Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV Bằng Multiplex RT-PCR

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học xây dựng quy trình phát hiện virus zymv zucchini yellow mosaic virus, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Vương Nguyễn Sông Hàng
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Văn Biết
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV Bằng Phương Pháp Multiplex RT-PCR
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Họ Bầu bí (tên khoa học là Cucurbitaceae)
• 1.2. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới
• 1.3. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước
• 1.4. Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí
• 1.5. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
• 1.5.1. Nguồn gốc và phân bố
• 1.5.2. Đặc điểm ZYMV
• 1.5.3. Triệu chứng, tác hại
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cây họ bầu bí Cucurbitaceae
• 2.2. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới
• 2.3. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước
• 2.4. Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Các trình tự primer dùng trong nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Ly trích RNA tổng số
• 3.4.2. Xử lý DNA bằng enzyme DNase I
• 3.4.3. Tổng hợp cDNA với enzyme phiên mã ngược
• 3.4.4. Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phương pháp RT-PCR
• 3.4.5. Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch đại và giải trình tự
• 3.4.6. Thiết kế primer cho chứng nội (internal amplification control - IC)
• 3.4.7. Xây dựng phương pháp Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV
• 3.4.8. Kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR
• 3.4.9. Phát hiện ZYMV và PRSV trên mẫu thực địa bằng Multiplex RT-PCR
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
• 4.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của ZYMV
• 4.3. Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại của ZYMV
• 4.4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của PRSV
• 4.5. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chứng nội (IC)
• 4.6. Kết quả xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV
• 4.7. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR
• 4.8. Kết quả áp dụng quy trình vào phát hiện ZYMV và PRSV trên mẫu thực địa
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) là hai loại virus thuộc chi Potyvirus, gây bệnh nghiêm trọng trên cây họ bầu bí. Chúng không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho nông dân. Việc phát hiện sớm và chính xác hai loại virus này là rất quan trọng để bảo vệ mùa màng. Phương pháp Multiplex RT-PCR đã được phát triển để phát hiện đồng thời cả hai virus trong một phản ứng duy nhất, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

1.1. Virus ZYMV và PRSV Đặc Điểm và Tác Hại

ZYMV và PRSV đều có bộ gen RNA và lây truyền chủ yếu qua rệp. Chúng gây ra các triệu chứng như khảm và đốm trên cây, làm giảm năng suất đến 100%. Việc hiểu rõ về đặc điểm của hai virus này giúp nông dân có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Virus Gây Hại Trên Cây Họ Bầu Bí

Nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí đã chỉ ra rằng ZYMV và PRSV là hai loại virus phổ biến nhất. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng chúng có thể gây ra thiệt hại lớn cho năng suất cây trồng, đặc biệt là ở Việt Nam.

II. Vấn Đề Trong Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Việc phát hiện virus ZYMV và PRSV gặp nhiều thách thức do triệu chứng bệnh tương tự nhau. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác. Phương pháp truyền thống như ELISA thường tốn thời gian và chi phí cao. Do đó, cần có một phương pháp hiệu quả hơn để phát hiện đồng thời cả hai virus.

2.1. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán Virus

Triệu chứng của ZYMV và PRSV rất giống nhau, gây khó khăn trong việc phân biệt. Điều này làm tăng nguy cơ lây lan virus trong các vụ mùa, ảnh hưởng đến năng suất.

2.2. Giới Hạn Của Các Phương Pháp Truyền Thống

Các phương pháp như ELISA và RT-PCR truyền thống thường tốn nhiều thời gian và chi phí. Điều này không phù hợp với nhu cầu phát hiện nhanh chóng trong sản xuất nông nghiệp.

III. Phương Pháp Multiplex RT PCR Để Phát Hiện Virus

Phương pháp Multiplex RT-PCR được phát triển để phát hiện đồng thời virus ZYMV và PRSV trong một phản ứng duy nhất. Phương pháp này sử dụng ba cặp primer để khuếch đại các sản phẩm gen khác nhau, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Nghiên cứu đã chứng minh rằng phương pháp này có độ đặc hiệu cao và có thể áp dụng rộng rãi.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Multiplex RT PCR

Multiplex RT-PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen trong một phản ứng, giúp phát hiện đồng thời nhiều loại virus. Điều này giúp tăng độ chính xác và giảm thời gian xét nghiệm.

3.2. Quy Trình Thực Hiện Multiplex RT PCR

Quy trình thực hiện bao gồm việc chuẩn bị mẫu, thiết kế primer, và thực hiện phản ứng khuếch đại. Các điều kiện tối ưu như nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp cũng được xác định để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR đã được áp dụng thành công để phát hiện virus ZYMV và PRSV từ 63 mẫu thực địa. Kết quả cho thấy 31 mẫu nhiễm virus, trong đó có 5 mẫu nhiễm PRSV, 1 mẫu nhiễm ZYMV và 25 mẫu nhiễm đồng thời cả hai virus. Điều này chứng tỏ tính hiệu quả của phương pháp trong thực tiễn.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Từ Mẫu Thực Địa

Nghiên cứu đã phát hiện 31 mẫu nhiễm virus từ 63 mẫu thực địa, cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh cao. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát hiện sớm để có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

4.2. Tính Đặc Hiệu Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR cho thấy độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện ZYMV và PRSV. Điều này giúp nông dân có thể nhanh chóng xác định tình trạng cây trồng và có biện pháp xử lý kịp thời.

V. Kết Luận Về Phát Hiện Virus ZYMV và PRSV

Phát hiện virus ZYMV và PRSV bằng phương pháp Multiplex RT-PCR là một bước tiến quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn chính xác, từ đó giảm thiểu thiệt hại cho nông dân. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và cải tiến phương pháp này để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Phương Pháp Multiplex RT PCR

Phương pháp Multiplex RT-PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhiều loại virus khác nhau trong một phản ứng. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và hiệu quả hơn.

5.2. Đề Xuất Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR. Việc áp dụng công nghệ mới cũng có thể giúp nâng cao hiệu quả phát hiện virus trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Họ Bau bí (tên khoa học là Cucurbitaceae) là một họ thực vật bao gồm một số loài phô biến như: dưa hau, dưa chuột, bí dao, bau, bi ngô, mướp, mướp đắng, la hán quả. Nó là một trong những họ thực vật quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới (Roskov, 2014). Điều đáng chú ý là cây họ bầu bí có ưu thế hơn một số cây trồng khác về vitamin và chất khoáng. Các loại vitamin như vitamin A, BI, B2, C, E có tác dụng quan trọng trong quá trình phát triển cơ thé, thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều bệnh tật.

Chất khoáng trong họ thực vật này chủ yếu là Ca, P, Fe là những chất cần thiết cho máu và xương. Các chất khoáng có tác dụng điều hoà và cân bằng kiềm toan trong máu, làm tăng khả năng đồng hoá protein. Trong cây họ bầu bí có khối lượng chất xơ lớn tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng do có thể tích lớn, xốp do đó chất xơ có tác dụng nhuận trang va tăng khả năng tiêu hoá (Tạ Thu Cúc, 2007). Hiện nay dich hại trên cây họ bau bí rất phong phú và đa dạng như: bệnh do nam, bệnh do côn trùng, bệnh do virus.

Một trong các dich hại quan trong va phố biến trên cây họ bầu bí là các bệnh virus. Theo AVRDC, các virus gây hại trên cây họ bầu bí ở châu A gồm: CMV (Cucuber mosaic virus), PRSV (Papaya ringspot virus), WMV-2 (Water melon mosaic virus — 2), ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus), SMV (Squash leaf curl virus) và CGMMV (Cucumber green mild motle virus). Trong số này, hai loại virus phô biến lây nhiễm trên cây họ bầu bí là ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) (Ali va ctv, 2012a, 2012b). Ca 2 loại virus này đều có bộ gen là RNA, thuộc chi Potyvirus họ Potyviridae và gây mất năng suất lên tới 100%, lây truyền phần lớn qua các loài rệp.

Chúng gây ra các triệu chứng giống nhau trên cây ho bau bí như khảm và đốm đốm nên rất khó phân biệt. Hai loài này gây phản ứng chéo với nhau khi thực hiện các xét nghiệm về mặt huyết thanh học(Baker, 1989). Phương pháp RT-PCR có thé dùng dé phát hiện hai loại virus này một cách chính xác hơn. Tuy nhiên, phương pháp này gây tốn thời gian, chi phí và công sức.

Vì vậy, cần phải phát triển phương pháp Multiplex RT- PCR dé phát hiện đồng thời cả hai loại virus trong một phản ứng duy nhất. Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT- PCR” được tiến hành nhằm phục vụ sản xuất, giúp ngăn chăn kịp thời, giảm thiểu những tồn tat mà ZYMV và PRSV gây ra cho người dân Việt Nam. Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình phát hiện ZYMV va PRSV bằng phương pháp Multiplex RT- PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus gây ra. Nội dung đề tài Nội dung 1: Xây dựng được quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT-PCR.

Nội dung 2: Áp dụng quy trình lên mẫu thực địa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Cây họ bau bí Cucurbitaceae Cây họ bầu bí là một họ thực vật có hoa bao gồm khoảng 98 chỉ với khoảng 975 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Họ cây này là cây thân thảo, cây bụi hàng năm hoặc lâu năm, rễ cây có dạng sợi hoặc củ; thân cây thường có góc cạnh và lá mọc so le, gân đơn và có lông.

Hoa đơn tính, xếp thành chùm (Xu và ctv, 2017). Thụ phan chủ yếu nhờ côn trùng, nhưng cũng có thê nhờ gió. Cây họ bau bí có ba chi chính: Dưa hấu (Citrullus lannatus ); dua chuột và dua lưới (Cucumis sativus và Cucumis melo); bí xanh, bí đỏ, bí và bau (Cucurbita spp). có nguồn gốc khác nhau, từ miền nam Bắc Mỹ đến Argentina.

Đối với dưa lưới được cho là có nguồn gốc từ châu Á theo các nghiên cứu gần đây, đã được thuần hóa ít nhất hai lần ở châu Á và châu Phi (Endl và ctv, 2018). Dưa chuột có nguồn gốc từ An Độ và Đông A, còn dưa hấu có nguồn gốc từ châu Phi. Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới Theo FAO, sản lượng cây họ bầu bí trên toàn thế giới bao gồm 100,4 Mt (megaton) đối với dưa hấu, 87,8 Mt đối với dưa chuột, 27,5 Mt đối với các loại dưa khác và 22,9 Mt đối với bí ngô và bí đao. Chỉ riêng Trung Quốc đã sản xuất hơn một phần ba sản lượng toàn thế giới cho mỗi loại cây trồng này, đóng góp 36,7% sản lượng bí ngô và bí đao; 49,1% dưa; 60,5% dưa hấu; 80,1% đưa chuột.

Mặc khác, theo thống kế FAO ghi nhận là hạt dua (egusi), với sản lượng trên toàn thế giới là 1,0 Mt, trong đó 94% được sản xuất ở Châu Phi, đặc biệt là Nigeria với 60% tổng sản lượng. Hạt Egusi có thé được sản xuất từ nhiều loài khác nhau, phổ biến nhất là từ Citrullus mucosospermu (Levi và ctv, 2017). Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước Cũng như trên thế giới, cây họ bầu bí cùng với các cây trồng họ hòa thảo, họ đậu và họ cà là những cây trồng quan trọng nhất trong sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam. Các cây họ bầu bí được trồng phổ biến ở Việt Nam là dưa chuột, dưa hấu, mướp hương, mướp đắng, bí ngô, bí xanh.

Dưa chuột là cây trong họ bầu bí được trồng với diện tích lớn nhất tại Việt Nam. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết dưa chuột được trồng ở tất cả các tỉnh phía Bắc và phía Nam, nhưng diện tích dưa chuột được trồng tập trung với diện tích lớn ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Các vùng trồng dưa chuột tập trung như ở Vĩnh Phúc, Hưng Yên và Hà Nam đạt năng suất trên 230 tạ/ ha cao hơn nhiều so với trung bình cả nước. Năm 2020, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Hà Nam cho toàn tỉnh Hà Nam có 44 hợp tác xã dịch vụ nông nghiệp trồng dưa chuột với tổng diện tích cả năm khoảng 1.200 ha, năng suất dưa chuột bình quân dat 28 - 33 tan/ha, giá trị sản xuất bình quân đạt 250 - 305 triệu đồng/ha/vụ, cao gấp 5 - 6 lần so với sản xuất lúa.

Năm 2013, xã Văn Lang thuộc tinh Phú Thọ đã trồng 65 ha bí xanh mang về nguồn thu trên 10 tỷ đồng cho xã. Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí Cây bau bí có thé bi ảnh hưởng bởi hang chục loại virus lây truyền bằng nhiều loại vectơ truyền bệnh hoặc vết thương hở (Velasco và ctv, 2020). Virus truyền bệnh rệp chang hạn virus thuộc chi Potyviruses như Zucchini yellow mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Papaya ringspot virus, va Moroccan watermelon mosaic virus; virus thuộc chi Cucumoviruses như Cucumber mosaic virus; virus thuộc chi Poleoviruses như Cucurbit aphid-borne yellows virus là những loài phân bố rộng rãi, gây ra dịch bệnh nghiêm trọng ở các vùng trồng cây họ bầu bí. Sự xuất hiện của các chủng mới thuộc chi Carmovirus như Melon necrotic spot virus, do nam Olpidium truyền, cũng đang làm tăng tỷ lệ mắc bệnh liên quan đến loại virus này.

Các loại virus khác lây truyền qua vết thương hở chang hạn như virus thuộc chi Tobamoviruses như Cucumber green mottle mosaic virus va Zucchini green mottle mosaic virus (Chet và ctv, 2020). Tất cả các loại bầu bi đều mẫn cam với chi Potyviruses. Trong chi nay có 2 loại virus ZYMV và PRSV là hai loài đang gây bệnh phô biến trên cây học bau bi ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân, 2016). Zucchini yellow mosaic virus (ZLYMV) 2.

Nguồn gốc va phân bố Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) lần đầu tiên được phan lập ở Ý vào năm 1973, được mô tả vào năm 1981, và sau đó được xác định ở tat cả các châu lục trong vòng một thập kỷ, là một trong những loại virus quan trọng nhất về mặt kinh tế đối với cây họ bau bi. Nó được lây truyền hiệu quả qua rệp và hạt của bí, điều này có thé đã góp phần vào sự lây lan nhanh chóng của nó trên toàn thế giới (Desbiez và Lecoq, 1997). Phan loại Giới: Orthornative Ngành: Pisuviricota Lớp: Stelpaviricetes Bộ: Patatavirales Họ: Potyviridae Chi: Potyvirus Loài: Zucchini yellow mosaic virus 2. Dac diém ZYMV Z.YMV thuộc chi Potyvirus có hình sợi, kích thước 11 — 15 x 650 — 950 nm.

Bộ gen bao gồm một chuỗi RNA đơn dai khoảng 9600 nucleotide với đầu 5’ liên kết với VPg (viral protein genome-linked) và 3’ đuôi poly (A) được bao bọc trong một lớp vỏ protein 36 kDa. Loài virus này gây bệnh trên thực vật, lan truyền thông qua rệp hoặc hạt giống, chứa một sợi RNA (Balintet va ctv, 1990). ARN được dịch mã thành một polyprotein duy nhất được phân cắt bởi ba protease của virus (Desbiez và Lecoq, 1997). Các thể vùi hình trụ (pinwheels) do ZYMV gây ra ở cây nhiễm bệnh thường thuộc loại 1 theo phân loại của Christie (1986).

Các thé vùi tế bào chat này xuất hiện dưới dang các khối sợi nhỏ được nhìn thay bang cách sử dụng thuốc nhuộm màu xanh cam dé phát hiện các thé vùi virus thông qua kính hiển vi (Christie, 1986). Triệu chứng, tác hại Các triệu chứng của ZYMV trên cây trồng thường rất nghiêm trọng va làm giảm năng suất đáng kể. Ở bí bí xanh (Cucurbita pepo) các lá nhiễm bệnh có khảm màu vàng và trở nên phông rộp, trái bị méo mo. maxima) các triệu chứng có thé thay đôi từ lốm đốm đến khảm nghiêm trong, trái cũng có thé bị biến dạng nghiêm trọng.

Ở dưa lưới (Cucumis melo) triệu chứng ban đầu trên lá là hiện tượng nổi gân và khảm vàng. Các lá sau đó bị giảm kích thước, biến dạng, thường có các cạnh có răng cưa và các vết phông rộp hoặc nhữn màu xanh đậm, tương phản với màu vàng hoặc xanh nhạt của phần còn lại của phiến lá. Ở dưa hấu (Citrullus lanatus), d6m, khảm và bệnh xơ lá thường được quan sát thấy, trái nhiễm bệnh có thể có mau sắc không đều và biến dang từ nhẹ đến nghiêm trọng. ZYMV gây bệnh ở những cây thuộc họ bau bí có thé có các triệu chứng bệnh khác nhau (Desbiez và Lecoq, 1997).

Biện pháp phòng ngừa Hiện nay, biện pháp ngăn chặn sự lây lan virus này được dùng phổ biến nhất là loại bỏ, tiêu hủy các cây bầu bí có triệu chứng nhiễm bệnh và dùng thuốc tiêu điệt các loại sâu rệp trung gian truyền bệnh, nhưng cách tốt nhất dé kiểm soát được bệnh hại này là sử dụng nguồn giống có kiểm định chất lượng hoặc giống mang gen kháng loại virus này.