ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, con người đang có xu hướng tìm đến những sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật. Cây Riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) từ lâu đã được người dân các nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Philipines…sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Cây Riềng ấm Nhật Bản có chứa các hoạt chất có tác dụng dược lý như các flavonoid, tannin, kavapyron và terpenoid [8]. Bột cây riềng ấm Nhật Bản có thể được sử dụng làm nguyên liệu cho các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng giúp kiểm soát cân nặng, ngăn ngừa lão hóa.
Trung tâm y học Makise Clinic & Makise Lifeup Laboratary, Nhật Bản đã nghiên cứu quy trình trồng với quy mô lớn và sản xuất ra các sản phẩm từ cây riềng ấm (Jipang Ginger) tại vùng đảo Okinawa (hình 1. Nhận thấy tiềm năng của cây Riềng ấm Nhật Bản, Viện Nghiên cứu phát triển Vùng đã nghiên cứu tuyển chọn giống, vùng nguyên liệu và thí nghiệm trên quy mô nhỏ tại Việt Nam. Từ nguồn dược liệu này, Viện Nghiên cứu phát triển Vùng đã tạo ra bột riềng ấm làm nguyên liệu cho nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với tác dụng kiểm soát cân nặng và ngăn ngừa lão hóa. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bột riềng ấm được sản xuất từ nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết.
Trước hết, cần phải có phương pháp phân tích hai hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong mẫu bột riềng ấm. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro- 5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” đã được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất 5,6- dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ứng dụng phương pháp vào thực tế để định lượng hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong một số mẫu bột riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) được trồng tại Việt Nam.
Tổng quan về cây Riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) Phân loại thực vật học của cây Riềng ấm (Alpinia zerumbet): Bộ: Bộ Gừng (Zingiberales) Họ: Gừng (Zingiberaceae) Phân họ: Alpinioideae Chi: chi Riềng (Alpinia) Loài: A. Zerumbet Tên khoa học: Alpinia Zerumbet (Pers) Hình 1. Cây riềng ấm Hình 1. Hoa của cây riềng ấm Hình 1.
Quả của cây riềng ấm Hình 1. Cây riềng ấm Cây riềng ấm (còn có các tên tiếng Việt khác như riềng đẹp; sẹ nước; gừng ấm; thảo đậu khấu; đại thảo khấu) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), chi Riềng (Alpinia), có nguồn gốc từ Đông Á. Riềng ấm là cây thảo cao khoảng 2 - 3m. Rễ to, mập.
Lá cây có phiến to, dài 25 - 70cm, rộng khoảng 6 - 10cm, cuống lá dài 2 - 5mm, mép cao 1,2cm. Cụm hoa ở ngọn, rủ xuống, dài 20 - 40cm, trục đầy lông; lá bắc con dài 20 - 30mm làm thành bao trắng, chóp; hồng; đài cao 2cm; cánh hoa 2,5cm, môi dài 3,5cm, vàng có sọc đỏ; nhị dài khoảng 25mm; bầu vàng, đầy lông. Quả to, đường kính 2cm, đỏ, có lông. Cây Riềng ấm ra hoa vào khoảng tháng 3 đến tháng 4, có quả vào tháng 7 đến tháng 10 [4].
Cây riềng ấm phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Trung Quốc và Việt Nam. Ở Việt Nam cây mọc rải rác ở các tỉnh phía Bắc qua các tỉnh miền Trung vào đến Tây Ninh và Bà Rịa - Vũng Tàu. Cây mọc hoang trong rừng ở những nơi ẩm và mát [4]. Cây riềng ấm từ lâu đã được sử dụng như một loại gia vị và một loại thuốc cổ truyền ở một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippines, Malaysia… điều trị các 5 chứng bệnh liên quan đến tim mạch, trị bệnh đau bụng hay đắp lên vết thương chống viêm nhiễm [22], [23].
Các nghiên cứu cho thấy cây riềng ấm có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý như flavonoid, tannin, kavapyron và terpenoid [7], trong đó các kavapyron trong cây riềng ấm đang được các nhà khoa học quan tâm. Cây riềng ấm có tác dụng chống oxi hóa và chống lão hóa tốt. Nghiên cứu của Pham Thi Be Tu [18] cho thấy tinh dầu chiết từ lá cây riềng ấm có đặc tính chống oxi hóa mạnh khi được thử nghiệm với các tác nhân oxi hóa như 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH); muối diamoni 2,2ʹ-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic) (ABTS); oxit nitric; oxy nhóm đơn và xanthyn oxidase. Tinh dầu chiết từ lá cây riềng ấm còn có khả năng chống lại hắc tố và enzyme lão hóa, chẳng hạn như collagenase, tyrosinase, hyaluronidase và elastase.
Tác dụng chống béo phì của cây riềng ấm cũng đã được nghiên cứu trong các nghiên cứu trước đó. Thử nghiệm trên tế bào mỡ 3T3-L1 cho thấy cây riềng ấm với các hoạt chất nhóm kavalacton có tiềm năng rất lớn trong việc chống béo phì [20]. Ngoài ra các nghiên cứu còn cho thấy cây riềng ấm có tác dụng kháng virus [7] và ngăn ngừa sự lây lan của tế bào ung thư [10], [24]. Đã có quan điểm đưa ra rằng cây riềng ấm góp phần kéo dài tuổi thọ của người dân tại Okinawa, Nhật Bản – nơi được biết đến là vùng có tuổi thọ trung bình rất cao [17].
Hiện nay ở Nhật Bản đã có nhiều thực phẩm chức năng từ cây riềng ấm (hình 1. Tuy nhiên, do vấn đề khí hậu và địa lý, cây riềng ấm chỉ có thể sinh trưởng ở vùng Okinawa ở Nhật Bản. Các chuyên gia từ Nhật Bản nhận thấy điều kiện tự nhiên ở Việt Nam phù hợp với cây riềng ấm, qua đó viện Nghiên cứu và phát triển Vùng đã tiến hành nghiên cứu về cây riềng ấm trồng tại Việt Nam nhằm phát triển nguyên liệu bột dược liệu riềng ấm để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Bột lá riềng ấm và viên thực phẩm chức năng từ cây riềng ấm 6 1.
Tổng quan về hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6- dehydrokavain (DDK) 1. Tính chất lý hóa Bảng 1. Đặc điểm của DK và DDK Hoạt 5,6-Dehydrokavain (DK) Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) chất Công thức cấu tạo Công thức: C14H12O3 Công thức:C14H14O3 Tên gọi - Danh pháp IUPAC: - Danh pháp IUPAC: [12], 4-methoxy-6-[(E)-2- 4-methoxy-6-(2- [13] phenylethenyl]pyran-2-one phenylethyl)pyran-2-one - Danh pháp khác: - Danh pháp khác: + 5,6-Dehydrokavain + Dihydro-5,6-dehydrokavain + Desmethoxyyangonin + 7,8-Dihydro-5,6-dehydrokawain + 5,6-Dehydrokawain + 5,6-Dehydro 7,8-dihydrokavain Tính - Dạng bột kết tinh màu trắng hoặc - Dạng bột kết tinh màu trắng chất vật vàng nhạt. - Phân tử lượng: 230,26 g/mol lý - Phân tử lượng: 228,24 g/mol - XlogP-AA: 2,7 - XlogP3-AA: 2,8 - Tan trong nước, methanol [12], - Tan trong nước, methanol - Nhiệt độ nóng chảy: 96-97℃ [23] [13] - Nhiệt độ nóng chảy: 138 - 140℃ 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) thuộc nhóm kavalacton.
Kavalacton là một nhóm các hợp chất lacton ban đầu được tìm thấy trong cây kava. Ngoài DK và DDK, một số hợp chất thuộc nhóm kavalacton khác phải kể đến như kavain, yagonin, methysticin… [11]. Dựa trên cấu trúc pyron trong phân tử, các kavalacton được phân loại thành các nhóm từ A đến D phụ thuộc vào sự hiện diện hoặc vắng mặt của liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8. Cụ thể, các kavalacton thuộc nhóm A đều không có liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8.
Ngược lại, các kavalacton thuộc nhóm B chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 7, 8; còn nhóm C có liên kết chưa bão hòa ở cả 7 hai vị trí 5, 6 và 7, 8. Các kavalacton nhóm D chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 5, 6. Theo đó, DK là một kavalacton thuộc nhóm C, còn DDK thuộc nhóm D [23]. Tác dụng dược lý của hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro- 5,6-dehydrokavain (DDK) Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của các kavalacton tìm có trong các lại thực vật, đặc biệt là hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong cây riềng ấm.
Các nghiên cứu hiện đại cho thấy rằng hai hoạt chất DK và DDK có khả năng chống béo phì [17], [19], [20]. Cụ thể, các hợp chất này làm tăng giải phóng cAMP và glycerol nội bào, ức chế tích lũy lipid và giảm hàm lượng chất béo trung tính. Hơn nữa, chúng ức chế GPDH và lipase tuyến tụy và không có hoạt tính gây độc tế bào có thể đo lường được đối với tế bào mỡ 3T3-L1 trong ống nghiệm. Nhìn chung, các kết quả cho thấy DK và DDK có tiềm năng mạnh mẽ trong vai trò chống béo phì [20].
DK và DDK còn có khả năng kháng virus HIV và virus cúm [7]. DK và DDK làm ức chế men tích hợp (HIV-1 integrase) - loại men cần thiết để đưa DNA của vi rút HIV vào DNA của tế bào chủ. Với virus cúm, chúng ức chế hoạt động của kháng nguyên bề mặt neuraminidase (NA), ngăn chặn quá trình phóng thích virus từ các tế bào bị nhiễm sang tế bào khỏe mạnh, từ đó hạn chế sự lây lan và phát triển của bệnh [7]. Đặc biệt, nghiên cứu của Walter và cộng sự [10] cho thấy DK có khả năng kháng ung thư thông qua việc ức chế mạnh các tế bào glioblastoma (u nguyên bào thần kinh đệm) và tác dụng vừa phải trên tất cả các dòng tế bào khối u khác.
Nghiên cứu của Yen Thi‐Kim Nguyen [24] sử dụng phương pháp MTT đã chỉ ra rằng DK đã giảm đáng kể việc di chuyển và xâm chiếm của tế bào MDA ‐ MB ‐ 231; từ đó có tác dụng chống xâm lấn và chống di căn các tế bào ung thư. Một số phương pháp phân tích hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) 1. Dung môi chiết mẫu Dựa theo tính chất lý hóa của DK và DDK, các nghiên cứu thường lựa chọn dung môi chiết mẫu là các dung môi thân nước như nước, methanol, aceton. Nghiên cứu của Tran Dang Xuan [23] cho thấy sự khác biệt về khả năng chiết DK và DDK của các dung môi đối với đối tượng nghiên cứu là rễ cây kava, từ đó có thể xem xét áp dụng những dung môi đó trong việc chiết mẫu bột riềng ấm.
So sánh hiệu quả các dung môi chiết với DK và DDK Lượng chiết được (mg/g dung môi chiết) Hoạt chất Nước Acetone Chloroform Methanol Ethanol Hexane DK 6,7 21,0 7,6 4,3 2,1 2,7 DDK 22,9 27,1 4,7 4,7 2,1 1,9 1. Phương pháp phân tích DK và DDK trong mẫu Các tài liệu khoa học đã công bố trước đây có một số phương pháp phân tích 5,6- Dehydrokavain và Dihydro-5,6-dehydrokavain.