Khóa luận Dược sĩ: Xây dựng phương pháp định lượng nguyên liệu Carbocistein Lysin

Khóa luận trình bày chi tiết phương pháp định lượng nguyên liệu Carbocistein Lysin bằng HPLC, bao gồm quy trình và kết quả thẩm định độ chính xác.

• Tác giả: Chu Thị Hương Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Hiền
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng nguyên liệu Carbocistein Lysin bằng HPLC
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Carbocistein Lysin và ý nghĩa định lượng

Carbocistein lysin là một hợp chất dược học được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh đường hô hấp, đặc biệt là bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD). Đây là sự kết hợp giữa carbocistein - một chất có tác dụng làm loãng đờm - với lysin, một axit amin thiết yếu. Sự phối hợp này giúp tăng cường hiệu quả điều trị và cải thiện khả năng hấp thu của cơ thể. Việc định lượng chính xác carbocistein lysin là vô cùng quan trọng để đảm bảo chất lượng, độ an toàn và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm chứa thành phần này. Phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong phân tích định lượng các hợp chất dược học.

1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của Carbocistein Lysin

Carbocistein lysin được hình thành từ sự kết hợp giữa carbocistein - một dẫn chất của cysteine có chứa nhóm carboxyl - với lysin. Cấu trúc phân tử này tạo nên những tính chất lý hóa độc đặc, bao gồm khả năng hòa tan tốt trong nước và độ ổn định cao. Hợp chất này có thể phân tích bằng phổ UV-Vis ở bước sóng 210-220 nm, cho phép phát hiện chính xác trong các mẫu dược phẩm.

1.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng lâm sàng

Carbocistein lysin có tác dụng làm loãng chất nhầy đường hô hấp, giúp bệnh nhân ho sạch đờm hiệu quả hơn. Nó được chỉ định trong điều trị viêm phế quản mạn tính, hen phế quản, và COPD. Lysin trong hợp chất này cải thiện quá trình chuyển hóa và hấp thu, tăng sinh lực lâm sàng của carbocistein, làm cho nó trở thành lựa chọn ưu tiên so với carbocistein thuần.

II. Nguyên lý và ưu điểm của phương pháp HPLC định lượng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hiện đại, cho phép tách biệt, nhận dạng và định lượng các thành phần hóa học trong mẫu phức tạp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý tương tác giữa các phân tử mẫu với pha cố định và pha động, tạo ra các thời gian lưu trú (retention time) khác nhau. Đối với định lượng carbocistein lysin bằng HPLC, phương pháp này cung cấp độ chính xác cao, độ phân giải tốt, và độ lặp lại xuất sắc. Với sự hỗ trợ của detector UV-Vis, phương pháp HPLC có thể phát hiện được những nồng độ rất thấp của hợp chất, giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm hiệu quả. Đây là lý do tại sao HPLC được khuyến nghị bởi các tổ chức quốc tế như ICH và AOAC.

2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động máy HPLC

Máy HPLC bao gồm các thành phần chính: bơm áp suất cao, bộ phun mẫu (injector), cột phân tích, detector, và hệ thống xử lý dữ liệu. Pha động được bơm qua cột với áp suất cao (100-300 atm), nơi các thành phần mẫu tương tác với pha cố định. Mức độ tương tác khác nhau dẫn đến thời gian lưu trú khác nhau, cho phép phân tách các hợp chất. Detector UV-Vis ghi nhận cường độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng định trước, tạo thành sắc ký đồ.

2.2. Các tham số đặc trưng trong phân tích HPLC

Các tham số quan trọng bao gồm: thời gian lưu trú (tR) - thời gian mẫu xuất hiện trên detector, độ phân giải (Rs) - khả năng tách biệt các peak, hệ số tailing (Tf) - hình dạng peak, và số đĩa lý thuyết (N) - hiệu quả cột. Những tham số này được đánh giá trong kiểm định độ thích hợp hệ thống (SST) để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp trước khi tiến hành phân tích mẫu thực tế.

III. Quy trình xây dựng phương pháp HPLC định lượng Carbocistein Lysin

Xây dựng phương pháp HPLC định lượng carbocistein lysin là một quá trình có hệ thống, bao gồm nhiều bước quan trọng. Trước tiên, phải thực hiện khảo sát bước sóng phát hiện bằng cách quét phổ UV-Vis của từng thành phần. Tiếp theo là lựa chọn pha động - thường sử dụng buffer phosphat hoặc acid phosphoric pha với acetonitril (ACN) - để đạt được sự phân tách tối ưu. Tốc độ dòng (flow rate) thường từ 0,8-1,0 ml/phút được khảo sát để giảm thời gian phân tích mà vẫn đảm bảo phân giải tốt. Việc chuẩn bị mẫu cũng rất quan trọng, thường dùng dung dịch pha động để hòa tan mẫu, loại bỏ các tạp chất qua lọc màng 0,45 μm. Cuối cùng, phương pháp phải được thẩm định đầy đủ theo các tiêu chuẩn quốc tế trước khi áp dụng vào thực tế.

3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu

Bước sóng phát hiện thường chọn ở 210-220 nm vì lysin và carbocistein đều hấp thụ mạnh tại vùng này. Pha động được khảo sát từ buffer phosphat pH 4,5 đến acid phosphoric 0,01M, kết hợp với acetonitril ở tỷ lệ khác nhau (5-15% v/v). Cột C18 được sử dụng phổ biến do khả năng phân tách tốt. Thời gian phân tích nên tối ưu để vừa đảm bảo phân giải vừa giảm thời gian phân tích.

3.2. Chuẩn bị mẫu và tiêu chuẩn

Mẫu chuẩn carbocistein và lysin được cân chính xác và hòa tan trong dung dịch pha động để tạo các dãy nồng độ (từ 5-100 μg/ml). Mẫu thử từ sản phẩm dược phẩm được xử lý tương tự, đảm bảo tính đại diện của mẫu. Tất cả mẫu phải được lọc qua membrane 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC để loại bỏ các hạt không tan.

IV. Thẩm định phương pháp và ứng dụng thực tế

Thẩm định phương pháp HPLC là bước thiết yếu để đảm bảo độ tin cậy, độ chính xác và khả năng áp dụng của phương pháp trong kiểm nghiệm dập sản phẩm. Các tiêu chí thẩm định chính bao gồm: độ đặc hiệu (kiểm tra xem phương pháp có phân biệt được carbocistein và lysin hay không), độ tuyến tính (mối quan hệ giữa nồng độ và tín hiệu detector), độ đúng (kiểm tra qua thêm chuẩn), độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện), và độ chính xác trung gian (độ chính xác giữa các ngày, các người làm). Ngoài ra, phải đánh giá phạm vi hoạt động (working range), giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Sau khi thẩm định thành công, phương pháp HPLC này có thể được áp dụng để kiểm soát chất lượng carbocistein lysin trong các nhà máy sản xuất, kiểm định độ tinh khiết, và phân tích hàm lượng hoạt chất trong các sản phẩm dược phẩm thương mại.

4.1. Các tiêu chí thẩm định chính

Độ đặc hiệu được kiểm tra bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu trắng (blank), mẫu chuẩn, và mẫu thử. Độ tuyến tính được xác định từ đường chuẩn với hệ số tương quan (R²) ≥ 0,99. Độ đúng được thẩm định bằng thêm chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau (50%, 100%, 150%) và tính phần trăm hồi phục (%Recovery) phải từ 95-105%. Độ lặp lại được kiểm tra qua phân tích 6 lần cùng mẫu, với RSD ≤ 2%.

4.2. Ứng dụng của phương pháp trong kiểm soát chất lượng

Phương pháp HPLC được xây dựng có thể được sử dụng để kiểm định độ tinh khiết của nguyên liệu carbocistein lysin, xác định hàm lượng trong các sản phẩm dộc phẩm (viên nang, dung dịch uống), và phát hiện các tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy. Phương pháp này đáp ứng các tiêu chuẩn của ICH, AOAC, và có thể được đưa vào Dược điển để sử dụng rộng rãi trong các cơ sở phân tích dược phẩm, đảm bảo chất lượng sản phẩm và an toàn cho người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về carbocistein 1. Cấu trúc hóa học Hình 1.Cấu trúc hóa học của carbocistein. - Công thức phân tử: C5H9NO4S [7].

- Khối lượng phân tử: 179,19 g/mol [8]. - Một số tên gọi khác: carbocystein, S-carboxymethyl-L-cystein [8]. Tính chất vật lý - Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng [7]. - Hầu như không tan trong nước và trong ethanol 96% [7].

- Tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và kiềm loãng [7]. Tính chất hóa học Carbocistein có cấu trúc của một α-amino acid, có chứa nhóm –COOH và –NH2 nên có các phản ứng đặc trưng của các nhóm amin và carboxyl như phản ứng acetyl hóa, phản ứng formyl hóa hay este hóa [9]. Một số phản ứng hóa học của carbocistein STT Tên phản ứng Nguyên tắc 1 Phản ứng với Nhóm amin và nhóm carboxyl của α-amino acid bị oxy hóa ninhydrin bởi ninhydrin khi đun nóng tạo dạng khử, CO2, NH3 và aldehyd. Sau đó ninhydrin và sản phẩm khử lại phản ứng tiếp với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở λ= 570 nm, cường độ màu có thể xác định được nồng độ α-amino acid, vì vậy phản ứng có thể dùng để định tính, định lượng α-amino acid.

2 Phản ứng Biure Trong môi trường kiềm, acid amin tạo phức nội phân tử với ion Cu2+ tạo phức hợp màu tím ở dạng anion. Phản ứng này 2 tạo phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng acid amin. 3 Phản ứng với Fluorescamin phản ứng với nhóm α-amino của α-amino Fluorescamin acid tạo dẫn xuất huỳnh quang. Phản ứng này rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới cỡ nano gram.

4 Phản ứng Sanger Acid amin phản ứng với clorid dabsyl, clorid dansyl và 1- fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein. Phản ứng dùng để xác định acid amin-N tận cùng dựa trên phản ứng của acid amin phản ứng với clorid dabsyl và 1-fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein. 5 Phản ứng Folh Khi đun nóng trong môi trường kiềm tạo ra muối sulfid, chất này phản ứng với muối chì tạo chì sulfid màu đen xám. Tác dụng dược lý và ứng dụng trong điều trị Carbocistein hấp thu nhanh sau khi uống, động học của thuốc tuân theo mô hình một ngăn [9].

Đỉnh nồng độ trong huyết tương đạt được sau 1-2 h. Thời gian bán thải 1,33 h. Carbocistein có khả năng thấm sâu vào mô phổi và dịch hô hấp, phát huy tác dụng điều trị tại chỗ [10]. Tác dụng điều hòa và giải phóng dịch nhầy: Các thành phần đường (fucose và acid sialic) trên glycoprotein nhầy (còn được gọi là mucins) có liên quan đến độ nhớt của dịch nhầy đường tiêu hóa [11].

Carbocistein điều chỉnh hàm lượng fucose và acid sialic trong glycoprotein niêm mạc, có thể thông qua việc ức chế các thay đổi hoạt động của fucosidase, sialidase, fucosyltransferase và sialyltransferase, do đó làm giảm độ nhớt của dịch nhầy [12]. Thêm vào đó, carbocistein còn có tác dụng làm loãng đờm bằng cách cắt đứt cầu nối disulfid liên kết chéo các chuỗi peptid của mucin. Tính chất này làm giảm độ quánh của chất nhầy, và giúp khạc đờm dễ dàng [13]. Bằng chứng từ các nghiên cứu trên động vật cho thấy carbocistein làm tăng vận chuyển ion clorid qua tế bào biểu mô đường dẫn khí, điều này có thể góp phần vào tác dụng điều hòa tiết chất nhầy của hoạt chất [14].

Tác dụng chống oxy hóa và chống viêm: Trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng, carbocistein đã được chứng minh là làm giảm sự xâm nhập của bạch cầu trung tính vào bên trong cấu trúc phế nang, giảm hàm lượng interleukin (IL-8), hàm lượng cytokin (IL-6) và 8-isoprostane sản xuất ra trong bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính [4]. Trong một 3 nghiên cứu in-vivo, đặc tính dọn dẹp gốc tự do được chứng minh thông qua việc nhóm thioeste của carbocistein có thể bị oxy hóa bởi các gốc oxy hoạt động và tạo thành sản phẩm phụ sulfoxid hoặc dẫn chất sulfon [15]. Carbocistein cũng có thể giảm tình trạng viêm đường hô hấp bằng cách ức chế sự bám dính của vi khuẩn, virus vào tế bào biểu mô hầu họng con người trong mô hình ống nghiệm [16], [17]. Ứng dụng điều trị: Không chỉ được nghiên cứu tác dụng trên các mô hình in-vitro và in-vivo, carbocistein cũng được công nhận có tác dụng trên lâm sàng đối với bệnh nhân COPD, làm giảm tỷ lệ đợt cấp và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [1],[18].

Có bằng chứng cho thấy carbocistein làm tăng sự thâm nhập của amoxicilin vào dịch tiết phế quản của bệnh nhân bị viêm phế quản mạn tính do vi khuẩn khi sử dụng đồng thời [10], [19]. Từ đó, carbocistein được chỉ định điều trị trong các rối loạn đường hô hấp tăng tiết dịch nhầy quá mức hoặc đờm đặc như viêm phế quản cấp và mạn tính, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, hỗ trợ điều trị trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [4], [20], [21]. Tuy nhiên chống chỉ định với các bệnh nhân viêm loét dạ dày tiến triển, vì thuốc có khả năng phá hủy hàng rào niêm mạc dạ dày [4]. Tổng quan về carbocistein lysin 1.

Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của carbocistein lysin. - Công thức phân tử: C11H23N3O6S [6]. - Khối lượng phân tử: M = 325,38 g/mol [6]. - Tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng [22].

- Điểm nóng chảy: 179,2 – 182,5 °C [22]. - Một số tên gọi khác: Carbocistein lysin, S-carboxymethyl-L-cystein lysin. Tác dụng dược lý và ưu điểm so với carbocistein Tác dụng dược lý: Muối lysine của carbocistein có thể được sử dụng dưới dạng chế phẩm uống. Nhóm lysine sẽ bị phân cắt trong quá trình hấp thu tại dạ dày, tạo thành carbocistein hoạt tính [4].

Cũng giống như carbocistein, muối lysin là một chất tiêu đờm hiệu quả, thông qua cơ chế phá vỡ các cầu nối disulfid của glycoprotein, tác động vào pha gel của đờm. Carbocistein lysin thiết lập sự cân bằng giữa các chất nhầy sialomucin và fucomucin, do đó làm tăng tính lưu động và loại bỏ chất nhầy. Carbocistein lysin cũng đã được chứng minh khả năng điều chỉnh vận chuyển Cl- qua biểu mô khí quản, do đó giúp điều hòa tiết dịch [23]. Carbocistein lysin còn có khả năng chống oxy hóa mạnh, đặc biệt là dọn dẹp các gốc tự do acid hypoclorid (HOCl) và gốc hydroxyl (OH•).

Tác dụng này có được nhờ nhóm thioether tác dụng với các gốc tự do, giúp bảo vệ α1-antitrypsin (α1-AT) – chất ức chế protease chính trong huyết thanh – khỏi bị oxy hóa. Ngoài ra, carbocistein lysin cũng làm giảm sản xuất interleukin-8 (IL-8) – một chất gây viêm quan trọng do các bạch cầu đa nhân trung tính tiết ra qua trung gian (OH•), đồng thời bảo vệ mô khỏi tổn thương do phản ứng viêm [24]. Khi dùng bằng đường uống hoặc dạng khí dung, carbocistein lysin đã giảm đáng kể viêm phổi và tăng phản ứng đường thở gây ra bởi interleukin -1 beta (IL-1β), carrageenan và khói thuốc lá ở động vật thí nghiệm. Đặc biệt, thuốc này làm giảm số lượng neutrophil và eosinophil, đồng thời làm giảm mức độ co thắt phế quản khi tiếp xúc với khói thuốc lá.

Những tác dụng này cho thấy carbocistein lysin không chỉ có tác dụng long đờm mà còn có thể giảm viêm và tăng phản ứng đường thở, mang lại lợi ích trong điều trị các bệnh lý viêm phổi tắc nghẽn mạn tính và hen suyễn [25]. Paone và các cộng sự đã tiến hành một thử nghiệm lâm sàng nghiên cứu về tác dụng của muối carbocistein lysin trên tần số của đợt cấp ở bệnh nhân COPD có hoặc không sử dụng steroid hít. Việc sử dụng thuốc này liều 2,7 g/ngày giúp giảm đáng kể số lần đợt cấp COPD trong 1 năm điều trị, không phụ thuộc vào việc có dùng corticosteroid dạng hít hay không. Tác dụng này giúp cải thiện chất lượng sống và giảm gánh nặng kinh tế, từ đó có thể đưa ra khuyến nghị sử dụng carbocistein lysin trong thực hành lâm sàng [26].

Ưu điểm so với carbocistein: Cấu trúc carbocistein với 2 nhóm –COOH, tính acid khá cao, do đó thuốc có khả năng kích thích đường tiêu hóa, có thể khiến dạ dày khó chịu, buồn nôn, nôn, xuất huyết tiêu hóa 5 và các tác dụng phụ khác. Nếu sử dụng lâu dài thuốc dễ gây tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa, dẫn đến chảy máu, loét hoặc thủng và các tác dụng phụ nghiêm trọng khác [27]. Carbocistein hòa tan kém trong nước, tính acid cao và tính chất cảm quan kém, làm hạn chế đáng kể việc sử dụng của bệnh nhân [28]. Muối lysin hòa tan tốt trong nước có tác dụng tương tự, loại bỏ được các nhược điểm của carbocistein, từ đó được khuyến khích sử dụng cho các bệnh phổi mạn tính cần điều trị bằng thuốc điều hòa đờm lâu dài [20], [29], [30].

Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng để tách các hợp chất trong hỗn hợp với mục đích định tính, định lượng và tinh chế các thành phần của hỗn hợp. Trong đó, các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng. Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác nhau do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau.

Với các chất cùng nhóm có cấu trúc khá tương đồng hoặc đồng phân đối quang cần tác động vào hệ tách gồm pha tĩnh và pha động để có thể thu được hiệu quả tách đáp ứng yêu cầu [31], [32]. Cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao sẽ có những bộ phận cơ bản sau: - Hệ thống cấp pha động: Pha động được bơm từ bình chứa rồi chảy quan cột với tốc độ được cài đặt sẵn và cuối cùng qua detector - Bộ phận tiêm mẫu. - Cột pha tĩnh. - Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu [31].

Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao được biểu diễn như hình dưới đây: Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo của máy HPLC 6 1. Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao a. Hệ số phân bố K Tốc độ di chuyển của các chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K.