiêu hóa mạn tính, bệnh nấm Candida âm đạo mạn tính, dự phòng bệnh nấm ở người suy giảm miễn dịch, viêm da tiết bã, lang ben, vảy nến da đầu [7], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. KCZ có phổ kháng nấm rộng, thường có tác dụng kìm hãm nấm nhưng thuốc cũng có thể diệt nấm ở nồng độ cao và dùng kéo dài hoặc trên nấm rất nhạy cảm [7]. KCZ có cơ chế tác dụng tương tự các hợp chất azol chống nấm khác, nó ức chế hoạt tính của cytochrom P450 là hệ enzym cần thiết cho quá trình khử methyl các 14 alpha - methyl - sterol (thí dụ lanosterol) thành ergosterol là sterol chính của màng tế bào nấm, lượng ergosterol bị giảm sẽ làm thay đổi tính thấm và chức năng của màng tế bào [7], [20].

Tác dụng diệt nấm của KCZ ở nồng độ cao có thể là do tác dụng hóa lý trực tiếp của thuốc trên màng tế bào nấm. Với Candida albicans, các thuốc chống nấm loại azol ức chế sự biến đổi từ dạng bào tử chồi thành thể sợi có khả năng xâm nhập gây bệnh [7]. Ngoài ra, KCZ còn có khả năng ức chế hoạt động của enzym 17α – hydroxylase, 11 – hydroxyl hóa và ở liều cao hơn, nó ức chế enzym phân tách chuỗi bên cholesterol. Bên cạnh đó, nó còn ức chế hoạt động của các enzym lyase C17 – 20 tuyến thượng thận dẫn đến ức chế tổng hợp androgen và có thể có ảnh hưởng trực tiếp đến các tế bào khối u corticotropic ở bệnh nhân mắc bệnh Cushing [21].

Bên cạnh đó, nhờ khả năng ức chế hệ enzym cyt P450, KCZ còn được sử dụng để điều trị hội chứng suy hô hấp cấp tính, tăng Calci huyết và 1 số rối loạn nội tiết và bệnh ác tính [7], [9].