Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV Bằng Multiplex RT-PCR

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học xây dựng quy trình phát hiện virus zymv zucchini yellow mosaic virus, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Vương Nguyễn Sông Hàng
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Văn Biết
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV Bằng Phương Pháp Multiplex RT-PCR
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Họ Bầu bí (tên khoa học là Cucurbitaceae)
• 1.2. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới
• 1.3. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước
• 1.4. Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí
• 1.5. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
• 1.5.1. Nguồn gốc và phân bố
• 1.5.2. Đặc điểm ZYMV
• 1.5.3. Triệu chứng, tác hại
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cây họ bầu bí Cucurbitaceae
• 2.2. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới
• 2.3. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước
• 2.4. Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Các trình tự primer dùng trong nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Ly trích RNA tổng số
• 3.4.2. Xử lý DNA bằng enzyme DNase I
• 3.4.3. Tổng hợp cDNA với enzyme phiên mã ngược
• 3.4.4. Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phương pháp RT-PCR
• 3.4.5. Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch đại và giải trình tự
• 3.4.6. Thiết kế primer cho chứng nội (internal amplification control - IC)
• 3.4.7. Xây dựng phương pháp Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV
• 3.4.8. Kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR
• 3.4.9. Phát hiện ZYMV và PRSV trên mẫu thực địa bằng Multiplex RT-PCR
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
• 4.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của ZYMV
• 4.3. Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại của ZYMV
• 4.4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của PRSV
• 4.5. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chứng nội (IC)
• 4.6. Kết quả xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV
• 4.7. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR
• 4.8. Kết quả áp dụng quy trình vào phát hiện ZYMV và PRSV trên mẫu thực địa
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) là hai loại virus thuộc chi Potyvirus, gây bệnh nghiêm trọng trên cây họ bầu bí. Chúng không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho nông dân. Việc phát hiện sớm và chính xác hai loại virus này là rất quan trọng để bảo vệ mùa màng. Phương pháp Multiplex RT-PCR đã được phát triển để phát hiện đồng thời cả hai virus trong một phản ứng duy nhất, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

1.1. Virus ZYMV và PRSV Đặc Điểm và Tác Hại

ZYMV và PRSV đều có bộ gen RNA và lây truyền chủ yếu qua rệp. Chúng gây ra các triệu chứng như khảm và đốm trên cây, làm giảm năng suất đến 100%. Việc hiểu rõ về đặc điểm của hai virus này giúp nông dân có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Virus Gây Hại Trên Cây Họ Bầu Bí

Nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí đã chỉ ra rằng ZYMV và PRSV là hai loại virus phổ biến nhất. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng chúng có thể gây ra thiệt hại lớn cho năng suất cây trồng, đặc biệt là ở Việt Nam.

II. Vấn Đề Trong Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Việc phát hiện virus ZYMV và PRSV gặp nhiều thách thức do triệu chứng bệnh tương tự nhau. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác. Phương pháp truyền thống như ELISA thường tốn thời gian và chi phí cao. Do đó, cần có một phương pháp hiệu quả hơn để phát hiện đồng thời cả hai virus.

2.1. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán Virus

Triệu chứng của ZYMV và PRSV rất giống nhau, gây khó khăn trong việc phân biệt. Điều này làm tăng nguy cơ lây lan virus trong các vụ mùa, ảnh hưởng đến năng suất.

2.2. Giới Hạn Của Các Phương Pháp Truyền Thống

Các phương pháp như ELISA và RT-PCR truyền thống thường tốn nhiều thời gian và chi phí. Điều này không phù hợp với nhu cầu phát hiện nhanh chóng trong sản xuất nông nghiệp.

III. Phương Pháp Multiplex RT PCR Để Phát Hiện Virus

Phương pháp Multiplex RT-PCR được phát triển để phát hiện đồng thời virus ZYMV và PRSV trong một phản ứng duy nhất. Phương pháp này sử dụng ba cặp primer để khuếch đại các sản phẩm gen khác nhau, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Nghiên cứu đã chứng minh rằng phương pháp này có độ đặc hiệu cao và có thể áp dụng rộng rãi.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Multiplex RT PCR

Multiplex RT-PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen trong một phản ứng, giúp phát hiện đồng thời nhiều loại virus. Điều này giúp tăng độ chính xác và giảm thời gian xét nghiệm.

3.2. Quy Trình Thực Hiện Multiplex RT PCR

Quy trình thực hiện bao gồm việc chuẩn bị mẫu, thiết kế primer, và thực hiện phản ứng khuếch đại. Các điều kiện tối ưu như nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp cũng được xác định để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR đã được áp dụng thành công để phát hiện virus ZYMV và PRSV từ 63 mẫu thực địa. Kết quả cho thấy 31 mẫu nhiễm virus, trong đó có 5 mẫu nhiễm PRSV, 1 mẫu nhiễm ZYMV và 25 mẫu nhiễm đồng thời cả hai virus. Điều này chứng tỏ tính hiệu quả của phương pháp trong thực tiễn.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Từ Mẫu Thực Địa

Nghiên cứu đã phát hiện 31 mẫu nhiễm virus từ 63 mẫu thực địa, cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh cao. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát hiện sớm để có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

4.2. Tính Đặc Hiệu Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR cho thấy độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện ZYMV và PRSV. Điều này giúp nông dân có thể nhanh chóng xác định tình trạng cây trồng và có biện pháp xử lý kịp thời.

V. Kết Luận Về Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Phát hiện virus ZYMV và PRSV bằng phương pháp Multiplex RT-PCR là một bước tiến quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn chính xác, từ đó giảm thiểu thiệt hại cho nông dân. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và cải tiến phương pháp này để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhiều loại virus khác nhau trong một phản ứng. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và hiệu quả hơn.

5.2. Đề Xuất Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR. Việc áp dụng công nghệ mới cũng có thể giúp nâng cao hiệu quả phát hiện virus trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây trồng thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) bao gồm các loài phổ biến như dưa hấu, dưa chuột, bí đao, bầu, bí ngô, mướp và khổ qua, giữ vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm và dinh dưỡng trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), sản lượng dưa hấu toàn cầu đạt khoảng 100,4 triệu tấn, dưa chuột đạt 87,8 triệu tấn, cùng hàng chục triệu tấn dưa khác và bí các loại. Tại Việt Nam, dưa chuột và các loại bầu bí là nhóm cây trồng kinh tế trọng điểm, được canh tác tập trung tại vùng đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Điển hình tại tỉnh Hà Nam, diện tích gieo trồng dưa chuột đạt khoảng 1.200 ha với năng suất 28–33 tấn/ha, mang lại giá trị sản xuất 250–305 triệu đồng/ha/vụ, cao gấp 5–6 lần so với thâm canh lúa nước; tại Phú Thọ, mô hình trồng 65 ha bí xanh tại xã Văn Lang cũng ghi nhận nguồn thu trên 10 tỷ đồng.

Tuy nhiên, năng suất và phẩm chất cây họ bầu bí chịu đe dọa nghiêm trọng bởi các bệnh do virus gây ra, trong đó tỷ lệ thất thu mùa màng có thể lên đến 100%. Theo Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á (AVRDC), hai tác nhân phổ biến và gây thiệt hại nặng nề nhất là Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) và Papaya ringspot virus (PRSV). Cả hai loại virus này đều thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae, có vật chất di truyền là chuỗi đơn RNA và lan truyền chủ yếu qua các loài rệp muội (Aphididae) hoặc qua hạt giống và vết thương cơ học. Khi xâm nhiễm, ZYMV và PRSV gây ra các triệu chứng biến dạng hình thái tương đồng như lá khảm vàng, phồng rộp, bề mặt sần sùi, méo mó và quả còi cọc, khiến việc chẩn đoán phân biệt bằng mắt thường trên đồng ruộng không thể đạt độ chính xác.

Về mặt chẩn đoán phòng thí nghiệm, phương pháp huyết thanh học ELISA thường gặp hiện tượng phản ứng chéo giữa kháng thể PRSV và ZYMV do tính tương đồng cấu trúc kháng nguyên, dẫn đến kết quả dương tính giả. Phương pháp phiên mã ngược kết hợp phản ứng chuỗi polymerase (RT-PCR) đơn lẻ khắc phục được độ đặc hiệu nhưng đòi hỏi thực hiện các phản ứng riêng biệt cho từng loại virus, làm phát sinh chi phí hóa chất, tốn thời gian và công lao động khi áp dụng trên quy mô mẫu lớn. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học của tác giả Vương Nguyễn Sông Hằng tập trung giải quyết bài toán phát hiện đồng thời hai loại virus trên trong một phản ứng sinh học phân tử duy nhất.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

• Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình phát hiện ZYMV và PRSV bằng phương pháp Multiplex RT-PCR nhằm chẩn đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây ra.
• Nhiệm vụ (nội dung) nghiên cứu:
  1. Nội dung 1: Xây dựng được quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT-PCR.
  2. Nội dung 2: Áp dụng quy trình lên mẫu thực địa.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu đối chứng dương ZYMV (lá dưa lưới) và PRSV (lá bí) do Phòng Sinh học phân tử cung cấp; mẫu RNA/cDNA; 63 mẫu lá cây họ bầu bí nghi nhiễm bệnh thu thập tại thực địa; các cặp mồi khuếch đại đoạn gen ZYMV, PRSV và gen actin của cây chủ (dùng làm chứng nội).
  • Phạm vi không gian: Các thí nghiệm chuyên sâu được triển khai tại Phòng 204 – Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phạm vi lấy mẫu thực địa bao gồm 7 vườn canh tác thuộc các tỉnh Đồng Tháp (huyện Tháp Mười, huyện Cao Lãnh, TP. Cao Lãnh), Long An (huyện Cần Giuộc), TP. Hồ Chí Minh (TP. Thủ Đức) và Bình Dương (TP. Dĩ An).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thiết lập nghiên cứu dựa trên các cơ sở sinh học phân tử và virus học thực vật thực nghiệm:

• Đặc tính đối tượng virus: Hệ gen của ZYMV là một chuỗi đơn RNA dương dài khoảng 9.600 nucleotide liên kết với protein VPg ở đầu 5', đuôi poly(A) ở đầu 3' và lớp vỏ capsid 36 kDa, tạo thể vùi tế bào chất dạng cuộn sợi (pinwheels) loại 1. PRSV có kích thước hạt virus dạng sợi mềm 760–800 x 12 nm, hệ gen RNA khoảng 12 kb, gồm hai dòng sinh học chính là PRSV-P (gây bệnh trên cả đu đủ và bầu bí) và PRSV-W (chỉ gây hại trên bầu bí, không lây nhiễm đu đủ).
• Nguyên lý chứng nội (Internal Amplification Control - IC): Để kiểm soát chất lượng quá trình tách chiết RNA và hạn chế hiện tượng âm tính giả do sự ức chế phản ứng enzyme phiên mã ngược hoặc Taq polymerase, nghiên cứu sử dụng gen giữ nhà (housekeeping gene) actin của cây họ bầu bí làm chứng nội. Đoạn mồi được thiết kế vắt qua các exon trên phân tử mRNA trưởng thành để phân biệt sản phẩm phiên mã với DNA bộ gen còn sót lại.

Hệ thống phương pháp và quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các bước kỹ thuật:

1. Thu nhận và ly trích RNA tổng số: Sử dụng bộ kít EZ-10 Spin Column Plant RNA Miniprep Kit dựa trên màng silicagel để tách chiết RNA, loại bỏ polysaccharide và các hợp chất polyphenol. Nồng độ và độ tinh sạch của dịch RNA được xác định qua tỷ số hấp thụ quang phổ $A_{260}/A_{280}$ trên máy BioDrop (yêu cầu đạt khoảng 1,8–2,0).
2. Xử lý loại bỏ DNA: Dịch chiết RNA được ủ với enzyme DNase I không chứa RNase (Thermo Scientific) ở 37°C trong 30 phút, sau đó bất hoạt bằng EDTA ở 65°C trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn DNA bộ gen thực vật.
3. Tổng hợp cDNA: Sử dụng kít SensiFAST cDNA Synthesis Kit trong phản ứng phiên mã ngược với thể tích 10 µL. Chu trình nhiệt bao gồm: 25°C trong 10 phút, 42°C trong 15 phút, 48°C trong 15 phút và dừng phản ứng ở 85°C trong 5 phút.
4. Kỹ thuật RT-PCR đơn và giải trình tự nucleotide: Từng cặp mồi đặc hiệu được chạy phản ứng đơn lẻ để kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại: cặp ZYMV-F/ZYMV-R cho sản phẩm 214 bp; cặp PRSV-F/PRSV-R cho sản phẩm 331 bp; cặp IC626-F/IC626-R cho sản phẩm 626 bp. Sản phẩm RT-PCR được tinh sạch và gửi giải trình tự nucleotide thương mại, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
5. Tối ưu hóa phản ứng Multiplex RT-PCR: Thực hiện khảo sát đa biến về nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp. Đầu tiên, khảo sát tổ hợp nồng độ hai mồi virus ZYMV và PRSV (từ 0,1 µM đến 0,3 µM); tiếp đó phối trộn khảo sát nồng độ mồi chứng nội IC (từ 0,05 µM đến 0,4 µM); sau cùng, chạy gradient nhiệt độ bắt cặp (50°C đến 60°C) để chọn điều kiện mà cả ba băng điện di hiển thị sáng rõ, đồng đều và hạn chế tạo primer-dimer.
6. Kiểm tra độ đặc hiệu: Đánh giá phản ứng khuếch đại trên 7 loại virus đối chứng bao gồm: Cucumber mosaic virus (CMV), Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato mottle mosaic virus (ToMMV), Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 (PMWaV-1), PMWaV-2 và PMWaV-3.
7. Khảo sát mẫu thực địa: Áp dụng quy trình tối ưu lên 63 mẫu lá nghi nhiễm thu ngẫu nhiên từ 7 vườn canh tác thực tế. Dữ liệu tỷ lệ nhiễm và đồng nhiễm được tổng hợp và biểu diễn bằng Microsoft Excel 2010.

Tên cặp primer	Chiều trình tự (5' - 3')	Kích thước sản phẩm (bp)	Nguồn tham khảo
ZYMV-F ZYMV-R	CATACATGCCGAGGTATGGTTT GTGTGCCGTTCAGTGTCTT	214	Aguiar và ctv (2019)
PRSV-F PRSV-R	TGTGTACGACTTCTCACCGA CTTAACGCACAACTCAGCGTAT	331	Ngô Thanh Thúy (2023)
IC626-F IC626-R	GGAATTGTGATGGATTCTGGTG GCAATCCACATCTGCTGG	626	Tự thiết kế trong nghiên cứu

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương này tập trung trình bày tầm quan trọng của cây họ bầu bí trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp và giá trị dinh dưỡng đối với con người. Tác giả phân tích các nguyên nhân gây thất thu mùa màng, nhấn mạnh mức độ thiệt hại nặng nề do bệnh virus gây ra (đặc biệt là ZYMV và PRSV). Chương 1 làm rõ các giới hạn tồn tại của các phương pháp xét nghiệm truyền thống như ELISA (dễ gây phản ứng chéo) và RT-PCR đơn (tốn kém thời gian, chi phí hóa chất), từ đó xác lập tính cấp thiết của việc xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR đa mục tiêu có tích hợp chứng nội IC nhằm phục vụ công tác giám sát dịch tễ học và quản lý bệnh hại thực tế.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa toàn diện các tư liệu khoa học về cây họ bầu bí, tình hình sản xuất trong nước và quốc tế. Nội dung trọng tâm đi sâu vào phân loại sinh học, cấu trúc hạt virion, cơ chế truyền bệnh qua véc-tơ rệp muội và triệu chứng biến dạng hình thái của ZYMV và PRSV. Chương này đồng thời phân tích, so sánh các kỹ thuật chẩn đoán hiện hành như ELISA, RT-LAMP, RT-PCR và Multiplex RT-PCR, đồng thời làm rõ cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn gen actin thực vật làm đối chứng khuếch đại nội tại (IC) để loại trừ kết quả âm tính giả.

Chương 3. Vật liệu và phương pháp

Chương 3 trình bày chi tiết về thời gian (03/2023–07/2023), địa điểm (Phòng 204, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường), các chủng mẫu virus chuẩn và tọa độ thu thập 63 mẫu lá thực địa tại 7 vườn thuộc 4 tỉnh thành. Tác giả lập bảng chi tiết danh mục hóa chất, kít sinh học phân tử (EZ-10 Spin Column, DNase I, SensiFAST cDNA, MyTaq Mix), thiết bị (LifeEco Thermo Cycler, BioDrop, Mupid-One) và trình tự 3 cặp mồi khuếch đại. Toàn bộ các bước thực nghiệm từ ly trích RNA, xử lý enzyme, tổng hợp cDNA, thiết lập phản ứng PCR đơn, tối ưu ma trận nồng độ primer, gradient nhiệt độ, kiểm tra độ đặc hiệu và phân tích mẫu đại trà đều được mô tả cụ thể về thành phần hóa chất và chu trình nhiệt.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp toàn bộ các dữ liệu và hình ảnh điện di thu được trong quá trình nghiên cứu:

• Đánh giá nồng độ RNA: Dịch RNA ly trích từ mẫu đối chứng ZYMV đạt nồng độ 21,87 ng/µL ($A_{260}/A_{280} = 2,050$), mẫu PRSV đạt 42,57 ng/µL ($A_{260}/A_{280} = 2,030$), bảo đảm độ tinh sạch để làm khuôn phiên mã ngược.
• Kết quả RT-PCR đơn và giải trình tự: Các phản ứng đơn lẻ khuếch đại chính xác phân đoạn 214 bp (ZYMV), 331 bp (PRSV) và 626 bp (IC). Kết quả giải trình tự đoạn gen ZYMV đạt độ tương đồng 99,53% so với trình tự ZYMV mã số DQ925448.1 trên NCBI; đoạn gen PRSV được xác nhận tương đồng tuyệt đối trên cơ sở dữ liệu GenBank. Mồi IC626-F/R chứng minh tính chuyên biệt cao khi chỉ bắt cặp trên phân tử cDNA tổng hợp từ RNA cây chủ mà không bắt cặp với DNA bộ gen chưa xử lý.
• Tối ưu hóa phản ứng Multiplex RT-PCR: Qua khảo sát 9 tổ hợp nồng độ mồi cho ZYMV và PRSV, nồng độ được chọn lần lượt là 0,3 µM và 0,2 µM do cho băng sáng đều và ít dimer. Khi phối hợp mồi IC từ 0,05 đến 0,4 µM, nồng độ 0,1 µM được xác định là tối ưu nhằm giảm thiểu hiện tượng cạnh tranh cơ chất với hai mồi virus. Khảo sát dải nhiệt độ bắt cặp từ 50°C đến 60°C xác định nhiệt độ tối ưu của phản ứng Multiplex RT-PCR là 57,1°C.
• Kiểm tra độ đặc hiệu và ứng dụng thực địa: Phản ứng Multiplex không bắt chéo với 7 virus ngoại lai (CMV, SPFMV, ToMV, ToMMV, PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3). Ứng dụng trên 63 mẫu thực địa phát hiện 31 mẫu nhiễm virus (tỷ lệ 49,21%), trong đó có 25 mẫu đồng nhiễm ZYMV + PRSV (39,68%), 5 mẫu chỉ nhiễm PRSV (7,90%) và 1 mẫu chỉ nhiễm ZYMV (1,59%).

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Đúc kết ngắn gọn các kết quả cốt lõi: xây dựng thành công quy trình Multiplex RT-PCR có kiểm soát nội tại; xác lập bộ thông số kỹ thuật tối ưu (nồng độ primer IC, ZYMV, PRSV lần lượt là 0,1 µM; 0,3 µM; 0,2 µM; nhiệt độ bắt cặp 57,1°C); chứng minh tính đặc hiệu tuyệt đối và thử nghiệm thành công trên 63 mẫu thực địa. Tác giả đồng thời nêu các đề xuất tiếp theo nhằm mở rộng phạm vi thử nghiệm độ đặc hiệu, xác định giới hạn phát hiện và nâng cấp lên kỹ thuật Realtime PCR.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã chuẩn hóa thành công quy trình Multiplex RT-PCR với các thông số phản ứng cụ thể: thành phần một phản ứng 25 µL gồm 12,5 µL MyTaq Mix (2X); 2 µL mẫu cDNA; các primer IC626-F/R (0,1 µM), ZYMV-F/R (0,3 µM), PRSV-F/R (0,2 µM); bổ sung nước DEPC vừa đủ. Chu trình nhiệt tối ưu gồm: tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ lặp lại [biến tính 95°C trong 1 phút, bắt cặp 57,1°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 1 phút 20 giây]; hậu kéo dài ở 72°C trong 7 phút.

Quy trình đã được áp dụng để tầm soát dịch hại trên 63 mẫu lá cây họ bầu bí có triệu chứng bệnh thu thập tại 7 vườn sản xuất. Kết quả phát hiện nguồn bệnh được tổng hợp chi tiết trong bảng dưới đây:

Địa điểm thu mẫu	Đối tượng cây trồng	Số mẫu kiểm tra	Số mẫu chỉ nhiễm ZYMV	Số mẫu chỉ nhiễm PRSV	Số mẫu đồng nhiễm ZYMV và PRSV	Tổng số mẫu dương tính
Vườn 1 (Tháp Mười, Đồng Tháp)	Cây bí	9	0	0	9	9/9
Vườn 2 (Huyện Cao Lãnh, Đồng Tháp)	Cây bí	9	0	0	9	9/9
Vườn 3 (TP. Cao Lãnh, Đồng Tháp)	Cây dưa lưới	9	1	3	0	4/9
Vườn 4 (Huyện Cao Lãnh, Đồng Tháp)	Cây bí	9	0	3	0	3/9
Vườn 5 (Cần Giuộc, Long An)	Cây mướp	9	0	0	0	0/9
Vườn 6 (Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh)	Cây bầu	9	0	0	0	0/9
Vườn 7 (Dĩ An, Bình Dương)	Cây bí	9	0	2	7	9/9
Tổng cộng		63	1 (1,59%)	5 (7,90%)	25 (39,68%)	31 (49,21%)

Đóng góp của nghiên cứu thể hiện qua các điểm chính:

• Khắc phục hiện tượng phản ứng chéo thường gặp ở phương pháp ELISA giữa ZYMV và PRSV, đồng thời nâng cao hiệu suất kiểm tra và tiết kiệm chi phí hóa chất so với kỹ thuật RT-PCR đơn lẻ.
• Thiết kế thành công cặp mồi cho gen actin cây họ bầu bí làm chứng nội IC (626 bp), giúp kiểm soát chất lượng mẫu RNA và hạn chế hiện tượng âm tính giả do sự hiện diện của các chất ức chế phản ứng PCR.
• Cung cấp dẫn liệu thực tế mới về dịch tễ học: tỷ lệ đồng nhiễm cả hai loại virus ZYMV và PRSV tại các vườn khảo sát ở miền Nam chiếm tỷ lệ cao (39,68% tổng số mẫu kiểm tra và chiếm 80,65% số mẫu dương tính). Hiện tượng này được giải thích bởi cơ chế tương tác bổ trợ (heteroencapsidation) khi các dòng virus thiếu hụt protein trợ lực (HC) hoặc protein vỏ (CP) có thể mượn protein của virus kia để cùng truyền lan qua rệp muội.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ rõ các hạn chế kỹ thuật và phạm vi nghiên cứu thực tế:

• Chưa khảo sát độ đặc hiệu của quy trình đối với các loại virus thực vật khác cũng thường xuyên gây hại trên cây họ bầu bí như Squash mosaic virus (SqMV), Squash leaf curl virus (SLCV) và Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV).
• Chưa tiến hành đánh giá giới hạn phát hiện tối thiểu (LOD) hay độ nhạy phân tích của hệ mồi ở các dải nồng độ khuôn pha loãng khác nhau.
• Tại Vườn 5 (cây mướp) và Vườn 6 (cây bầu), mẫu lá biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt nhưng kết quả phân tích âm tính với cả ZYMV và PRSV; do giới hạn phạm vi đề tài, tác giả chưa thể kiểm chứng sự hiện diện của các chủng virus gây bệnh khác trên các mẫu này.
• Phạm vi lấy mẫu thực địa mới dừng lại ở quy mô thăm dò tại 7 vườn thuộc 4 tỉnh thành phía Nam trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 7/2023.

Từ các hạn chế trên, tác giả đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Kiểm tra bổ sung độ đặc hiệu của quy trình trên các đối tượng virus SqMV, SLCV và CGMMV.
• Khảo sát độ nhạy của bộ primer để hoàn thiện quy trình sản xuất bộ kít chẩn đoán nhanh phục vụ thương mại hóa.
• Áp dụng quy trình trên diện rộng ở các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau nhằm kiểm chứng độ ổn định và độ chính xác thực địa.
• Nâng cấp quy trình phát hiện ZYMV và PRSV từ kỹ thuật Multiplex RT-PCR thông thường sang kỹ thuật Multiplex Realtime RT-PCR nhằm tăng độ nhạy và cho phép định lượng tải lượng virus trong mô cây.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Bảo vệ thực vật, Nông học và Bệnh học thực vật. Cụ thể:

• Tài liệu tham khảo về thiết kế đối chứng nội: Phần nội dung thiết kế cặp primer IC626-F/R trên gen actin (exon 4 và exon 5–6) là tài liệu mẫu hữu ích cho những người làm đề tài chẩn đoán phân tử trên thực vật muốn xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng phản ứng phiên mã ngược, tránh hiện tượng âm tính giả.
• Kinh nghiệm tối ưu phản ứng Multiplex PCR: Các bảng số liệu và hình ảnh khảo sát ma trận nồng độ primer và gradient nhiệt độ trong Chương 3 và Chương 4 cung cấp phương pháp xử lý thực nghiệm rõ ràng khi giải quyết bài toán cạnh tranh cơ chất và ức chế giữa nhiều cặp mồi trong cùng một ống phản ứng.
• Dẫn liệu dịch tễ phục vụ sản xuất giống: Dữ liệu về tỷ lệ đồng nhiễm ZYMV và PRSV trên cây bí, dưa lưới tại các tỉnh phía Nam là nguồn tư liệu tham khảo thực tế cho các viện nghiên cứu giống cây trồng, các trung tâm kiểm dịch thực vật và cán bộ khuyến nông trong việc xây dựng quy trình giám sát dịch tễ và tuyển chọn nguồn giống sạch bệnh.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của cặp mồi IC626-F/R trong phản ứng Multiplex RT-PCR của nghiên cứu này là gì?
Cặp mồi IC626-F/R được thiết kế đặc hiệu trên trình tự exon 4 và exon 5–6 của gen actin ở cây họ bầu bí, khuếch đại phân đoạn có kích thước 626 bp. Vai trò của cặp mồi này là tạo ra một đối chứng nội (Internal Amplification Control - IC) nhằm kiểm tra chất lượng RNA sau ly trích và giám sát hiệu quả của phản ứng phiên mã ngược cũng như PCR, giúp loại trừ hiện tượng âm tính giả mà không gây ảnh hưởng đến sự khuếch đại của các đoạn gen đích virus.

2. Điều kiện tối ưu hóa về nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp của phản ứng Multiplex RT-PCR được xác định là bao nhiêu?
Qua các bước khảo sát ma trận và gradient nhiệt độ, tác giả xác định điều kiện tối ưu cho một phản ứng 25 µL gồm nồng độ primer IC là 0,1 µM; ZYMV là 0,3 µM; PRSV là 0,2 µM; và nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 57,1°C. Điều kiện này cho cả ba vạch điện di (626 bp, 331 bp, 214 bp) hiển thị rõ nét, đồng đều và hạn chế sự xuất hiện của primer-dimer.

3. Phản ứng Multiplex RT-PCR đã được kiểm chứng độ đặc hiệu trên những đối tượng virus nào?
Độ đặc hiệu của phản ứng được kiểm chứng trên 7 loại virus đối chứng gồm: Cucumber mosaic virus (CMV - cùng ký chủ), Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV - cùng chi Potyvirus), Tomato mosaic virus (ToMV) và Tomato mottle mosaic virus (ToMMV - cùng triệu chứng), cùng ba loại virus dứa gồm PMWaV-1, PMWaV-2 và PMWaV-3 (dùng để kiểm soát thao tác chéo trong phòng thí nghiệm). Kết quả cho thấy phản ứng chỉ khuếch đại duy nhất vạch chứng nội IC 626 bp, hoàn toàn không xuất hiện băng kích thước 214 bp hay 331 bp trên các đối tượng này.

4. Tại sao tỷ lệ mẫu đồng nhiễm cả ZYMV và PRSV trên thực địa lại chiếm tỷ lệ cao hơn các mẫu nhiễm đơn lẻ?
Trong số 31 mẫu dương tính thu được từ 63 mẫu thực địa, có tới 25 mẫu đồng nhiễm cả hai loại virus (chiếm 39,68% tổng số mẫu). Tác giả dẫn giải dựa trên nghiên cứu của Bourdin và Lecoq (1991): một số chủng ZYMV bị đột biến mất khả năng truyền qua rệp do thiếu hụt protein trợ lực (HC) hoặc protein vỏ (CP); tuy nhiên khi đồng nhiễm với PRSV, ZYMV có thể tận dụng các protein cấu trúc chức năng tương ứng của PRSV thông qua cơ chế bao bọc vỏ lai (heteroencapsidation) để cùng truyền lan qua các loài rệp môi giới.

5. Vì sao các mẫu cây mướp ở Vườn 5 và cây bầu ở Vườn 6 có biểu hiện triệu chứng bệnh nhưng phản ứng Multiplex RT-PCR lại cho kết quả âm tính?
Các triệu chứng như khảm lá hoặc biến dạng hình thái trên cây họ bầu bí có thể do nhiều tác nhân virus thực vật khác gây ra ngoài ZYMV và PRSV (chẳng hạn như CMV, WMV-2, CGMMV hoặc SqMV). Do phạm vi mồi của đề tài tập trung chuyên biệt vào ZYMV và PRSV, các mẫu tại Vườn 5 và Vườn 6 không chứa hai đối tượng đích này nên phản ứng cho kết quả âm tính; tác giả ghi nhận đây là hạn chế chưa thể định danh tác nhân thay thế do chưa đủ điều kiện kiểm chứng các chủng virus khác.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vương Nguyễn Sông Hằng đã xây dựng thành công quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời hai loại virus gây hại phổ biến trên cây họ bầu bí là ZYMV và PRSV, có tích hợp chứng nội gen actin (IC) nhằm ngăn chặn hiện tượng âm tính giả. Quy trình đạt tính tối ưu ở nồng độ primer IC, ZYMV, PRSV lần lượt là 0,1 µM; 0,3 µM; 0,2 µM tại nhiệt độ bắt cặp 57,1°C, đồng thời thể hiện độ đặc hiệu phân tích cao khi không phản ứng chéo với 7 loại virus ngoại lai. Thử nghiệm thực địa trên 63 mẫu lá đã chẩn đoán thành công 31 mẫu dương tính, làm sáng tỏ thực trạng đồng nhiễm chiếm ưu thế (39,68%) của hai loại Potyvirus tại các tỉnh phía Nam. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề kỹ thuật tin cậy phục vụ công tác giám sát dịch tễ, kiểm định chất lượng giống cây trồng và hướng tới phát triển các bộ kít chẩn đoán phân tử trong nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Họ Bau bí (tên khoa học là Cucurbitaceae) là một họ thực vật bao gồm một số loài phô biến như: dưa hau, dưa chuột, bí dao, bau, bi ngô, mướp, mướp đắng, la hán quả. Nó là một trong những họ thực vật quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới (Roskov, 2014). Điều đáng chú ý là cây họ bầu bí có ưu thế hơn một số cây trồng khác về vitamin và chất khoáng. Các loại vitamin như vitamin A, BI, B2, C, E có tác dụng quan trọng trong quá trình phát triển cơ thé, thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều bệnh tật.

Chất khoáng trong họ thực vật này chủ yếu là Ca, P, Fe là những chất cần thiết cho máu và xương. Các chất khoáng có tác dụng điều hoà và cân bằng kiềm toan trong máu, làm tăng khả năng đồng hoá protein. Trong cây họ bầu bí có khối lượng chất xơ lớn tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng do có thể tích lớn, xốp do đó chất xơ có tác dụng nhuận trang va tăng khả năng tiêu hoá (Tạ Thu Cúc, 2007). Hiện nay dich hại trên cây họ bau bí rất phong phú và đa dạng như: bệnh do nam, bệnh do côn trùng, bệnh do virus.

Một trong các dich hại quan trong va phố biến trên cây họ bầu bí là các bệnh virus. Theo AVRDC, các virus gây hại trên cây họ bầu bí ở châu A gồm: CMV (Cucuber mosaic virus), PRSV (Papaya ringspot virus), WMV-2 (Water melon mosaic virus — 2), ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus), SMV (Squash leaf curl virus) và CGMMV (Cucumber green mild motle virus). Trong số này, hai loại virus phô biến lây nhiễm trên cây họ bầu bí là ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) (Ali va ctv, 2012a, 2012b). Ca 2 loại virus này đều có bộ gen là RNA, thuộc chi Potyvirus họ Potyviridae và gây mất năng suất lên tới 100%, lây truyền phần lớn qua các loài rệp.

Chúng gây ra các triệu chứng giống nhau trên cây ho bau bí như khảm và đốm đốm nên rất khó phân biệt. Hai loài này gây phản ứng chéo với nhau khi thực hiện các xét nghiệm về mặt huyết thanh học(Baker, 1989). Phương pháp RT-PCR có thé dùng dé phát hiện hai loại virus này một cách chính xác hơn. Tuy nhiên, phương pháp này gây tốn thời gian, chi phí và công sức.

Vì vậy, cần phải phát triển phương pháp Multiplex RT- PCR dé phát hiện đồng thời cả hai loại virus trong một phản ứng duy nhất. Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT- PCR” được tiến hành nhằm phục vụ sản xuất, giúp ngăn chăn kịp thời, giảm thiểu những tồn tat mà ZYMV và PRSV gây ra cho người dân Việt Nam. Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình phát hiện ZYMV va PRSV bằng phương pháp Multiplex RT- PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây ra. Nội dung đề tài Nội dung 1: Xây dựng được quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT-PCR.

Nội dung 2: Áp dụng quy trình lên mẫu thực địa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Cây họ bau bí Cucurbitaceae Cây họ bầu bí là một họ thực vật có hoa bao gồm khoảng 98 chỉ với khoảng 975 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Họ cây này là cây thân thảo, cây bụi hàng năm hoặc lâu năm, rễ cây có dạng sợi hoặc củ; thân cây thường có góc cạnh và lá mọc so le, gân đơn và có lông.

Hoa đơn tính, xếp thành chùm (Xu và ctv, 2017). Thụ phan chủ yếu nhờ côn trùng, nhưng cũng có thê nhờ gió.