ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài thập kỷ qua, các hợp chất từ các nguồn tự nhiên trở nên quan trọng và ngày càng được sử dụng phổ biến vì sự đa dạng hóa học và tính an toàn sinh học. Điều này đã dẫn đến sự gia tăng cao về nhu cầu đối với thảo dược, đồng thời kéo theo đó càng cần phải đảm bảo chất lượng, an toàn và hiệu quả của các loại dược liệu và thuốc từ thảo dược. Tuy nhiên, chất lượng dược liệu đang gặp nhiều vấn đề như bị giả mạo, nhầm lẫn, không có hoạt chất chính hoặc hàm lượng thấp, việc kiểm tra chất lượng dược liệu rất khó khăn do thiếu chất chuẩn và nền mẫu phức tạp. Hoàng Kỳ là một vị thuốc dược liệu được sử dụng rất phổ biến, với nhiều tác dụng trên tim mạch, thận, gan, có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống tăng đường huyết [5], [16].
Ngày nay, Hoàng Kỳ xuất hiện nhiều trên thị trường dưới dạng các chế phẩm cao, viên hoàn, trà uống,… với mục đích chủ yếu là bổ khí dưỡng huyết, dùng khi mệt mỏi, nhưng hay bị nhầm lẫn với Hồng Kỳ. Astragaloside IV có trong Hoàng Kỳ , là một saponin với nhiều tác dụng như chống viêm, chống ung thư và đóng vai trò là 1 chất chỉ điểm “marker” trong kiểm nghiệm Hoàng Kỳ [13], [40]. Sự có mặt và hàm lượng của Astragaloside IV là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng Hoàng Kỳ với giới hạn hàm lượng cho phép (theo DĐVN V là 0,04%), ngoài ra còn dùng để phân biệt Hoàng Kỳ và Hồng Kỳ. Các phương pháp định lượng Astragaloside IV trong Hoàng Kỳ hiện nay bao gồm phương pháp HPLC [2], [10], [14], [21], [38], [42] và HPTLC [28], [29], [41].
Phương pháp HPLC với ưu điểm độ nhạy, độ chọn lọc cao, tuy nhiên do Astragaloside IV hấp thụ ở bước sóng ngắn, không phát hiện được băng detector DAD, mà phải sử dụng các detector ELSD, MS, PAD không phổ biến và đắt. Trong khi đó, tạo dẫn xuất đáp ứng UV rồi định lượng chất là một trong số những ưu điểm của phương pháp HPTLC bằng cách phun thuốc thử hiện màu giúp cho quá trình đơn giản hơn, đồng thời phương pháp HPTLC còn giúp tiết kiệm chi phí và thời gian khi có thể định lượng được nhiều mẫu cùng lúc. Tại Việt Nam hiện chưa có công bố phương pháp định lượng Astragaloside IV bằng HPTLC. Do vậy, khóa luận “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Astragaloside IV trong Hoàng Kỳ bằng HPTLC” được thực hiện nghiên cứu với các mục tiêu sau: 1.
Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng astragaloside IV trong Hoàng Kỳ bằng HPTLC. Bước đầu ứng dụng định lượng Astragaloside IV trong một số mẫu dược liệu trên thị trường. Tổng quan về Hoàng Kỳ 1. Đặc điểm thực vật Hoàng Kỳ là cây sống lâu năm, cao 50-80 cm, rễ cái dài, mọc sâu, khó bẻ, vỏ ngoài màu vàng đỏ hoặc nâu.
Thân mọc thẳng đứng, trên có phân nhiều cành. Lá mọc so le kép, có dìa lẻ, có lá kèm hình 3 cạnh, có 6-13 đôi lá chét hình trứng dài 5-23 mm, mặt dưới có nhiều lông trắng mịn [5]. Hoàng Kỳ - Astragalus membranaceus [5] Cụm hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, dài hơn lá, gồm 5-22 hoa, màu vàng tươi. Quả giáp mỏng, dẹt, đầu dài ra thành gai nhọn, trên quả có lông ngắn, 5-6 hạt màu đen hình thận [5].
Đặc điểm vị dược liệu Hoàng Kỳ Rễ Hoàng Kỳ Radix Astragalus là rễ phơi hoặc cây sấy khô của Hoàng Kỳ Mông Cổ [Astragalus membranaceus (Fishc.) Hsiao], hoặc cây Hoàng Kỳ Mạc Giáp (Astragalus membranaceus (Fishc., thuộc họ Đậu (Fabaceae) [2]. Rễ Hoàng Kỳ Rễ hình trụ, đôi khi phân nhánh, trên to, phần dưới nhỏ dần, dài 30 cm đến 90 cm, đường kính 1 cm đến 3,5 cm. Mặt ngoài màu vàng hơi nâu nhạt hoặc màu nâu nhạt, với nếp nhăn dọc và rãnh dọc không đều. Chất cứng, dai, không dễ bẻ gãy, mặt gãy nhiều sợi và nhiều tinh bột; phần vỏ màu trắng hơi vàng, gỗ màu vàng nhạt với những vết nứt và tia hình nan quạt.
Phần giữa của rễ già, đôi khi có dạng gỗ mục nát, màu nâu 2 hơi đen hoặc rỗng. Mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt và hơi tanh như mùi đậu khi nhai [2]. Phân bố Hoàng Kỳ ưa sáng và ưa ẩm, phát triển tốt ở vùng có khí hậu ôn đới ẩm, nhiệt độ trung bình khoảng 15 độ C [5]. Bộ phận dùng Rễ Hoàng Kỳ đã phơi hoặc sấy khô [5].
Thành phần hóa học Hơn 100 thành phần hóa học đã được khám phá trong rễ Hoàng Kỳ , gồm 3 nhóm chất chính có hoạt tính sinh học là saponins, polysaccharides và flavonoids; bên cạnh đó còn một số chất thuộc nhóm amino acids và các thành phần khác [5], [16], [17], [22]. Nhóm saponin với hơn 40 thành phần đã được phát hiện, hầu hết đều có vòng triterpenoid A, gồm có Astragaloside I – VIII, Acetyl-astragaloside, Soyasaponin. Trong đó, AS IV là một trong những hoạt chất chính trong rễ Hoàng Kỳ và được dùng để kiểm soát, đánh giá chất lượng Hoàng Kỳ [17], [22]. Công thức cấu tạo của một số saponin trong Hoàng Kỳ [17] Nhóm flavonoid gồm có isoflavones (calycosin, formononetin), isoflavanes (isomucronulatol) và pterocarpanes (9-methoxy-nissolin).
Calycosin-7-O-β-d-glucoside cũng đóng vai trò là 1 marker trong kiểm nghiệm Hoàng Kỳ được quy định trong chuyên luận riêng [17], [22]. Công thức cấu tạo của một số flavonoid trong Hoàng Kỳ [17] Nhóm Polysarrcharide gồm astragalan I, II, III, astraglucans 1, 2, 3 (α-1-4-, α-1- 6-gluc), astraheterosaccharides 1, 2 và astramembramin Mem - P - [5], [17], [22]. Chế biến Có thể sử dụng Hoàng Kỳ sống bằng cách lấy dược liệu đem rửa sạch, ủ mềm, thái phiến mỏng, sấy nhẹ hoặc phơi khô. Hoặc chế Hoàng Kỳ tẩm mật sao: lấy 1 ít mật ong hòa vào nước sôi rồi tẩm vào Hoàng Kỳ đã thái phiến.
trộn đều, ủ cho thuốc ngấm mật, sao nhỏ lửa cho vàng đến khi cầm không dính tay. Tính vị, quy kinh Hoàng Kỳ có vị ngọt, tính ấm, quy kinh phế, tỳ [4]. Tác dụng trên tim Trên tế bào cơ tim nuôi, Hoàng Kỳ làm giảm điện thế nghỉ và tăng sức co, chứng tỏ có ảnh hưởng đến Na+-K+-ATPase. Saponin Hoàng Kỳ làm tăng sức co cơ tim cô lập của chuột cống trắng [5].
Tác dụng trên gan Saponin astramembranin 1 làm tăng sinh tổng hợp AND ở chuột nhắt trắng đã cắt 1 phần gan và trong quá trình tái sinh gan, sự liên kết của [3H] thymidin vào gan tăng lên. Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng gây tổn thương gan bằng cacbon tetraclorid, thấy Hoàng Kỳ có tác dụng bảo vệ gan, ngăn ngừa sự giảm hàm lượng glycogen gan, 4 làm tăng hàm lượng protein và albumin toàn phần trong huyết thanh [5], [16]. Tác dụng trên hệ miễn dịch Thử nghiệm in vitro cho thấy, dịch chiết polysarrcharide từ Hoàng Kỳ nồng độ 10 mg/ml làm tăng khả năng thực bào của các đại thực bào và các bạch cầu đa nhân. Thực hiện thử nghiệm in vivo: tiêm tĩnh mạch polysaccharid Hoàng Kỳ sẽ khắc phục sự ức chế miễn dịch do cyclophosphamid ở chuột cống trắng.
Nước sắc Hoàng Kỳ cho chuột nhắt trắng uống hằng ngày hoặc cách ngày trong 1-2 tuần làm tăng chức năng thực bào của hệ lưới nội mô. Trên nghiên cứu lâm sàng, cao nước nóng Hoàng Kỳ , tiêm bắp thịt trong 3-4 tháng cho bệnh nhân bị viêm cơ tim do virus làm tăng tế bào diệt tự nhiên trong cơ thể, một đáp ứng trung gian qua tăng sản sinh interferron [5]. Tác dụng chống tăng đường huyết Các polysaccharide Hoàng Kỳ có thể làm giảm đáng kể lượng đường trong máu và hàm lượng chất béo trung tính trong huyết thanh, carbohydrate và lipoprotein tỷ trọng thấp loại 2 ở chuột mắc bệnh tiểu đường, đồng thời làm tăng đáng kể nồng độ lipoprotein tỷ trọng cao trong huyết thanh [16]. Tác dụng chống viêm Thành phần polyphenolic như formononetin có nhiều tác dụng sinh học đối với tế bào, được cho là đóng góp vào tác dụng chống viêm [16].
Ryu và cộng sự [27] báo cáo rằng dịch chiết Hoàng Kỳ thể hiển tác dụng chống viêm ở chuột túi khí zymosan bằng cách giảm sự biểu hiện của iNOS, COX-2, IL-6, IL- 1β và yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α) cũng như bằng cách hạn chế sản xuất nitric oxyd. Tác dụng kháng khuẩn Hoàng Kỳ có tác dụng kháng khuẩn với trực khuẩn lỵ Shigella, liên cầu khuẩn dung huyết, phế cầu, tụ cầu vàng [5]. Tác dụng chống oxy hóa Flavonoid là chất chống oxy hóa hoạt động chính và thể hiện hoạt động đáng kể chống lại superoxide anion [7]. Jiangwei và cộng sự [23] đề nghị rằng việc dùng dịch chiết của loài cây Hoàng Kỳ có thể cải thiện cấu hình lipid, ức chế quá trình peroxy hóa, và tăng hoạt động của chất chống oxy hóa các enzym và do đó có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch vành liên quan đến tăng lipid máu và ứng suất oxy hóa.
Tác dụng kích thích phát triển cơ thể Trong nuôi cấy tế bào in vitro, Hoàng Kỳ làm tế bào sinh trưởng nhanh hơn, với lựơng tế bào hoạt động tăng lên nhiều, tuổi thọ tế bào kéo dài hơn. Thụt nước sắc Hoàng Kỳ vào hậu môn chuột nhắt tráng 3 tuần liên tiếp, chuột khỏe lên nhiều, Hoàng Kỳ làm tăng AMPv và GMPv trong tế bào [5]. Tác dụng giãn mạch hạ huyết áp Tiêm dịch chiết Hoàng Kỳ vào tĩnh mạch thỏ không gây mê thấy giãn mạch và hạ huyết áp kéo dài. Do giãn mạch tim, mạch thận nên máu qua thận nhiều hơn dẫn đến tác dụng lợi niệu [5].
Độc tính Độc tính cấp thấp, cho chuột nhắt trắng liều 100g/kg, tức gấp 500 lần liều người thường, chuột không chết và không có tác dụng phụ [5]. Công năng, công dụng Bổ khí trung tiêu: dùng đối với trạng thái cơ thể suy nhược, chân tay vô lực, yếu hơi, chóng mặt, kém ăn, các bệnh sa giáng tạng phủ, lỵ, tả lâu ngày, băng lậu của phụ nữ. Ích huyết: dùng đối với các bệnh huyết hư, thiếu máu, đặc biệt thiếu máu sau bệnh sốt rét, hoặc mất máu nhiều. Cố biểu, liễm hãn: dùng chữa các bệnh ra nhiều mồ hôi, mồ hôi trộm.
Lợi niệu tiêu phù thũng: dùng khi tỳ hư, chuyển hóa nước kém, mặt mắt phù thũng. Giải độc trừ mủ: dùng trong bệnh mụn nhọt. Trừ tiêu khát, sinh tân: dùng trong bệnh đái tháo đường [4]. Chất Astragaloside IV Hình 1.
Công thức cấu tạo của AS IV AS IV có công thức phân tử là C₄₁H₆₈O₁₄, tên khoa học là 3-O-beta-D-xylopyranosyl-6- O-beta-D-glucopyranosyl-cycloastragenol [13], [26]. Tính chất vật lí AS IV có trọng lượng phân tử 784,97, [α] = +22.0°, nhiệt độ nóng chảy 299 - 300°C [31]. AS IV là 1 saponin triterpen 4 vòng, thuộc nhóm lanostan với nhóm phụ là cycloartan, là chất có độ phân cực cao [1], [13].