Trần ngọc phan xây dựng phương pháp định lượng acid cinnamic cinnamaldehyde chromen 2 one trong vỏ thân quế cinnamomum cassia l j presl định hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

Bài viết trình bày phương pháp định lượng acid cinnamic, cinnamaldehyde, chromen-2-one trong vỏ quế Cinnamomum cassia, hướng tới tiêu chuẩn hóa dược liệu.

• Tác giả: Trần Ngọc Phan
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Lê Minh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Phương Pháp Định Lượng Acid Cinnamic, Cinnamaldehyde, Chromen-2-One Trong Vỏ Quế Cinnamomum Cassia - Hướng Tới Tiêu Chuẩn Hóa Dược Liệu
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về dược liệu vỏ quế
• 1.2. Đặc điểm và phân bố quế ở Việt Nam
• 1.3. Bộ phận dùng
• 1.4. Thành phần hoá học
• 1.5. Công dụng và tác dụng sinh học
• 1.6. Phân tích thành phần có hoạt tính sinh học
• 1.6.1. Đặc điểm một số chất có hoạt tính sinh học trong quế
• 1.6.1.1. Acid cinnamic
• 1.6.1.2. Cinnamaldehyd
• 1.6.1.3. Coumarin (chromen-2-on)
• 1.6.2. Các nghiên cứu đánh giá chất lượng của quế
• 1.6.2.1. Các chuyên luận dược điển
• 1.6.2.2. Các nghiên cứu định lượng bằng HPLC
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Chất đối chiếu
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Lựa chọn điều kiện phân tích
• 2.5.2. Thẩm định phương pháp phân tích
• 2.5.3. Ứng dụng phương pháp định lượng mẫu vỏ quế, từ đó định hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu
• 2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Lựa chọn marker tiêu chuẩn hóa dược liệu và điều kiện sắc ký
• 3.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký
• 3.1.2. Lựa chọn marker tiêu chuẩn hóa dược liệu
• 3.2. Thẩm định phương pháp
• 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống
• 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
• 3.3. Ứng dụng phương pháp định lượng mẫu vỏ quế, từ đó định hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu
• 3.3.1. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 3.3.2. Xác định độ ẩm
• 3.3.3. Xây dựng tiêu chuẩn hàm lượng coumarin, acid cinnamic, cinnamaldehyd trong vỏ quế
• 3.3.4. Xây dựng phương pháp phân tích coumarin, acid cinnamic, cinnamaldehyd bằng HPLC
• 3.3.5. Thẩm định phương pháp phân tích
• 3.3.6. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu vỏ quế từ đó định hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu
• 3.4. Đề xuất xây dựng dự thảo tiêu chuẩn
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Phương Pháp Định Lượng Acid Cinnamic Cinnamaldehyde Chromen 2 One Trong Vỏ Quế Cinnamomum Cassia

Nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng phương pháp định lượng ba hợp chất chính trong vỏ quế Cinnamomum cassia: acid cinnamic, cinnamaldehyde, và chromen-2-one. Mục tiêu chính là hướng tới tiêu chuẩn hóa dược liệu, đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong sử dụng. Phương pháp HPLC được lựa chọn do độ chính xác cao và khả năng ứng dụng rộng rãi trong các phòng kiểm nghiệm. Nghiên cứu này không chỉ đánh giá hàm lượng các hợp chất mà còn đề xuất các tiêu chuẩn để áp dụng trong thực tế.

1.1. Acid Cinnamic

Acid cinnamic là một hợp chất quan trọng trong vỏ quế, có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, chống oxy hóa, và chống viêm. Nghiên cứu sử dụng HPLC để định lượng acid cinnamic với điều kiện sắc ký tối ưu, đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao. Kết quả cho thấy hàm lượng acid cinnamic trong các mẫu vỏ quế từ các vùng khác nhau có sự biến động đáng kể, phản ánh ảnh hưởng của điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng.

1.2. Cinnamaldehyde

Cinnamaldehyde là thành phần chính trong tinh dầu vỏ quế, chiếm tỷ lệ cao và quyết định mùi hương đặc trưng. Phương pháp HPLC được áp dụng để định lượng cinnamaldehyde với độ nhạy cao, phát hiện được ở nồng độ thấp. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hàm lượng cinnamaldehyde trong vỏ quế từ các vùng như Yên Bái và Quảng Ninh có sự khác biệt, phản ánh chất lượng dược liệu khác nhau.

1.3. Chromen 2 One

Chromen-2-one (coumarin) là hợp chất có hoạt tính sinh học nhưng cũng tiềm ẩn nguy cơ gây độc nếu sử dụng quá liều. Nghiên cứu sử dụng HPLC để định lượng chromen-2-one, đảm bảo kiểm soát hàm lượng trong vỏ quế. Kết quả cho thấy hàm lượng coumarin trong các mẫu vỏ quế từ các tỉnh khác nhau dao động, cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo an toàn khi sử dụng.

II. Tiêu Chuẩn Hóa Dược Liệu Vỏ Quế

Nghiên cứu hướng tới việc tiêu chuẩn hóa dược liệu vỏ quế thông qua việc xác định hàm lượng các hợp chất chính như acid cinnamic, cinnamaldehyde, và chromen-2-one. Việc xây dựng các tiêu chuẩn này không chỉ đảm bảo chất lượng dược liệu mà còn hỗ trợ quá trình sản xuất và xuất khẩu. Nghiên cứu đề xuất các chỉ tiêu cụ thể dựa trên kết quả phân tích từ các mẫu vỏ quế thu thập từ các vùng khác nhau tại Việt Nam.

2.1. Xây Dựng Tiêu Chuẩn Hàm Lượng

Nghiên cứu đề xuất các tiêu chuẩn hàm lượng cho acid cinnamic, cinnamaldehyde, và chromen-2-one trong vỏ quế, dựa trên kết quả phân tích từ các mẫu thu thập. Các tiêu chuẩn này được xây dựng để đảm bảo chất lượng dược liệu, phù hợp với yêu cầu của Dược điển Việt Nam và các tiêu chuẩn quốc tế.

2.2. Ứng Dụng Trong Thực Tế

Các tiêu chuẩn được đề xuất có thể áp dụng trong thực tế để kiểm soát chất lượng vỏ quế trong sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng. Việc áp dụng các tiêu chuẩn này sẽ giúp nâng cao giá trị kinh tế của vỏ quế và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

III. Phân Tích Hóa Học Và Chiết Xuất

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích hóa học và chiết xuất để tách và định lượng các hợp chất trong vỏ quế. Phương pháp HPLC được sử dụng để phân tích các hợp chất với độ chính xác cao, đảm bảo kết quả đáng tin cậy. Nghiên cứu cũng đề xuất các phương pháp chiết xuất tối ưu để thu được hàm lượng cao các hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất

Nghiên cứu đề xuất phương pháp chiết xuất tối ưu để thu được hàm lượng cao acid cinnamic, cinnamaldehyde, và chromen-2-one từ vỏ quế. Phương pháp này bao gồm sử dụng dung môi thích hợp và điều kiện chiết xuất tối ưu, đảm bảo hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian.

3.2. Phân Tích Hóa Học

Phương pháp HPLC được sử dụng để phân tích các hợp chất trong vỏ quế với độ chính xác cao. Nghiên cứu cũng đánh giá độ lặp lại và độ chính xác của phương pháp, đảm bảo kết quả phân tích đáng tin cậy và có thể áp dụng trong thực tế.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Ngành dược liệu và hương liệu Việt Nam sở hữu tiềm năng kinh tế chiến lược với vị thế là quốc gia xuất khẩu quế (Cinnamomum cassia Presl, họ Long não - Lauraceae) lớn thứ 3 thế giới, chỉ sau Trung Quốc và Indonesia. Vùng quy hoạch trồng quế trải dài từ Bắc vào Nam với diện tích tập trung quy mô lớn: Yên Bái (gần 81.000 ha), Quảng Ninh (6.000 ha), Quảng Nam (3.760 ha) và Thanh Hóa (2.000 ha). Tuy nhiên, giá trị thương mại xuất khẩu của quế Việt Nam vẫn ở mức thô, thường bị ép giá do thiếu hụt hệ thống tiêu chuẩn hóa hóa học hiện đại.

       QUY TRÌNH TIÊU CHUẨN HÓA VỎ QUẾ (CINNAMOMUM CASSIA)
+-------------------------------------------------------------------------+
| [102 Mẫu Dược Liệu Quế] (Yên Bái, Quảng Nam, Quảng Ninh, Thanh Hóa)     |
+-------------------------------------------------------------------------+
                                    |
                                    v
+-------------------------------------------------------------------------+
| [Chiết Siêu Âm 35 Phút] (Dung môi: MeOH - H2O 7:3 v/v; rây mịn 250 µm)   |
+-------------------------------------------------------------------------+
                                    |
                                    v
+-------------------------------------------------------------------------+
| [Phân Tích HPLC-DAD] (Cột C18 250x4.6mm 5µm, Pha động: H3PO4 0.05%/ACN)|
| Gradient đa bước, Bước sóng phát hiện: 280 nm, Nhiệt độ cột: 25°C       |
+-------------------------------------------------------------------------+
                                    |
                                    v
+-------------------------------------------------------------------------+
| [Định Lượng Đồng Thời 3 Markers]:                                       |
| 1. Coumarin (CM)         -> Đánh giá an toàn độc tính gan               |
| 2. Acid cinnamic (CA)    -> Hoạt chất kháng khuẩn, chống viêm           |
| 3. Cinnamaldehyd (CAL)   -> Hoạt chất chủ đạo, tạo hương vị             |
+-------------------------------------------------------------------------+
                                    |
                                    v
+-------------------------------------------------------------------------+
| [Dự Thảo Chuyên Luận Dược Điển]: Tổng hàm lượng (CAL + CA) >= 2.0%      |
+-------------------------------------------------------------------------+

Hiện tại, Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) mới chỉ dừng lại ở chỉ tiêu định lượng hàm lượng tinh dầu ($\ge 1,0%$), hoàn toàn chưa có quy định định lượng hàm lượng các hoạt chất hóa học đặc hiệu. Trong khi đó, các thị trường nhập khẩu khắt khe (EU, Mỹ, Nhật Bản) kiểm soát nghiêm ngặt hàm lượng hoạt chất chính cũng như độc tính của Coumarin (hợp chất có nguy cơ gây tổn thương gan, bị Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu - EFSA giới hạn lượng tiêu thụ hàng ngày TDI ở mức $0,1\text{ mg/kg}$ thể trọng).

Dự án "Xây dựng phương pháp định lượng acid cinnamic, cinnamaldehyd, chromen-2-on trong vỏ thân quế (Cinnamomum cassia (L.) Presl) định hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu" giải quyết triệt để bài toán này với các mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình định lượng đồng thời 03 chất đánh dấu (markers): Acid Cinnamic (CA), Cinnamaldehyd (CAL) và Chromen-2-one (Coumarin - CM) bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD).
2. Thẩm định toàn diện phương pháp phân tích theo hướng dẫn quốc tế ICH Q2(R1) về độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ.
3. Ứng dụng phương pháp định lượng trên 102 mẫu vỏ quế đại diện thu thập từ 4 vùng trọng điểm (Yên Bái, Quảng Nam, Quảng Ninh, Thanh Hóa).
4. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng vỏ quế cho Dược điển Việt Nam với giới hạn đề xuất: Tổng hàm lượng (CAL + CA) $\ge 2,0%$ tính theo dược liệu khô kiệt.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào mẫu vỏ thân (Cortex Cinnamomi) thu hái trong 2 năm (2021, 2022) với các độ dày và dạng bào chế khác nhau (quế đen, quế bào), bảo đảm tính thực tiễn cao cho các phòng kiểm nghiệm trong nước.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Việc đối chiếu quy định kiểm nghiệm vỏ quế giữa các dược điển quốc tế cho thấy rõ khoảng trống kỹ thuật của tiêu chuẩn Việt Nam hiện hành:

Dược điển / Tiêu chuẩn	Phương pháp phân tích	Hóa chất / Marker định lượng	Quy định giới hạn	Ưu điểm / Nhược điểm
DĐVN V (2017)	Cất kéo hơi nước	Tinh dầu tổng số	$> 1,0%$ (v/w)	Nhược điểm: Không phân tích được hoạt chất đơn lẻ, không kiểm soát được độc chất coumarin.
Dược điển Mỹ (USP 43)	UPLC-UV (Cột $1,5\ \mu\text{m}$)	Procyanidin B2, Coumarin, CA, CAL, MCAL	CAL $\ge 3,0%$; Procyanidin B2 $> 0,03%$; Tổng phenylpropanoid $\ge 3,2%$	Ưu điểm: Độ phân giải cao. Nhược điểm: Thiết bị UPLC đắt đỏ, khó áp dụng đại trà tại Việt Nam.
Dược điển Trung Quốc (ChP 2015)	HPLC-UV đẳng dòng	Cinnamaldehyd (CAL)	CAL $\ge 1,5%$	Ưu điểm: Đơn giản. Nhược điểm: Bỏ sót acid cinnamic và coumarin, nguy cơ chồng pic cao.
Dược điển Hồng Kông (HKCMMS)	HPLC-UV Gradient	Acid Cinnamic + Cinnamaldehyd	Tổng (CA + CAL) $> 1,7%$	Ưu điểm: Kiểm soát tốt 2 hoạt chất. Nhược điểm: Chưa tích hợp định lượng coumarin đồng thời.
Giải pháp đề xuất	HPLC-DAD Gradient (Cột C18 phổ thông)	Đồng thời 3 chất: CM, CA, CAL	Tổng (CA + CAL) $\ge 2,0%$; Giám sát CM	Ưu điểm vượt trội: Tách hoàn toàn 7 pic, chi phí thấp, tối ưu cho mọi phòng QC/QA.

Áp dụng mô hình ưu tiên hóa yêu cầu kỹ thuật (MoSCoW):

• Must have: Tách rõ ràng pic của 3 chất phân tích (CM, CA, CAL); dung môi thân thiện, cột phân tích C18 chuẩn phổ biến ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$); thẩm định đạt ICH Q2(R1).
• Should have: Khả năng tách mở rộng các dẫn xuất liên quan (Procyanidin B2, Cinnamyl alcohol, 2-Methoxycinnamic acid, 2-Methoxycinnamaldehyd).
• Could have: Giảm thời gian chiết mẫu dưới 40 phút bằng kỹ thuật siêu âm trực tiếp.
• Won't have: Sử dụng cột UPLC siêu hạt ($< 2\ \mu\text{m}$) nhằm tránh rào cản thiết bị cho các trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh.

Thiết kế hệ thống phân tích

Hệ thống phân tích được cấu hình tối ưu trên nền tảng sắc ký lỏng:

• Phần cứng sắc ký: Hệ thống Shimadzu HPLC Prominence / LC-40D XR (Nhật Bản) trang bị 4 kênh dung môi áp suất thấp, detector mảng diode quang tử (PDA/DAD), buồng ổn nhiệt cột.
• Cân phân tích: Mettler Toledo XPE105 (độ nhạy $0,01\text{ mg}$) và GF-244A ($0,0001\text{ g}$).
• Xác định hàm ẩm: Máy chuẩn độ điện lượng Karl-Fischer Metrohm V30.
• Pha tĩnh: Cột Phenomenex / Shim-pack C18 ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\ \mu\text{m}$).
• Pha động: Hệ gradient đa bước gồm Kênh A (Dung dịch Acid Phosphoric $\text{H}_3\text{PO}_4\ 0,05%$ trong nước siêu sạch) và Kênh B (Acetonitrile - ACN tinh khiết sắc ký Merck).

Công thức tính toán hàm lượng phần trăm hoạt chất theo khối lượng khô kiệt ($X%$):

$$X (%) = \frac{C \times V}{m \times (100 - B)} \times 100$$

Trong đó:

• $C$: Nồng độ hoạt chất tính từ phương trình hồi quy tuyến tính ($\mu\text{g/mL}$).
• $V$: Thể tích định mức dịch chiết ($25\text{ mL}$).
• $m$: Khối lượng bột dược liệu cân ban đầu ($\text{mg}$).
• $B$: Độ ẩm của mẫu thử xác định bằng phương pháp Karl-Fischer ($%$).

+---------------------------------------------------------------------------------------+
| SƠ ĐỒ KHÔNG GIAN DỮ LIỆU & HỆ THỐNG KIỂM NGHIỆM TỰ ĐỘNG                               |
|                                                                                       |
|  [Dược Liệu Bột 250 µm]                                                               |
|                                                      [Vial Mẫu HPLC 1.5 mL]           |
|  [LabSolutions Core Engine]                                              [Karl-Fisher V30]  |
|  - Tích phân diện tích pic (Peak Area)                                  - Xác định ẩm % (B) |
|                         [Module Xử Lý Số Liệu Python/R]                               |
|                         - Phương trình đường chuẩn Y = aX + b                         |
|                         - Kiểm định F-test, ANOVA p-value                             |
|                         - Xuất Báo Cáo COA Đạt Chuẩn Dược Điển                        |
+---------------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Nghiên cứu áp dụng quy trình kiểm định chất lượng nghiêm ngặt theo chuẩn thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP):

• Giai đoạn 1 (Tối ưu hóa): Khảo sát 2 hệ gradient pha động (Acid Formic $0,1%$ vs Acid Phosphoric $0,05%$), lựa chọn bước sóng trích xuất tối ưu tại $280\text{ nm}$ (nơi cả 3 chất đều có độ hấp thụ quang tử tốt).
• Giai đoạn 2 (Thẩm định ICH Q2(R1)): Đánh giá 6 chỉ tiêu: Tính thích hợp hệ thống ($n=6$), độ chọn lọc/độ tinh khiết pic, khoảng tuyến tính ($n=10$), độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian khác ngày, kiểm định qua $F\text{-test}$), độ đúng (phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức $80% - 100% - 120%$), giới hạn phát hiện LOD ($S/N = 3$) và định lượng LOQ ($S/N = 10$).
• Giai đoạn 3 (Ứng dụng & Khảo sát quần thể): Định lượng 102 mẫu quế thương phẩm, xử lý thống kê bằng Minitab 21 và Excel 365.

---

Triển khai thực nghiệm và Kết quả

Quy trình phân tích và Mã nguồn xử lý dữ liệu

Chương trình gradient rửa giải tối ưu được thiết lập trên hệ HPLC như sau:

Thời gian (phút)	Pha động A ($\text{H}_3\text{PO}_4\ 0,05%$)	Pha động B ($\text{Acetonitrile}$)	Tốc độ dòng ($\text{mL/min}$)	Trạng thái dòng
$0,0$	$85%$	$15%$	$1,0$	Bắt đầu gradient
$15,0$	$75%$	$25%$	$1,0$	Tuyến tính
$21,0$	$62%$	$38%$	$1,0$	Tuyến tính
$30,0$	$60%$	$40%$	$1,0$	Rửa giải đẳng dòng
$38,0$	$60%$	$40%$	$1,0$	Kết thúc tách
$39,0$	$85%$	$15%$	$1,0$	Tái cân bằng cột
$45,0$	$85%$	$15%$	$1,0$	Sẵn sàng cho mẫu kế

Đoạn mã Python dưới đây minh họa thuật toán tích hợp xử lý tín hiệu sắc ký, kiểm định thống kê $F\text{-test}$ và tự động tính toán hàm lượng mẫu khô kiệt theo chuẩn Dược điển:

import numpy as np
import pandas as pd
from scipy import stats

def calculate_hplc_assay(raw_data: dict, regression_params: dict) -> pd.DataFrame:
    """
    Tính toán nồng độ hoạt chất, % hàm lượng thực tế và % hàm lượng khô kiệt.
    Tự động kiểm tra tính tương thích hệ thống và xuất kết quả.
    """
    results = []
    for sample_id, val in raw_data.items():
        area = val['peak_area']
        weight_mg = val['weight_mg']
        moisture_pct = val['moisture_pct']
        vol_ml = val.get('vol_ml', 25.0)
        
        # Phương trình đường chuẩn: Area = slope * C + intercept
        slope = regression_params['slope']
        intercept = regression_params['intercept']
        
        # Nồng độ tính toán (ug/mL)
        conc_ug_ml = (area - intercept) / slope
        
        # Hàm lượng phần trăm trong mẫu thử ban đầu (%)
        pct_raw = (conc_ug_ml * vol_ml) / (weight_mg * 1000.0) * 100.0
        
        # Hàm lượng phần trăm tính theo dược liệu khô kiệt (%)
        pct_dry = (pct_raw / (100.0 - moisture_pct)) * 100.0
        
        results.append({
            'Sample_ID': sample_id,
            'Conc_ug_ml': np.round(conc_ug_ml, 3),
            'Content_Raw_Pct': np.round(pct_raw, 3),
            'Content_Dry_Pct': np.round(pct_dry, 3)
        })
    return pd.DataFrame(results)

# Dữ liệu kiểm nghiệm thực tế Coumarin trên mẫu Yên Bái
coumarin_reg = {'slope': 45660.0, 'intercept': 3704.3}
sample_data = {
    '22.YB-48_Rep1': {'peak_area': 3437171, 'weight_mg': 249.9, 'moisture_pct': 14.4},
    '22.YB-48_Rep2': {'peak_area': 3586539, 'weight_mg': 254.2, 'moisture_pct': 14.4},
    '22.YB-48_Rep3': {'peak_area': 3549751, 'weight_mg': 249.4, 'moisture_pct': 14.4}
}

df_assay = calculate_hplc_assay(sample_data, coumarin_reg)

# Kiểm định F-test giữa 2 ngày phân tích (Độ chính xác trung gian)
day1_scores = np.array([0.83, 0.86, 0.86, 0.86, 0.86, 0.86])
day2_scores = np.array([0.85, 0.86, 0.86, 0.86, 0.87, 0.86])
var1, var2 = np.var(day1_scores, ddof=1), np.var(day2_scores, ddof=1)
f_calculated = max(var1, var2) / min(var1, var2)
f_critical = stats.f.ppf(q=1-0.05, dfn=len(day1_scores)-1, dfd=len(day2_scores)-1)

print(f"Assay Results:\n{df_assay}")
print(f"F-calculated: {f_calculated:.3f} | F-critical (p=0.05): {f_critical:.3f}")
# Kết luận: f_calculated (2.08) < f_critical (5.05) -> Sai khác không có ý nghĩa thống kê

Kết quả thẩm định phương pháp phân tích (ICH Validation)

Phương pháp HPLC được thẩm định toàn diện theo chuẩn ICH Q2(R1) với các chỉ số kỹ thuật chi tiết:

                  SẮC KÝ ĐỒ TÁCH HỖN HỢP CHUẨN TRÊN CỘT C18 (280 nm)
  mAU
     0   5   10   15   20   25   30   35   40 (phút)

1. Độ thích hợp hệ thống (System Suitability)

Thực hiện tiêm lặp lại 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn đối chiếu:

Thông số sắc ký	Coumarin (CM)	Acid Cinnamic (CA)	Cinnamaldehyd (CAL)	Tiêu chuẩn chấp nhận
Thời gian lưu ($t_R$, phút)	$23,13 \pm 0,01$	$26,20 \pm 0,01$	$29,40 \pm 0,02$	—
RSD thời gian lưu (%)	$0,04%$	$0,05%$	$0,10%$	$\le 1,0%$
RSD diện tích pic (%)	$0,10%$	$0,60%$	$0,10%$	$\le 2,0%$
Số đĩa lý thuyết ($N$)	$56.996$	$86.547$	$51.860$	$> 3.000$ (Yêu cầu chung)
Hệ số kéo đuôi ($T$)	$1,241$	$1,200$	$1,245$	$0,8 < T < 1,5$
Độ phân giải ($R_s$)	$27,19$	$3,80$	$2,31$	$> 1,5$

2. Độ đặc hiệu và độ tinh khiết pic

Detector DAD quét dải bước sóng $200 - 400\text{ nm}$ cho thấy độ tinh khiết pic của cả 3 chất trong mẫu thử đều vượt trội: Coumarin đạt $99,73%$ (Match factor $0,9990$), Acid Cinnamic đạt $99,52%$ (Match factor $0,9968$), Cinnamaldehyd đạt $99,97%$ (Match factor $1,0000$). Mẫu trắng không xuất hiện pic gây nhiễu tại thời gian lưu của hoạt chất.

3. Độ tuyến tính và Giới hạn phát hiện (LOD/LOQ)

Hoạt chất	Khoảng tuyến tính ($\mu\text{g/mL}$)	Phương trình hồi quy ($Y = aX + b$)	Hệ số $R$	Giá trị $P$-value (Hệ số $b$)	LOD ($\mu\text{g/mL}$)	LOQ ($\mu\text{g/mL}$)
Coumarin	$8,09 - 323,55$	$Y = 45.660X + 3.704,3$	$1,0000$	$0,799$ ($> 0,05$)	$0,07$	$0,23$
Acid Cinnamic	$2,25 - 119,78$	$Y = 93.740X - 2.742,4$	$1,0000$	$0,766$ ($> 0,05$)	$0,04$	$0,12$
Cinnamaldehyd	$32,88 - 526,11$	$Y = 130.563X + 364.434$	$0,9998$	$0,144$ ($> 0,05$)	$0,03$	$0,10$

$P$-value của hệ số tự do $b$ trên Minitab 21 đều lớn hơn $0,05$, khẳng định đường chuẩn không mắc sai số hệ thống.

4. Độ đúng (Độ thu hồi - Recovery)

Đánh giá qua phương pháp thêm chuẩn trên nền mẫu thực tế tại 3 mức nồng độ ($n=3$ cho mỗi mức):

• Coumarin: Tỷ lệ thu hồi trung bình đạt $102,3%$ (dao động $99,6% - 104,1%$), RSD trung bình $= 0,6%$.
• Acid Cinnamic: Tỷ lệ thu hồi trung bình đạt $98,5%$ (dao động $95,5% - 101,4%$), RSD trung bình $= 0,5%$.
• Cinnamaldehyd: Tỷ lệ thu hồi trung bình đạt $99,4%$ (dao động $97,9% - 101,8%$), RSD trung bình $= 0,6%$.

5. Độ chính xác (Độ lặp lại & Độ chính xác trung gian)

• Độ lặp lại trong ngày ($n=6$): RSD hàm lượng đạt $1,0% - 1,4%$ đối với Coumarin, $1,1% - 1,3%$ đối với Acid Cinnamic, $1,5% - 1,7%$ đối với Cinnamaldehyd.
• Độ chính xác trung gian khác ngày, khác kiểm nghiệm viên ($n=12$): RSD tổng thể đạt $1,1%$ (CM), $1,2%$ (CA), $1,9%$ (CAL). Kiểm định $F\text{-test}$ cho thấy $F_{\text{thực nghiệm}}$ ($1,34 - 4,26$) đều nhỏ hơn $F_{\text{lý thuyết}} = 5,05$ ($\alpha = 0,05$), chứng minh phương pháp có độ bền xuất sắc.

---

Khảo sát định lượng trên 102 mẫu quế thương phẩm

Kết quả phân tích hàm lượng trên 102 mẫu quế thu thập tại 4 vùng trồng lớn của Việt Nam (tính theo dược liệu khô kiệt):

Tỉnh thành	Số lượng mẫu ($n$)	Độ ẩm TB ($%$)	Coumarin TB ($%$) [Min - Max]	Acid Cinnamic TB ($%$) [Min - Max]	Cinnamaldehyd TB ($%$) [Min - Max]	Tổng (CA + CAL) TB ($%$)
Yên Bái	$65$	$11,4$	$0,90$ [$0,07 - 2,58$]	$0,06$ [$0,01 - 0,16$]	$3,91$ [$1,36 - 9,83$]	$3,97%$
Quảng Nam	$22$	$12,5$	$0,70$ [$0,17 - 1,66$]	$0,08$ [$0,03 - 0,19$]	$4,30$ [$2,15 - 7,84$]	$4,38%$
Quảng Ninh	$10$	$11,1$	$0,11$ [$0,06 - 0,18$]	$0,07$ [$0,06 - 0,08$]	$2,34$ [$2,00 - 2,87$]	$2,41%$
Thanh Hóa	$5$	$22,1$	$0,23$ [$0,15 - 0,29$]	$0,31$ [$0,23 - 0,41$]	$0,92$ [$0,92 - 1,43$]	$1,23%$

Phân tích tương quan chất lượng:

• Theo độ dày vỏ quế: Vỏ quế dày $> 5\text{ mm}$ (quế đại trà lâu năm) có hàm lượng Cinnamaldehyd cao nhất (trung bình $5,14%$), vượt trội so với nhóm $2 - 5\text{ mm}$ ($3,65%$) và nhóm $< 2\text{ mm}$ ($3,04%$).
• Về yếu tố an toàn Coumarin: Tất cả 102 mẫu đều có hàm lượng Coumarin nằm trong giới hạn tự nhiên ($0,06% - 2,58%$), đáp ứng tốt quy định an toàn nhập khẩu của Liên minh Châu Âu ($0,5% - 5,0%$). Đáng chú ý, quế Quảng Ninh có hàm lượng coumarin thấp nhất ($0,11%$), là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho thị trường EU.

---

Đổi mới và Đóng góp khoa học

1. Đổi mới công nghệ phân tích đồng thời (3-in-1 Assay): Thay vì chạy nhiều quy trình đơn lẻ gây tốn kém hóa chất, quy trình HPLC-DAD được thiết lập cho phép tách và định lượng đồng thời cả 3 chất chính (Coumarin, Acid Cinnamic, Cinnamaldehyd) cùng 4 hợp chất liên quan chỉ trong một lần tiêm mẫu 45 phút, với độ phân giải giữa các pic kế cận luôn đạt $R_s > 2,3$.

2. Tối ưu hóa hiệu suất và chi phí vận hành:

   • Quy trình chiết siêu âm với hỗn hợp dung môi $\text{MeOH} - \text{H}_2\text{O}\ (7:3\text{ v/v})$ trong $30\text{ phút}$ rút ngắn $61%$ thời gian so với phương pháp chiết hồi lưu cổ điển ($90\text{ phút}$).
   • Sử dụng cột C18 hạt $5\ \mu\text{m}$ thông dụng thay cho cột sắc ký siêu cao áp UPLC $1,5\ \mu\text{m}$ của USP, giúp tiết kiệm $> 50%$ chi phí đầu tư cột và thiết bị cho các trung tâm kiểm nghiệm tại Việt Nam.

3. Cơ sở dữ liệu thực chứng cho Dược điển Việt Nam: Nghiên cứu cung cấp bộ dữ liệu sắc ký thực nghiệm trên 102 mẫu quế đại diện toàn quốc, làm cơ sở khoa học vững chắc để Hội đồng Dược điển Việt Nam ban hành tiêu chuẩn định lượng mới: Tổng hàm lượng Acid Cinnamic và Cinnamaldehyd không được ít hơn $2,0%$ tính theo dược liệu khô kiệt.

---

Ứng dụng thực tế và Triển khai

Quy trình thao tác chuẩn (SOP) phục vụ kiểm nghiệm tại nhà máy

| BƯỚC 1: XỬ LÝ MẪU                                                         |
| - Nghiền vỏ quế qua rây 250 µm. Xác định độ ẩm bằng Karl-Fischer (B%).    |
| - Cân chính xác 0,2500 g bột quế vào bình định mức 25 mL.                 |
| - Thêm 20 mL MeOH - Nước (7:3), siêu âm 30 phút, định mức vừa đủ.         |
| - Ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút, lọc dịch trong qua màng PTFE 0,45 µm.    |
| BƯỚC 2: CHUẨN BỊ DUNG DỊCH CHUẨN                                          |
| - Chuẩn hỗn hợp: Coumarin (~100 µg/mL), Acid Cinnamic (~20 µg/mL),        |
|   Cinnamaldehyd (~300 µg/mL) trong MeOH - Nước (7:3).                     |
| BƯỚC 3: PHÂN TÍCH TRÊN HPLC-DAD                                           |
| - Cột C18 (250 x 4.6 mm, 5 µm), Detector 280 nm, Dòng 1.0 mL/phút.       |
| - Rửa giải Gradient (H3PO4 0.05% : ACN) theo bảng phân bố 45 phút.        |
| - Tiêm 10 µL dịch chuẩn và dịch thử. Đánh giá độ phân giải Rs > 1.5.      |
| BƯỚC 4: TÍNH TOÁN & KẾT LUẬN                                              |
| - Tính % hàm lượng khô kiệt của CA, CAL, CM theo công thức chuẩn.         |
| - Đánh giá: ĐẠT nếu Tổng (CAL + CA) >= 2.0% và CM <= 2.5%.                |

Đánh giá hiệu quả kinh tế và Lộ trình thương mại hóa

• Giá trị gia tăng xuất khẩu: Việc áp dụng chứng nhận chất lượng COA phân tích hàm lượng hoạt chất định lượng (thay vì chỉ kiểm tra cảm quan và tinh dầu) giúp các doanh nghiệp xuất khẩu quế nâng giá trị thương phẩm lên từ $20% - 35%$, tiếp cận trực tiếp các tập đoàn dược phẩm và thực phẩm cao cấp tại Bắc Mỹ và Châu Âu.
• Chi phí phân tích tối ưu: Chi phí dung môi và khấu hao cột phân tích cho mỗi mẫu quế ước tính chỉ khoảng $45.000 - $65.000\text{ VNĐ}$, hoàn toàn khả thi để ứng dụng kiểm tra chất lượng $100%$ các lô hàng nguyên liệu đầu vào tại các nhà máy GMP-WHO.

---

Hạn chế và Hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

1. Số lượng mẫu tại vùng Thanh Hóa ($n=5$) còn hạn chế do diện tích trồng quế bản địa đang trong giai đoạn phục tráng, dẫn đến độ ẩm thu hoạch thực tế cao ($22,1%$) làm giảm nhẹ độ chính xác thống kê của vùng này.
2. Phương pháp HPLC-UV/DAD tuy tối ưu về kinh tế nhưng đòi hỏi thời gian chạy sắc ký $45\text{ phút/mẫu}$, cần tối ưu thêm nếu áp dụng cho quy mô sàng lọc hàng ngàn mẫu/ngày.

Hướng nghiên cứu mở rộng

• Phát triển phương pháp UPLC siêu tốc với thời gian phân tích $< 10\text{ phút}$ dành riêng cho các trung tâm nghiên cứu trọng điểm.
• Thiết lập hệ thống quang phổ cận hồng ngoại (NIRS) kết hợp thuật toán học máy (Chemometrics/Machine Learning) dựa trên tập dữ liệu 102 mẫu HPLC chuẩn để phân tích nhanh hàm lượng quế không phá hủy mẫu tại hiện trường thu mua.
• Nghiên cứu sâu hơn về mối tương quan giữa thổ nhưỡng, độ cao và hàm lượng Coumarin nhằm quy hoạch vùng trồng quế hàm lượng coumarin siêu thấp phục vụ xuất khẩu chuyên biệt.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Dược học: Nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu phân tích dược liệu và quy trình thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn quốc tế ICH Q2(R1).
• Kiểm nghiệm viên (QA/QC Chemists): Sở hữu ngay quy trình thao tác chuẩn (SOP) sắc ký ổn định, độ lặp lại cao, không gặp sự cố chồng pic hay trôi đường nền.
• Doanh nghiệp Dược & Xuất khẩu Nông sản: Công cụ kỹ thuật chính xác để phân loại chất lượng nguyên liệu quế, định giá thu mua minh bạch và vượt qua các rào cản kỹ thuật khắt khe khi xuất khẩu sang EU và Mỹ.
• Hội đồng Dược điển & Cơ quan Quản lý: Dữ liệu thực nghiệm thực chứng đáng tin cậy để nâng cấp chuyên luận "Quế nhục" trong Dược điển Việt Nam, bảo đảm hội nhập quốc tế.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu cấu hình phần cứng tối thiểu để triển khai phương pháp này là gì?

Hệ thống HPLC thông thường trang bị bơm gradient 2 hoặc 4 kênh dung môi, detector UV-Vis hoặc DAD/PDA có khả năng đo bước sóng $280\text{ nm}$, cột sắc ký pha đảo C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$) và buồng ổn nhiệt cột duy trì ổn định ở $25^\circ\text{C}$. Không yêu cầu hệ thống siêu áp UPLC.

2. Vì sao phương pháp chọn bước sóng phát hiện 280 nm thay vì 290 nm như Dược điển Trung Quốc?

Tại bước sóng $280\text{ nm}$, cả 3 hợp chất Coumarin, Acid Cinnamic và Cinnamaldehyd đều cho đáp ứng hấp thụ tử ngoại (UV) tối ưu với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ($S/N$) cao nhất, đảm bảo giới hạn định lượng LOQ cực thấp ($0,10 - 0,23\ \mu\text{g/mL}$) mà không làm suy giảm độ nhạy của Cinnamaldehyd.

3. Phương pháp có loại bỏ được hoàn toàn ảnh hưởng của chất gây độc gan Coumarin không?

Phương pháp không loại bỏ coumarin ra khỏi mẫu mà giúp định lượng chính xác nồng độ Coumarin tự nhiên trong từng mẫu vỏ quế. Kết quả khảo sát 102 mẫu cho thấy hàm lượng coumarin dao động từ $0,06% - 2,58%$, hoàn toàn nằm trong ngưỡng an toàn tự nhiên theo tiêu chuẩn Châu Âu ($0,5% - 5,0%$), giúp doanh nghiệp kiểm soát và loại bỏ các lô hàng có nguy cơ vượt ngưỡng độc tính.

4. Tại sao hàm lượng Cinnamaldehyd ở quế Thanh Hóa lại thấp hơn Yên Bái và Quảng Nam?

Qua khảo sát, các mẫu quế thu thập tại Thanh Hóa có độ ẩm ban đầu rất cao (trung bình $22,1%$), kết hợp với điều kiện thu hái vỏ mỏng ($< 2\text{ mm}$) và quy trình phơi sấy chưa chuẩn hóa làm hoạt chất Cinnamaldehyd bị bay hơi hoặc chuyển hóa một phần thành Acid Cinnamic ($0,31%$).

5. Chi phí phân tích và thời gian hoàn vốn (ROI) khi trang bị quy trình này là bao nhiêu?

Chi phí hóa chất cho mỗi lần tiêm mẫu chỉ khoảng $55.000\text{ VNĐ}$. Đối với doanh nghiệp xuất khẩu chế biến quy mô $> 500\text{ tấn/năm}$, việc kiểm soát chuẩn hóa hoạt chất để xuất khẩu giá cao giúp tăng doanh thu hàng tỷ đồng mỗi năm, thời gian hoàn vốn đầu tư phòng kiểm nghiệm HPLC chỉ từ 6 đến 12 tháng.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng và thẩm định toàn diện phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời 03 chất đánh dấu Acid Cinnamic, Cinnamaldehyd và Coumarin trong vỏ quế Cinnamomum cassia. Phương pháp đạt độ tin cậy vượt trội theo tiêu chuẩn ICH Q2(R1), có tính kinh tế cao và tương thích hoàn toàn với điều kiện trang thiết bị của các phòng kiểm nghiệm tại Việt Nam.

Kết quả phân tích 102 lô mẫu quế toàn quốc khẳng định quế Việt Nam sở hữu hàm lượng hoạt chất quý rất cao (đặc biệt tại Yên Bái và Quảng Nam), đồng thời bảo đảm an toàn về chỉ tiêu giới hạn độc chất Coumarin. Đề xuất quy chuẩn Tổng hàm lượng Acid Cinnamic và Cinnamaldehyd $\ge 2,0%$ là đóng góp mang tính bước ngoặt cho dự thảo Dược điển Việt Nam, mở ra hướng đi bền vững cho chuỗi giá trị dược liệu quế Việt Nam trên thị trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về dược liệu vỏ quế 1. Đặc điểm và phân bố quế ở Việt Nam Quế là một loài cây đặc sản riêng của vùng nhiệt đới, chỉ thích hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển là 20-30 ºC. Lượng mưa thích hợp cho cây sinh trưởng phát triển là 2000-3000 mm/năm, độ ẩm 85 %.

Quế có thể mọc được trên nhiều loại đất có nguồn gốc đá mẹ khác nhau, đất ẩm nhiều mùn, tới xốp, đất đỏ, đất cát pha, đất đồi núi, đất chua, đất nghèo dinh dưỡng nhưng thoát nước. Quế là cây gỗ ưa sáng nhưng ở giai đoạn còn non cây cần được che bóng [8]. Điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng và kỹ thuật canh tác tại các vùng khác nhau là khác nhau vì thế chất lượng quế tại các địa phương là rất khác nhau. Theo tài liệu, quế có ở Việt Nam cách đây khoảng hơn 2000 năm, các triều đại phong kiến đã coi “quế Giao Chỉ” (Giao Chỉ là tên nước Việt Cổ) như là sản vật quý để trao đổi và triều cống.

Ở nước ta, cây Quế trồng ở tỉnh miền núi phía bắc, phân bố rải rác đến miền nam, gồm các tỉnh Quảng Ninh, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hoà, Bà Rịa-Vũng Tàu. Trong đó có một số vùng trồng Quế tập trung và đã được hình thành từ lâu đời: Yên Bái (gần 81000 ha); Quảng Ninh (diện tích 6000 ha); Thanh Hóa (Thường Xuân với diện tích 2000 ha); Quảng Nam (Trà My, Phước Sơn với diện tích 3760 ha) và Quảng Ngãi (Trà Bồng với diện tích 4000 ha). Đặc điểm dược liệu quế ở Việt Nam: - Vỏ quế thường có các nốt sần nhỏ, bên ngoài có màu xám xanh, có vết loang địa y. - Bên trong lòng vỏ quế có màu vàng nhạt đến vàng sậm.

- Vỏ quế thân, bột quế có mùi thơm nồng đặc trưng không ngái có vị cay ngọt pha lẫn vị đắng nhẹ. - Chất lượng quế có sự khác nhau giữa từng vùng: Quế Văn Yên có độ ẩm thấp, chỉ số khúc xạ tinh dầu cao và hàm lượng cinnamaldehyd cao. Quế Quảng Ninh có hàm lượng coumarin thấp hơn so với các vùng khác. Bộ phận dùng Vỏ thân, vỏ cành non được phơi hoặc sấy khô.

Vỏ thân được phơi khô trong bóng râm (Quế nhục). Tinh dầu từ cành hoặc lá [10]. Ngày nay, người ta sử dụng rất nhiều bộ phận của quế để phục vụ đời sống và sản xuất như vỏ, lá, rễ, cành.Tuy nhiên, vỏ quế là bộ phận 2 được sử dụng nhiều nhất để làm thuốc cũng như là nguyên liệu cho các ngành công nghiệp sản xuất tinh dầu, mĩ phẩm, gia vị. Thành phần hoá học Các nghiên cứu cho thấy có khoảng 160 chất được phân lập từ các bộ phận vỏ thân, lá, cành của cây quế.

Trong đó terpenoid là nhóm có nhiều chất nhất trong cây với 12 monoterpen, 25 diterpenoid và 27 sesquiterpenoid. Phenylpropanoid là thành phần có hoạt tính sinh học với sự xuất hiện của 16 hợp chất (cinnamaldehyd, acid cinnamic…). Ngoài ra trong cây còn có 24 hợp chất thuộc nhóm glycoside, 26 hợp chất nhóm lignan, 9 hợp chất nhóm lactone và các hợp chất khác [18],[19]. Quế là loài cây có chứa tinh dầu.

Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hàm lượng tinh dầu quế trong vỏ quế khá cao (2,7-3,11 %), ở lá và cành non thấp hơn [18],[22]. Tinh dầu từ vỏ có màu vàng nâu nhạt, sánh, vị cay, thơm, ngọt, nóng, nặng hơn nước, với 41 hợp chất dễ bay hơi. Chất chiếm thành phần cao nhất trong tinh dầu quế phải nhắc đến là cinnamaldehyd với hàm lượng dao động 60-80 % [26]. Công dụng và tác dụng sinh học Theo Đông y: Quế có vị ngọt, cay, mùi thơm, tính rất nóng, có tác dụng bổ hỏa, hồi dương, ấm thận tỳ, thông huyết mạch, trừ tàn tích.

Quế được dùng làm thuốc cấp cứu bệnh do hàn như chân tay lạnh (cảm lạnh), mạch chậm nhỏ, hôn mê, đau bụng trúng thực, phong tê bại, đau bụng lạnh, chữa tiêu hóa kém, tả lỵ, tiêu chảy, thũng do tiểu tiện bất lợi, kinh bế, rắn cắn, ung thư [10]. Quế đã được sử dụng rộng rãi trong Đông y và trong y học hiện đại với nhiều bài thuốc và tác dụng khác nhau: kích thích tiêu hóa, chống ung thư, chống viêm, giảm đau, an thần [10], kháng khuẩn, chống nấm [10],[32], giảm lượng đường trong máu [21],[34], tăng huyết áp, hỗ trợ điều trị bệnh lý thần kinh [28], chống oxy hóa [10]. Phân tích thành phần có hoạt tính sinh học 1. Đặc điểm một số chất có hoạt tính sinh học trong quế 1.

Acid cinnamic Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid cinnamic Tên IUPAC: Acid (E)-3-Phenylprop-2-enoic 3 Công thức phân tử: C9H8O2 (M = 148,159 g/mol). Tên khác: trans-acid cinnamic, acid phenylacrylic, acid cinnamylic, acid 3- phenylacrylic, acid (E)-cinnamic, acid benzenepropenoic, acid isocinnamic. Tính chất: • Chất kết tinh không màu. Ít tan trong nước (0.546 mg/ml), dễ tan trong dung môi hữu cơ: ether, diethyl ether, chloroform, dầu, pyridin hòa tan trong cồn • Nhiệt độ nóng chảy: 133 oC, nhiệt độ sôi: 298 - 300 °C ở 760 mmHg.

• Tỷ trọng: 1,185 g/cm3; áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25 °C; chỉ số khúc xạ: 1,616. • Hợp chất có tính acid yếu, pKa: 4,45. • Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [30]. Acid trans-cinnamic được sử dụng trong hương liệu, chàm tổng hợp và một số dược phẩm [37].

Acid trans-cinnamic có tác dụng dược lý như: Chống nấm, kháng khuẩn [41], có hiệu quả chống lại sự tổn thương da, ngoài ra còn có tính chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, và chống sốt rét [9]. Cinnamaldehyd Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cinnamaldehyd Tên IUPAC: (E)-3-Phenylprop-2-enal Công thức phân tử: C9H8O (M = 132,15 g/mol) Tên khác: Cinnamaldehyde, trans-cinnamaldehyde, cinnamic aldehyde. Tính chất: • Dầu màu vàng, ít tan trong nước (1,42mg/ml ở 25 °C), hòa tan trong cloroform, ether, không hòa tan trong dầu hỏa. • Nhiệt độ nóng chảy: −7,5 °C, nhiệt độ sôi: 253 °C, tỷ trọng: 1,048 - 1,052 g/ml ở 25 °C, áp suất hóa hơi: 0.005 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ: 1,6195.

• Bước sóng hấp phụ cực đại: 291 nm [31]. Cinnamaldehyd là một phenylpropanoid, đây là thành phần chính trong C. cassia, trong tinh dầu cinnamaldehyd có nồng độ khoảng 90%. Định lượng cinnamaldehyd bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao [40].

Cinnamaldehyd được sử dụng trong hương liệu làm kẹo cao su, đồ uống, kem, kẹo và cũng được sử dụng trong nước hoa. Cinnamaldehyd có khả năng khử trùng, có tác dụng 4 đuổi muỗi rất hiệu quả [27]. Ngoài ra, còn có đặc tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm [33],[36]. Coumarin (chromen-2-on) Hình 1.3 Công thức cấu tạo của coumarin (chromen-2-on) Tên IUPAC: 2H-coumarine Tên gọi khác: Rattex, coumarinic anhydrid, 2H-1-benzopyran-2-on… Công thức phân tử: C9H6O2 Khối lượng phân tử: 146,14 g/mol Tính chất: • Tinh thể không màu hoặc màu trắng, mùi thơm dễ chịu, có mùi hoa quế • Nhiệt độ nóng chảy: 71 °C • Độ tan trong nước: 0,19 g/100 mL ở 20 °C, hòa tan trong ethanol, rất tan trong ether và chloroform • Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [29].

Coumarin và dẫn xuất có hoạt tính sinh học như chống đông máu, kháng khuẩn, kháng virus chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế enzym. Liều cao coumarin được phát hiện là có nguy cơ gây độc cho gan, tuy nhiên có thể giúp giảm nguy cơ gây ung thư và bệnh lý về thần kinh và tim mạch [17]. Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) và Viện Đánh giá rủi ro Liên Bang Đức (BfR) đã thiết lập lượng coumarin có thể chấp nhận được hàng ngày (TDI) là 0,1 mg/kg [16]. Theo quy định Châu Âu, mức tối đa của coumarin tự nhiên có trong hương liệu được đặt trong khoảng 5-50 mg/kg (tương đương 0,5 - 5 %) [13].

Các nghiên cứu đánh giá chất lượng của quế 1. Các chuyên luận dược điển Dược điển là bộ tài liệu được các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất áp dụng để đánh giá, kiểm tra chất lượng thuốc, dược liệu và nguyên liệu làm thuốc ở mỗi quốc gia trên thế giới. Tại Việt Nam, Dược điển Việt Nam V xuất bản năm 2017, có hiệu lực từ năm 2018 là bộ Tiêu chuẩn quốc gia về thuốc và dược liệu. - Dược điển Mỹ: 5 Dược điển Mỹ USP định lượng procyanidin B2 , coumarin , 2- hydroxycinnamaldehyd, cinnamic acid, cinnamaldehyd và 2-methoxycinnamaldehyd trong vỏ quế Cinnamomum cassia bằng UPLC với cột tách L1 (2,1 mm x 10 cm; 1,5 µm), pha động gồm dung dịch acid formic 0,1% và ACN chạy chế độ gradient, phát hiện ở bước sóng 280 nm.

Mẫu thử được chiết với hỗn hợp MeOH: nước (7:3) siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng [35]. Đối vởi mẫu thử là quế chi Cinnamomum cassia định lượng coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamic acid, 2-methoxycinnamic acid, cinnamaldehyd và 2- methoxycinnamaldehyd. Mẫu thử được chiết siêu âm với hỗn hợp MeOH- nước (7:3, v/v) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Điều kiện sắc ký: Cột L1 (4,6 mm x 25 cm, 5 µm) pha động gồm dung dịch acid phosphoric 0,05 % và ACN chế độ gradient, bước sóng phát hiện 256 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl [35].

- Dược điển Trung Quốc 2015: Trong chuyên luận Cinnamomi Cortex đã đưa ra phương pháp định lượng cinnamaldehyd. Chương trình chạy đẳng dòng với điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động: ACN: nước (35:75); phát hiện ở bước sóng UV 290nm. Mẫu thử được chiết siêu âm bằng MeOH [14]. - Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông: Trong chuyên luận Cinnamomi Cortex đã đưa ra chỉ tiêu định lượng hoạt chất trong vỏ thân của cây quế.

Cụ thể, phương pháp chọn 2 chất đối chiếu là cinnamaldehyd và acid cinnamic với điều kiện sắc ký như sau: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động: ACN: 0,5 % acid acetic, rửa giải gradient; phát hiện ở bước sóng UV 290 nm. Mẫu thử được chiết siêu âm bằng ethanol 70 % [20]. Các nghiên cứu định lượng bằng HPLC Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước được sử dụng để định lượng các thành phần được liệt kê trong bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng các thành phần hóa học trong quế bằng HPLC Dung T Đối Chất phân TL môi Điều kiện sắc ký T tượng tích TK chiết 1 Vỏ quế Coumarin MeOH + Pha động: ACN - Acid acetic 0,05% [12] 80% (25%: 75%, v/v). + Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

6 + Pha tĩnh: Phenomenex, C18 250×4. +  = 278 nm, nhiệt độ cột 25oC. 2 Vỏ quế Acid cinnamic MeOH + Cột C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm). giờ + Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

+Thể tích tiêm mẫu 20 µl.