Khóa luận: Định lượng resveratrol trong niosome bằng HPLC - Trần Văn Sang

Khóa luận trình bày chi tiết phương pháp định lượng resveratrol trong sản phẩm niosome bằng kỹ thuật HPLC, bao gồm quy trình và kết quả thẩm định.

• Tác giả: Trần Văn Sang
• Người hướng dẫn: PGS. TS. Lê Đình Chi
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng resveratrol trong sản phẩm niosome bằng HPLC
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Resveratrol và Niosome

Resveratrol là một hợp chất polyphenol tự nhiên có công thức hóa học C14H12O3, được tìm thấy chủ yếu trong nho đỏ, dâu tây và các loại quả khác. Đây là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ với nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống ung thư và bảo vệ tim mạch. Tuy nhiên, resveratrol có độ hòa tan trong nước thấp và dễ bị phân hủy bởi enzym và ánh sáng, làm giảm hiệu quả sinh học của nó. Để khắc phục những hạn chế này, các nhà khoa học đã phát triển hệ tiểu phân niosome – một dạng hạt nano sinh học được tạo từ các chất hoạt động bề mặt không ion (non-ionic surfactants). Niosome giúp bảo vệ resveratrol, tăng khả năng hòa tan, cải thiện sinh khả dụng và cho phép kiểm soát việc giải phóng thuốc một cách hiệu quả.

1.1. Đặc điểm hóa học của Resveratrol

Resveratrol (trans-resveratrol) có công thức C14H12O3 với ba nhóm hydroxyl. Nó tồn tại ở hai dạng đẳng hóa: cis và trans, trong đó trans-resveratrol là dạng hoạt tính cao hơn. Hợp chất này có khả năng chống oxy hóa tuyệt vời nhờ vào cấu trúc diphenol. Tuy nhiên, độ ổn định của resveratrol bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ, ánh sáng và oxy, dẫn đến cần thiết phải có các hệ thống bảo vệ phù hợp.

1.2. Cấu trúc và lợi ích của Niosome

Niosome là những tiểu phân hình thành từ các lớp lipid kép, chứa chất hoạt động bề mặt không ion, cholesterol và phospholipid. Chúng có khả năng bảo vệ và vận chuyển thuốc một cách hiệu quả, giảm độc tính, tăng khả năng thấm qua da và niêm mạc. Niosome là lựa chọn lý tưởng để đóng gói resveratrol, cải thiện đáng kể các tính chất dược lực học.

II. Nguyên lý và quy trình Phương pháp HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) hay sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phân tích tiên tiến được sử dụng rộng rãi để định lượng resveratrol trong các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các thành phần dựa trên sự khác biệt trong tương tác giữa các phân tử với pha tĩnh (cột HPLC) và pha động (dung dịch). Trong xây dựng phương pháp HPLC định lượng resveratrol trong niosome, các bước quan trọng bao gồm lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp (thường là 306 nm), khảo sát tỷ lệ thành phần pha động tối ưu, và thẩm định phương pháp. Phương pháp HPLC mang lại những ưu điểm như độ chính xác cao, tính lặp lại tốt, và khả năng phát hiện các thành phần gây nhiễu.

2.1. Các thông số kỹ thuật HPLC cơ bản

Trong phương pháp HPLC định lượng resveratrol, việc lựa chọn cột tách (thường là cột C18 đảo chiều), bước sóng phát hiện (306-310 nm), và tốc độ dòng chảy (0.8-1.0 mL/phút) là rất quan trọng. Pha động thường được lựa chọn từ các dung môi như methanol (MeOH) hoặc acetonitrile kết hợp với nước và acid acetic. Các thông số này được khảo sát và tối ưu hóa để đạt được độ phân giải tốt nhất.

2.2. Quy trình chuẩn bị mẫu và chạy HPLC

Mẫu niosome chứa resveratrol cần được xử lý, hòa tan trong pha động, sau đó lọc qua màng lọc 0.45 μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Thời gian chạy thường từ 15-20 phút. Resveratrol sẽ xuất hiện ở thời gian lưu tích nhất định (Retention Time), được ghi nhận bằng detector UV. Diện tích píc được dùng để tính toán nồng độ dựa trên đường chuẩn resveratrol.

III. Quy trình Thẩm định Phương pháp HPLC

Thẩm định phương pháp HPLC là bước quan trọng để đảm bảo phương pháp định lượng resveratrol đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng quốc tế. Quá trình này bao gồm đánh giá độ thích hợp hệ thống (System Suitability Test), độ lặp lại (Repeatability), độ chính xác trung gian (Intermediate Precision), độ chính xác (Accuracy), độ tuyến tính (Linearity) và khoảng định lượng (Range). Theo tài liệu khóa luận của Trần Văn Sang tại Trường Đại học Dược Hà Nội, các tiêu chí thẩm định bao gồm: độ phân giải các píc phải đạt Rs ≥ 1.5, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%, độ chính xác từ 95-105%. Thẩm định phương pháp này đảm bảo tính đáng tin cậy của kết quả định lượng resveratrol trong các sản phẩm niosome.

3.1. Độ thích hợp hệ thống và Độ lặp lại

Độ thích hợp hệ thống được kiểm tra bằng cách chạy dung dịch chuẩn resveratrol, đánh giá độ phân giải, hệ số đối xứng píc, và số đĩa lý thuyết. Độ lặp lại được kiểm định bằng cách tiêm cùng một mẫu 6 lần liên tiếp, tính RSD của diện tích píc. Cả hai thông số này phải đáp ứng các tiêu chí khắt khe để đảm bảo phương pháp HPLC ổn định và đáng tin cậy.

3.2. Độ tuyến tính Độ chính xác và Khoảng định lượng

Độ tuyến tính được thiết lập bằng cách chạy dãy chuẩn resveratrol với 5-6 nồng độ khác nhau, hệ số tương quan (R²) phải ≥ 0.99. Độ chính xác được đánh giá thông qua phép cộng (spike) và phục hồi, kỳ vọng 95-105%. Khoảng định lượng (Range) được xác định từ nồng độ thấp nhất (LOQ) đến cao nhất (LOD) mà phương pháp vẫn duy trì tính chính xác.

IV. Ứng dụng thực tế của Phương pháp HPLC trong Định lượng Resveratrol Niosome

Phương pháp HPLC xác định hàm lượng resveratrol trong sản phẩm niosome được xây dựng và thẩm định thành công tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia và Viện Dược liệu dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Lê Đình Chi. Phương pháp này cho phép xác định chính xác lượng resveratrol thực sự được nạp vào niosome, từ đó đánh giá hiệu suất nạp (Entrapment Efficiency - EE). Ứng dụng thực tế bao gồm kiểm định chất lượng các chế phẩm niosome trước khi phát hành thị trường, theo dõi độ ổn định của resveratrol trong quá trình bảo quản, so sánh hiệu suất nạp giữa các công thức niosome khác nhau. Phương pháp HPLC này cũng có thể được mở rộng để định lượng resveratrol trong các mẫu sinh học (máu, mô), hỗ trợ nghiên cứu sinh động học và sinh khả dụng của sản phẩm niosome.

4.1. Xác định Hàm lượng và Hiệu suất Nạp Resveratrol

Để xác định hàm lượng resveratrol thực sự trong niosome, mẫu niosome được hòa tan hoặc phá vỡ bằng ethanol hoặc DMSO, sau đó phân tích bằng HPLC theo phương pháp đã xác lập. Hiệu suất nạp (EE%) được tính bằng công thức: (lượng resveratrol nạp / lượng resveratrol ban đầu) × 100%. Phương pháp này cho phép đánh giá chất lượng các lô sản xuất khác nhau và tối ưu hóa các thông số sản xuất niosome.

4.2. Kiểm định chất lượng và Theo dõi độ Ổn định

Phương pháp HPLC định lượng resveratrol được áp dụng để kiểm định chất lượng các sản phẩm niosome trong quá trình phát triển và sản xuất. Nó cũng được sử dụng trong các nghiên cứu ổn định, theo dõi sự phân hủy của resveratrol trong các điều kiện khác nhau (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng). Dữ liệu ổn định này quan trọng để xác định thời hạn bảo quản của sản phẩm và đề xuất các điều kiện bảo quản phù hợp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về resveratrol 1. Nguồn gốc Resveratrol (3, 4', 5 - trihydroxystilben) là một polyphenol tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loại thực vật như nho, ca cao, đậu phộng, các loại quả mọng (việt quất, dâu tây, mâm xôi,.) và trong rễ cây hà thủ ô Nhật Bản (Polygonum cuspidatum var. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ rễ cây Veratrum grandiflorum O.Loes vào năm 1940 bởi Michio Takaoka [6,26,28].

Resveratrol tồn tại dưới hai dạng đồng phân 3, 4', 5 – trans – trihydroxystilben và 3, 4', 5 – cis – trihydroxystilben, trong đó dạng trans chiếm ưu thế và thể hiện hoạt tính sinh học [26,28]. Resveratrol còn được tổng hợp hóa học hoặc thu được nhờ công nghệ sinh học từ nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc Pichia pastoris [26]. Quá trình đồng phân hoá dạng cis có thể xảy ra khi dạng trans tiếp xúc với nhiệt, ánh sáng, tia tử ngoại [28] 1. Công thức hóa học và tính chất lý hóa Công thức phân tử: C14H12O3 Khối lượng phân tử: 228,24 g/mol Danh pháp IUPAC: 5-[(E)-2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol Hình 1.

Công thức cấu tạo của trans-resveratrol • Tính chất lý hoá: - Cảm quan: Bột rắn màu trắng - Nhiệt độ nóng chảy: 254°C - Hệ số phân bố octanol/nước: log P = 3,32 - Độ tan: Hầu như không tan trong nước (3 mg/100 ml nước) và dung dịch đệm phosphat pH 7,2 (100 ug/ml). Tan nhiều trong dung môi hữu cơ như ethanol, DMSO và dimethyl formamide (65 mg/ml). Tan tốt trong PEG-400 [12]. Tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn Resveratrol đã được nghiên cứu về khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm.

Resveratrol có khả năng hạn chế mụn trứng cá chủ yếu nhờ đặc tính kháng khuẩn chống lại Propionibacter Acnes và làm giảm sản xuất bã nhờn. Fabbrocini và cộng sự đã chứng minh rằng hydrogel chứa resveratrol được bôi hàng ngày lên mặt của 20 bệnh nhân bị mụn trứng cá. Người ta cũng xác định rằng hoạt tính kháng khuẩn của resveratrol chống lại P. Acnes tương đương với benzoyl peroxide nhưng không có tác dụng gây độc tế bào.

Do đó, resveratrol được cho là có tiềm năng trở thành một thành phần trị liệu mới trong điều trị mụn trứng cá [28]. Tác dụng chống ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng resveratrol có tác dụng chống khối u và có tiềm năng cho việc điều trị và phòng ngừa một số loại ung thư [18]. Resveratrol không chỉ hoạt động như một tác nhân phòng ngừa ung thư mà còn thể hiện các đặc tính hóa trị liệu liên quan đến tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và chống tăng sinh [35]. Resveratrol có nhiều mục tiêu trong tế bào ung thư như cyclooxygenase (COX)/ lipoxygenase (LOX), tyrosine kinase (p56lck), protein kinase C (PKC), protein kinase D (PKD), protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK), kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK)1/2, kinase hoạt hóa căng thẳng c- Jun N -terminal kinase 1/2, p38 MAPK và adenylyl cyclase.

Resveratrol có thể ức chế cả COX và LOX, từ đó có thể gây ra sự tổng hợp các phân tử tiền viêm rất quan trọng cho sự khởi đầu của quá trình hình thành khối u. Do đó, tác dụng ức chế hoạt động của COX/LOX chịu trách nhiệm cho các đặc tính chống ung thư của nó. Ngoài ra, resveratrol có thể ức chế p56lck, PKC và PKD. Việc ức chế PKC gây ra sự ức chế tăng trưởng và kích hoạt quá trình chết theo chương trình trong nhiều mô hình tế bào ung thư như ung thư dạ dày và ung thư tuyến tiền liệt [26].

Resveratrol có cấu trúc và đặc tính cụ thể khiến nó thể hiện sự tương đồng về cấu trúc trong điều kiện in vitro với estrogen tổng hợp (diethylstilbestrol) cũng như với các thụ thể estrogen (ER). Bowers và cộng sự đã chỉ ra rằng resveratrol exhibit có hoạt tính chủ vận/đối kháng hỗn hợp trên α và βER. Người ta đã quan sát thấy rằng các mô có biểu hiện ERβ lớn hơn ERα có thể nhạy cảm hơn với resveratrol như một chất chủ vận của ER. Các nghiên cứu in vitro về resveratrol, axit ellagic và 3-(-)-epigallo-catechin gallate đã cho thấy khả năng ngăn chặn các thụ thể estrogen và do đó có hoạt tính chống estrogen, có liên quan đến 3 khả năng ngăn ngừa ung thư.

Người ta đã quan sát thấy rằng resveratrol ức chế liên kết estradiol với thụ thể estrogen trong tế bào ung thư vú ở người [28]. Tác dụng bảo vệ thần kinh Resveratrol có một số vai trò bảo vệ thần kinh trong nhiều chứng suy thoái thần kinh khác nhau như bệnh Alzheimer, bệnh Huntington và bệnh Parkinson, bệnh xơ cứng teo cơ một bên và các rối loạn thoái hóa thần kinh do rượu [36]. Resveratrol làm giảm dẫn truyền thần kinh cholinergic, biểu hiện yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não và stress oxy hóa, thúc đẩy quá trình thanh thải peptide β-amyloid và phân cắt APP chống amyloidogenic, đồng thời làm giảm quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh. Resveratrol cũng có thể cải thiện khả năng vận động của chuột và vô hiệu hóa phản ứng viêm thần kinh sau xuất huyết não.

Nó có thể được sử dụng như một tác nhân điều trị mới để điều trị xuất huyết não [8]. Tác dụng chống lão hóa, chống viêm da Resveratrol cũng có thể bảo vệ da khỏi lão hóa do ánh nắng. Trong các nghiên cứu in vivo trên chuột không lông, người ta nhận thấy rằng việc sử dụng resveratrol trước khi tiếp xúc với UVB làm giảm đáng kể tình trạng phù da và giảm sản sinh H2O2 do UVB gây ra, đồng thời cũng có thể hạn chế quá trình peroxid hóa lipid và giảm thâm nhiễm bạch cầu [28]. Cơ chế hoạt động bảo vệ của resveratrol liên quan đến khả năng chống lại sự hình thành các gốc tự do và các loại oxy phản ứng cũng như ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid.

Hợp chất này đã được chứng minh là ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào sừng và khả năng tăng sinh của chúng, làm giảm nồng độ malondialdehyd và bảo vệ các enzym tế bào chống oxy hóa như superoxide effutase và glutathione peroxidase. Ngoài ra, còn làm giảm sự biểu hiện của yếu tố phiên mã AP-1 và NF-κB, hạn chế quá trình thoái hóa của collagen và sự đàn hồi của da và viêm da. Do đó, resveratrol cũng có thể được sử dụng như một thành phần hoạt chất trong mỹ phẩm chống lão hóa để bảo vệ da khỏi lão hóa do ánh sáng [28]. Ngoài ra, khả năng liên kết của resveratrol với ER (cả ERα và ERβ) cũng quan trọng trong lĩnh vực thẩm mỹ chống lão hóa.

Các thụ thể ERβ trong da được tìm thấy trên tế bào sừng, tế bào hắc tố, tế bào đuôi gai và nội mô mạch máu. Chúng tác động lên sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào sừng, tạo điều kiện cho sự bám dính chính xác của tế bào sừng, hình thành các hạt sừng và ức chế sự hình thành IL-12 và TNF-α và điều hòa sự bài tiết melanin. Các thụ thể ERα nằm trên nguyên bào sợi và đại thực bào. Chúng tham gia vào việc kích thích sản xuất collagen loại I và II bằng cách tác động đến sự tiết ra yếu tố tăng trưởng 4 chuyển hóa (TGF-β1) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (bFGF), ảnh hưởng thêm đến việc sản xuất chất nền ngoại bào.

Giardina và cộng sự đã thực hiện in vitro resveratrol đơn độc hoặc kết hợp với N-acetyl - cysteine ở liều 10-100-1000 μM có hoạt tính giống estrogen và có thể kích thích các nguyên bào sợi để tổng hợp collagen và ức chế hoạt động của collagen [28]. Buonocorn và cộng sự đã chứng minh rằng độ ẩm và độ đàn hồi của da đã được cải thiện, đồng thời độ nhám của da và độ sâu của nếp nhăn đã giảm đi sau khi tiến hành nghiên cứu việc sử dụng thực phẩm bổ sung chứa resveratrol [28]. Gonçalves và cộng sự đã đánh giá tác động của các công thức bôi ngoài da có chứa trans - resveratrol trong việc phục hồi và trẻ hóa da chuột sau khi lột da bằng hóa chất. Người ta phát hiện ra rằng resveratrol làm tăng độ dày của da và biểu bì thông qua tác động đến việc sản xuất collagen nhiều hơn, có thể làm tăng độ săn chắc và đàn hồi của da, đồng thời dẫn đến trẻ hóa da cũng như giảm nếp nhăn.

Resveratrol cũng có khả năng làm giảm ban đỏ [28] 1. Tác dụng làm trắng da Resveratrol còn có khả năng điều chỉnh hoạt động tyrosinase. Cơ chế hoạt động của các chất làm trắng da có thể diễn ra theo nhiều cách: bằng cách tương tác ở các phản ứng enzyme, nội tiết tố hoặc hóa học và sinh hóa. Resveratrol đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự điều hòa sau phiên mã của các gen tạo hắc tố.

Người ta đã chứng minh rằng resveratrol ức chế sự biểu hiện mRNA của tyrosinase, protein liên quan đến tyrosinase 1 và 2, yếu tố phiên mã liên quan đến bệnh microphthalmia (MITF) và DOPAchrome tautomerase (DCT) trong tế bào hắc tố ở người. Hơn nữa, người ta thấy rằng resveratrol làm giảm đáng kể tình trạng tăng sắc tố trên da chuột lang được kích thích bằng tia cực tím B trong cơ thể và ức chế tổng hợp melanin bằng cách giảm protein 2 liên quan đến tyrosinase trong dòng tế bào u ác tính B16 được kích thích bằng α-MSH [28]. Quan sát trong điều kiện in vitro và in vivo đã xác nhận rằng resveratrol và chất tương tự của nó (resveratryl triacetate, resveratryl triglycolate) trong các công thức mỹ phẩm có thể hoạt động như thành phần làm trắng. Do đó, khả năng ảnh hưởng đến hoạt động tyrosinase của resveratrol có tầm quan trọng lớn và ứng dụng thực tế trong lĩnh vực chế phẩm chống lão hóa có chức năng ngăn ngừa tăng sắc tố [28].

Tổng quan về hệ tiểu phân niosome 1. Khái niệm Niosome là một dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi lớp vỏ chất diện hoạt không ion hóa (có hoặc không có thêm cholesterol 5 và dẫn chất của nó) gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nm đến hàng chục µm. Cấu trúc này của niosome giúp nó có khả năng mang dược chất thân nước vào khoang nước, dược chất thân dầu vào lớp vỏ và dược chất lưỡng thân vào cả lớp vỏ và khoang nước [22, 27]. Cấu trúc của niosome 1.

Phân loại Dựa vào kích thước tiểu phân trung bình, có thể chia niosome thành 3 nhóm [30]: - Niosome nhỏ đơn lớp (SUV): Đường kính 10 - 100 nm - Niosome to đơn lớp (LUV): Đường kính 100 - 3000 nm. - Niosome nhiều lớp (MLV): Đường kính  1000 nm. Sơ đồ cấu trúc của niosome SUV, LUV, MLV 6 1.