Kiểm soát đồng thời hai loại virus trong cây họ bầu bí

Luận án tiến sĩ nghiên cứu concurrent control of two different virus species in cucurbits by two in one or bivalent mild, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Thi-Ngoc-Bich Tran
• Người hướng dẫn: Dr. Shyi-Dong Yeh
• Trường học: National Chung Hsing University
• Chuyên ngành: Plant Pathology
• Đề tài: Kiểm Soát Đồng Thời Hai Loại Virus Trong Cây Họ Bầu Bí Bằng Vắc-Xin Hai Trong Một
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Taiwan

Mục lục chi tiết

• Acknowledgments
• Abstract
• 1. CHƯƠNG 1: Literature review and research objectives
• 1.1. Aphid-borne viruses threatening the production of cucurbits worldwide
• 1.2. Papaya ringspot virus (PRSV)
• 1.3. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
• 1.4. Cucumber mosaic virus (CMV)
• 1.5. The role of helper component-protease (HC-Pro) and coat protein genes (CP) of OfyVHTUSSGS
• 1.6. The role of the movement protein (MP) and the coat protein (CP) of CMV
• 1.7. Strategies for controlling aphid-borne viruses infecting cucurbits
• 1.8. Agricultural practices
• 1.9. Cross protection = vaccination with a mild virus
• 1.10. Methods to create effective mild strains for cross protection
• 1.11. A proper mild strain is a prerequisite for cross protection
• 1.12. The advantages and disadvantages of cross-protection
• 1.13. Control the mixed infection by cross protection in cucurbits
• 1.14. Objectives of the Study
• 2. CHƯƠNG 2: Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by two-in-one vaccine
• 2.1. Introduction
• 2.2. Materials and methods
• 2.3. Plant materials and virus sources
• 2.4. Co-infection of mild mutant PRSV HA5-1 and ZYMV-ZAC against two different severe potyviruses of PRSV P-HA and ZYMV-GFP in horn melon
• 2.5. Modification of HC-Pro for the generation of mild mutant PRSV-WAC
• 2.6. Inoculation of horn melon plants with PRSV-WAC, ZYMV-ZAC or both
• 2.7. Examination of titer of PRSV and ZYMV
• 2.8. Analysis of the RNA silencing suppression ability of mutated HC-Pros of PRSV and ZAC
• 2.9. Cross protection effectiveness of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or together, against severe strains of PRSV W-CI and ZYMV-GFP under greenhouse conditions
• 2.10. Co-infection of mild viruses PRSV P HAS-1 (HAS-1) and ZYMV-ZAC (ZAC) provides protection against severe isolates of cognate PRSV P-HA and ZYMV-GPP
• 2.11. Generation of attenuated mutant from PRSV W-CI by modification of the pathogenicity factor
• 2.12. Symptoms and accumulation dynamics of WAC and ZAC in co-infected horn melon plants
• 2.13. Mutated HC-Pros of both PRSV and ZYMV have lower RNA silencing suppression abilities but without additive effect
• 2.14. Co-infection of WAC and ZAC in horn melon, muskmelon, and watermelon plants provides complete or high degree of cross protection against both PRSV W-CI and ZYMV-GED
• 2.15. Discussion
• Acknowledgments
• References
• 3. CHƯƠNG 3: Development of bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbits
• 3.1. Introduction
• 3.2. Materials and methods
• 3.3. Virus sources and propagation
• 3.4. Construction of PRSV W type mild strain WAC carrying CMV MP reading frame
• 3.5. Construction of PRSV W mild strain WAC carrying different lengths of CMV CP
• 3.6. Evaluation for the pathogenicity of recombinant viruses
• 3.7. Time-course accumulation levels of recombinants in horn melon plants
• 3.8. Accumulation of the severe virus PRSV W-CI (W-CI) and CMV, alone or together in horn melon plants
• 3.9. The stability of individual recombinant viruses
• 3.10. Cross-protection effectiveness of individual recombinants against two unrelated viruses
• 3.11. Infectivity and cross-protection effectiveness of recombinant virus WAC-MP in horn melon plants
• 3.12. Infectivity of mild strain PRSV WAC carrying different lengths of the CP gene
• 3.13. Genetic stability of PRSV WAC carrying different lengths of CMV CP
• 3.14. Time-course accumulation levels of the PRSV WAC carrying different lengths of CMV-CP viruses
• 3.15. The mild recombinant WAC-CP provides high degrees of cross protection against both PRSV W-CI and CMV, alone or together, in horn melon and muskmelon

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vắc xin 2 Trong 1 Cho Cây Họ Bầu Bí 55 ký tự

Cây họ bầu bí như dưa chuột, bí ngô, dưa hấu, dưa lê là những cây trồng quan trọng về mặt kinh tế. Tuy nhiên, chúng dễ bị nhiễm nhiều loại virus gây thiệt hại đáng kể. Trong số đó, ba loại virus phổ biến và gây hại nhất là papaya ringspot virus (PRSV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) và cucumber mosaic virus (CMV). Phương pháp kiểm soát virus truyền thống thường gặp nhiều khó khăn và tốn kém. Nghiên cứu gần đây đã tập trung vào việc phát triển vắc-xin cho cây họ bầu bí, đặc biệt là vắc-xin hai trong một, để kiểm soát đồng thời nhiều loại virus. Vắc-xin này hứa hẹn mang lại giải pháp hiệu quả và bền vững cho người trồng trọt. Theo nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich, vắc-xin hai trong một có thể cung cấp khả năng bảo vệ đồng thời chống lại hai loại virus khác nhau, giảm chi phí và công sức so với việc sử dụng nhiều loại vắc-xin đơn lẻ.

1.1. Bệnh Virus Thường Gặp ở Bầu Bí và Mức Độ Thiệt Hại

Các bệnh virus như khảm lá dưa chuột, đốm vòng dưa hấu và héo xanh vi khuẩn bầu bí gây ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng. PRSV gây bệnh đốm vòng trên đu đủ và các cây họ bầu bí. ZYMV gây bệnh khảm vàng trên bí xanh. CMV gây bệnh khảm lá trên dưa chuột. Mức độ thiệt hại do các virus này gây ra có thể lên đến 80-90% nếu không có biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc kiểm soát đồng thời nhiều loại virus là một thách thức lớn, đòi hỏi các giải pháp sáng tạo như vắc-xin phòng bệnh virus cho bầu bí.

1.2. Giới Thiệu Về Vắc xin Hai Trong Một và Ưu Điểm Nổi Bật

Vắc-xin hai trong một là một loại vắc-xin được thiết kế để bảo vệ cây trồng chống lại hai hoặc nhiều loại virus khác nhau cùng một lúc. Ưu điểm chính của loại vắc-xin này là giảm số lần tiêm chủng, tiết kiệm chi phí và công sức cho người nông dân. Nó cũng có thể giúp giảm nguy cơ phát triển các chủng virus kháng thuốc. Ưu điểm của vắc-xin hai trong một bao gồm tính tiện lợi, hiệu quả cao và khả năng kiểm soát đồng thời nhiều bệnh, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

II. Thách Thức Trong Phòng Trừ Virus Hại Bầu Bí Hiện Nay 57 ký tự

Việc phòng trừ virus hại bầu bí hiện nay gặp nhiều khó khăn do tính đa dạng của virus, khả năng lây lan nhanh chóng và sự thiếu hụt các biện pháp kiểm soát hiệu quả. Các biện pháp truyền thống như sử dụng thuốc trừ sâu chỉ có thể kiểm soát vector truyền bệnh (như rệp) chứ không thể tiêu diệt virus trực tiếp. Việc sử dụng giống kháng bệnh cũng gặp nhiều hạn chế do sự xuất hiện của các chủng virus mới, phá vỡ khả năng kháng bệnh của giống. Thêm vào đó, điều kiện thời tiết và canh tác không thuận lợi cũng làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Do đó, cần có những giải pháp mới, sáng tạo và bền vững hơn để giải quyết vấn đề này. Việc nghiên cứu và phát triển biện pháp phòng bệnh virus cho dưa chuột và các cây họ bầu bí khác là vô cùng quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực và thu nhập cho người nông dân.

2.1. Sự Đa Dạng Của Virus và Khả Năng Lây Lan Nhanh Chóng

Các loại virus gây bệnh cho cây họ bầu bí rất đa dạng, bao gồm PRSV, ZYMV, CMV và nhiều loại virus khác. Mỗi loại virus có các chủng khác nhau, với khả năng gây bệnh và phạm vi lây nhiễm khác nhau. Virus có thể lây lan qua nhiều con đường, bao gồm rệp, côn trùng khác, hạt giống, dụng cụ làm vườn và tiếp xúc trực tiếp giữa các cây. Tốc độ lây lan nhanh chóng của virus khiến cho việc kiểm soát dịch bệnh trở nên vô cùng khó khăn, đặc biệt là trong điều kiện canh tác mật độ cao.

2.2. Hạn Chế Của Các Biện Pháp Kiểm Soát Truyền Thống

Các biện pháp kiểm soát truyền thống như sử dụng thuốc trừ sâu để kiểm soát rệp có thể gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Việc sử dụng giống kháng bệnh có thể hiệu quả trong một thời gian ngắn, nhưng virus có thể tiến hóa và vượt qua khả năng kháng bệnh của giống. Các biện pháp canh tác như luân canh và vệ sinh đồng ruộng có thể giúp giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm, nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn virus. Do đó, cần có những giải pháp mới và hiệu quả hơn để kiểm soát virus gây bệnh cho cây họ bầu bí.

III. Phương Pháp Tạo Vắc xin Hai Trong Một Hiệu Quả 52 ký tự

Phương pháp tạo vắc-xin hai trong một hiệu quả cho cây họ bầu bí thường liên quan đến việc sử dụng các chủng virus suy yếu (mild strains) của hai hoặc nhiều loại virus khác nhau. Các chủng virus suy yếu này có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cây trồng mà không gây ra các triệu chứng bệnh nghiêm trọng. Vắc-xin có thể được tạo ra bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền để chèn các gen từ các loại virus khác nhau vào một chủng virus suy yếu duy nhất. Một phương pháp khác là sử dụng kỹ thuật đột biến định hướng để tạo ra các chủng virus suy yếu từ các chủng virus hoang dại (wild type). Nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich đã sử dụng cả hai phương pháp này để tạo ra các vắc xin kiểm soát bệnh khảm dưa chuột và các bệnh khác trên cây họ bầu bí.

3.1. Sử Dụng Chủng Virus Suy Yếu Mild Strains và Kỹ Thuật Di Truyền

Các chủng virus suy yếu được sử dụng trong vắc-xin phải có khả năng lây nhiễm và nhân lên trong cây trồng, nhưng không gây ra các triệu chứng bệnh nghiêm trọng. Kỹ thuật di truyền có thể được sử dụng để loại bỏ các gen gây bệnh từ virus hoặc để chèn các gen từ các loại virus khác nhau vào một chủng virus duy nhất. Việc lựa chọn chủng virus suy yếu phù hợp và sử dụng kỹ thuật di truyền chính xác là rất quan trọng để tạo ra vắc-xin hiệu quả và an toàn.

3.2. Kỹ Thuật Đột Biến Định Hướng và Tạo Chủng Virus Suy Yếu

Kỹ thuật đột biến định hướng là một phương pháp tạo ra các chủng virus suy yếu bằng cách gây ra các đột biến cụ thể trong bộ gen của virus. Các đột biến này có thể làm giảm khả năng gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm và nhân lên của virus. Việc sử dụng kỹ thuật đột biến định hướng cho phép tạo ra các chủng virus suy yếu có đặc tính mong muốn và có thể được sử dụng để tạo ra vắc-xin hiệu quả.

IV. Quy Trình Tiêm Vắc xin 2 Trong 1 Cho Bầu Bí Đúng Cách 59 ký tự

Quy trình tiêm vắc-xin cho cây họ bầu bí cần tuân thủ các nguyên tắc nghiêm ngặt để đảm bảo hiệu quả và an toàn. Thời điểm tiêm vắc-xin thường là giai đoạn cây con, khi cây còn non và hệ miễn dịch dễ dàng được kích thích. Liều lượng vắc-xin cần được xác định dựa trên loại cây, kích thước cây và mức độ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Phương pháp tiêm có thể bao gồm phun lên lá, tiêm vào thân hoặc rễ. Sau khi tiêm, cây cần được theo dõi chặt chẽ để đảm bảo không có phản ứng phụ và đánh giá hiệu quả của vắc-xin. Theo kinh nghiệm, việc tuân thủ đúng quy trình giúp vắc-xin phòng bệnh virus cho bầu bí phát huy tối đa hiệu quả.

4.1. Thời Điểm Tiêm Vắc xin Thích Hợp và Các Lưu Ý Quan Trọng

Thời điểm tiêm vắc-xin thích hợp là giai đoạn cây con, khi cây còn non và hệ miễn dịch dễ dàng được kích thích. Cần tránh tiêm vắc-xin khi cây đang bị stress do các yếu tố như thiếu nước, thiếu dinh dưỡng hoặc bị nhiễm bệnh khác. Trước khi tiêm, cần đảm bảo rằng cây đã được tưới nước đầy đủ và được bón phân cân đối. Việc chuẩn bị kỹ lưỡng trước khi tiêm sẽ giúp tăng cường hiệu quả của vắc-xin.

4.2. Liều Lượng Vắc xin và Phương Pháp Tiêm Hiệu Quả Nhất

Liều lượng vắc-xin cần được xác định dựa trên loại cây, kích thước cây và mức độ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Thông thường, liều lượng vắc-xin được khuyến cáo là khoảng 1-2 ml/cây. Phương pháp tiêm có thể bao gồm phun lên lá, tiêm vào thân hoặc rễ. Phương pháp tiêm hiệu quả nhất là tiêm vào thân, vì nó giúp vắc-xin tiếp cận trực tiếp với hệ thống mạch dẫn của cây.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Về Hiệu Quả Vắc xin Hai Trong Một 58 ký tự

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng vắc-xin hai trong một có hiệu quả cao trong việc kiểm soát đồng thời hai hoặc nhiều loại virus gây bệnh cho cây họ bầu bí. Theo nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich, việc sử dụng vắc-xin hai trong một có thể giúp giảm thiểu đáng kể thiệt hại do virus gây ra, tăng năng suất và chất lượng cây trồng. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng vắc xin kiểm soát bệnh khảm dưa chuột và các bệnh khác có thể kéo dài thời gian bảo vệ của cây trồng, giúp giảm số lần tiêm chủng và tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên, hiệu quả của vắc-xin có thể khác nhau tùy thuộc vào loại cây, chủng virus và điều kiện canh tác.

5.1. Mức Độ Bảo Vệ và Ảnh Hưởng Đến Năng Suất Cây Trồng

Vắc-xin hai trong một có thể cung cấp mức độ bảo vệ cao cho cây trồng, giúp giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vắc-xin có thể giảm số lượng cây bị nhiễm bệnh, giảm mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng bệnh và tăng năng suất cây trồng. Mức độ bảo vệ và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng có thể khác nhau tùy thuộc vào loại cây, chủng virus và điều kiện canh tác.

5.2. So Sánh Với Các Phương Pháp Kiểm Soát Virus Khác

So với các phương pháp kiểm soát virus khác, như sử dụng thuốc trừ sâu và giống kháng bệnh, vắc-xin hai trong một có nhiều ưu điểm vượt trội. Vắc-xin không gây hại cho môi trường và sức khỏe con người, không tạo ra các chủng virus kháng thuốc và có thể cung cấp khả năng bảo vệ lâu dài. Tuy nhiên, vắc-xin cũng có một số nhược điểm, như chi phí ban đầu cao và yêu cầu kỹ thuật tiêm chủng cao.

VI. Hướng Phát Triển Vắc xin Cho Cây Họ Bầu Bí Tương Lai 56 ký tự

Hướng phát triển vắc-xin cho cây họ bầu bí trong tương lai tập trung vào việc tạo ra các loại vắc-xin đa chủng, có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại virus khác nhau. Nghiên cứu cũng đang tập trung vào việc phát triển các phương pháp tiêm chủng đơn giản và hiệu quả hơn, giúp giảm chi phí và công sức cho người nông dân. Ngoài ra, việc nghiên cứu về cơ chế hoạt động của vắc-xin và tương tác giữa vắc-xin và cây trồng cũng rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin. Các nghiên cứu về cách sử dụng vắc-xin cho cây trồng đang được đẩy mạnh để ứng dụng rộng rãi hơn.

6.1. Phát Triển Vắc xin Đa Chủng và Phương Pháp Tiêm Chủng Mới

Việc phát triển vắc-xin đa chủng, có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại virus khác nhau, là một hướng đi quan trọng trong tương lai. Các phương pháp tiêm chủng mới, như sử dụng robot tiêm chủng hoặc phát triển vắc-xin dạng phun sương, cũng đang được nghiên cứu để giúp giảm chi phí và công sức cho người nông dân.

6.2. Nghiên Cứu Về Cơ Chế Hoạt Động và Tương Tác Giữa Vắc xin và Cây Trồng

Nghiên cứu về cơ chế hoạt động của vắc-xin và tương tác giữa vắc-xin và cây trồng là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin. Các nghiên cứu này có thể giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vắc-xin, như loại cây, chủng virus, điều kiện canh tác và thời điểm tiêm chủng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỊ 3 PRK 1ñ 1/0315 18 St A Department of Plant Pathology National Chung Hsing University EERE Doctoral Dissertation wig- F-H-ReEER TR PP ich EP? ñnijá2 TR a Concurrent control of two different virus species in cucurbits by two-in-one or bivalent mild vaccine eB: RHRGL SPA AI: PRISE Advisor: Dr. Shyi-Dong Yeh Co-advisor: Dr. Yuh-Kun Chen Student: Thi-Ngoc-Bich Tran PEA R- pots e#- 3 July, 2023 B] in Pl A 81/025 EE SA Tỷ + A AL a % M8 :š015—@—3 -ifE/EMEIRI)6M/S#+† mae 7 a i Š wa 4: RR EB # FH: _ 8107035003 & U 3Ä lễ 38 FF UL šế OA oh C48 FAIS: Air PRK #1 12 75 F AeA Ain PRK 1ñ 1 1ã 1E eS RAGE = wm R B+ HAY l l2 MARA: AHR # & R # ER 8|53% B ĐÁ, mk © HH + Ể BỊ >.82kÉ 4Š AEE HAE & ARE AR ‡ 8 wf + Bl ie #33 AMA AE PALE “at aS 2 TL #:iM|4- 4H14 + eit 6 34 mY Ro # + 4 BỊ ừ †? KE EAE FE BAS to 1 ÚÉ H+ Z3 Bib RAB Mee ARE BR e A 3S 8 t+ 6 § ae 19+ 14 re Đế. BỊ] từ PEK 181/075 18 St RAGE 4 Bh AEN IEE A aE > rễ ⁄ 8 wt oo (.

bp # R AB # --=~ w A +A HäH Acknowledgments I would like to sincerely thank Dr. Shyi-Dong Yeh and Dr. Yuh-Kun Chen for their guidance, encouragement, and support throughout my research. I would also like to thank Dr.

Fuh-Jyh Jan, Dr. Hui-Liang Wang, Dr. Shih-Shun Lin, Dr. Jun-Yi Yang, Dr.

Tsung-Chi Chen, and Dr. Chin-Chih Chen for participating in my dissertation committee. Their guidance has been invaluable throughout this entire process. Likewise, I would like to thank Dr.

Hao-Wen Cheng, Ms. Xing-Yun Xie, and Dr. Chung-Hao Huang for their teaching and assistance in my understanding of techniques during the experiment period. This work would not have been possible without their expertise.

I would like to thank all my lab members, Dr. Wen-Chi Hu, Ms. Ya-Ling Huang, Dr. Duy-Hung Do, Dr.

Thi-Thu-Yen Tran, Dr. Ya-Chi Lin, Ms. Reun-Ping Goh, Ms. Sine-Lan Wang, Mr.

Sang-You Lin, Ms. Fang-Yu Chang, Ms. Thi-Thuy-Linh Le, and Mr. Xuan-Tung Ngo for their abundant help in each of their own special ways from the first day that I came to the lab, and for making such a friendly environment in which to work.

Special thanks go to Dr. Nguyen Ngoc Thuy, and Dr. Shaw-Yhi Hwang for encouraging me to apply to the Ministry Of Education (MOE) Taiwan Scholarship. I would like to thank the Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University (Taiwan), and the Faculty of Agronomy at Nong Lam University - Ho Chi Minh City (Viet Nam) for supporting me during my Ph.

Finally, I special like to thank my husband, Nguyen Van Hong, for caring for my daughter Nguyen Ngoc Kim Ngan from 18 months old in Vietnam. Thank him and my family for their unconditional support, encouragement, and everything they have done for me during this time in NCHU. Also, I would like to thank all my teachers in Vietnam, who taught me knowledge and made me believe that biology is very interesting. Abstract Plants of the family Cucurbitaceae, such as cucumber, pumpkin, muskmelon, watermelon, and squash, are economically important cucurbit crops.

Among aphid- bore viruses, papaya ringspot virus (PRSV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and cucumber mosaic virus (CMV) are three common and prevalent viruses, causing severe losses in a wide range of cucurbit crops globally. In this study, co-infection of horn melon plants with two mild strains, HAS-1 and ZAC, previously developed mild mutants of PRSV P and ZYMV, respectively, confers concurrent protection against PRSV P type and ZYMV. In addition, mild mutants of PRSV W, denoted WAC, were created by site -directed mutagenesis through modifications of the pathogenicity motifs FRNK and PD in helper component-protease (HC-Pro). Plant of horn melon, muskmelon and watermelon pre-infected with WAC and ZAC showed no synergistic effects on severity and provided near complete protection against both PRSV W and ZYMV.

Subsequently, WAC was used as a backbone for the construction of recombinants carrying movement protein (MP) or different lengths of coat protein (CP) coding sequence of cucumber mosaic virus (CMV). The bivalent recombinant WAC-CP provided a high degree of cross protection for concurrent control of PRSV W and CMV in cucurbits. This dissertation is divided into three chapters as follows. Chapter 1 “Literature review and research objectives” This chapter describes all relevant references related to this study.

The objectives and experimental approaches of this study are also described. Chapter 2 “Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by two-in-one vaccine”. In this chapter, we first disclosed that co-infection of horn melon plants with two mild strains, HA5-1 and ZAC, the previously developed mild mutants of PRSV P and ZYMY\V, respectively, confers concurrent protection against PRSV P- type and ZYMV. Consequently, mild mutants of PRSV W, denoted WAC, were generated by site-directed mutagenesis through modifications of the pathogenicity motifs FRNK and PD in helper component-protease (HC-Pro).

Horn melon (Cucumis metuliferus) plants pre-inoculated with WAC and ZAC showed no apparent interference on viral accumulation with no synergistic effects on severity and provided complete protection against both PRSV W and ZYMV. Similar results were reproduced in muskmelon and watermelon plants, indicating the feasibility of a two-in-one vaccine for concurrent control of PRSV W and ZYMV in cucurbits. Chapter 3 “Development of mild bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbits”. A stable mild strain WAC was used as a backbone for generating bivalent vaccines for concurrent control of PRSV and CMV in cucurbits.

WAC recombinants carrying the CMV movement protein (MP) and different lengths of CMV-CP were constructed. The infectivity assay of individual recombinant constructs in horn melon plants indicated that the recombinants WAC-MP, WAC-CP, WAC-CPn, and WAC-CPc cause symptomless infection similar to WAC. In Chenopodium quinoa plants, all recombinants caused infection without local lesion. WAC-CP, WAC-CPn, and WAC- CPc were stable after six-generation transfers.

All recombinants retain a zigzag accumulation pattern and biological characteristics of WAC, inducing recovered mild symptoms on infected horn melon plants. For cross-protection evaluation, WAC-CP provided complete protection against the individual PRSV W-CI or CMV challenge in horn melon plants. Furthermore, WAC-CP provided 93% and 77% protection against mixed inoculation of PRSV W-CI and CMV in horn melon and muskmelon plants, respectively. Although other recombinants, including WAC-MP, WAC-CPn, and WAC-CPc were ineffective against PRSV W-CI or CMV, alone or together, they still delayed the symptom development for at least 10-15 days, indicating partial protection effectiveness.

Our results showed that WAC-derived bivalent vaccines have great potential for managing aphid-borne cucurbit viruses. Table of Contents Acknowledgment T7. 1 dÀIDNETH Laipss6t0gR43ELDEGGESEGEDEIBEUSEEICEHGBESEGEEEUENHARDERISSEGESEHSIAVEEEIEIEGH-DDEEHSREEIERESRGSNSiiS@moasassi il TEAS CLE CONE IRG sitactescres sates dbs tri es scalable diel da lcs iv ListOf table su nang ngu0 tá Ga 4Ä8138351SSGIARIEGBIGIGSi30000800ã0-006033ãẸ8 SSES.GIRSRSHERRGSHìAG4ã0500034N8A4ãSĐOG8SG3X3SBggsaSE Vili LAS Of T1SUPES. ccrecereaneseeeresenunaennencennnrereannmencmcreninmcmner arcane ix Chapter 1: Literature review and research obj€CfÏV€S.- ch nghệ, 1 Literature TEC OW ten .nesapcimsnan set sarmeneadlnm ame Gere eas eee aR 2 Aphid-borne viruses threatening the production of cucurbits worÏdwide.- --- --‹--s>-+ 2 Papaya ringspot virus (PRSV).

náo ho da 22 0 da Hà ngà 2 Zucchini yellow mosaic’ virus (ZY M VQ Mạ. 4 Cucumber mosaic virus (CMV). 5 The role of helper component-protease (HC-Pro) and coat protein genes (CP) of OfyVHTUSSGS. ee on ee oe ee ee ý The role of the movement protein (MP) and the coat protein (CP) of CMV.

- 9 Strategies for controlling aphid-borne viruses infecting cucurb1S. Agricultural practi ces csssesscsssesensnacenaeniamnennmeanmnnee terme 10 2. 10 Se PCACIIS LOT TESISIANCE puo tong vesensemsntnrvenasriaearianwumrer eens 11 4. PLANS PENIS TESISLANCE wesvicscasncannmsannenerunsannsuartas ceents oxen zenteneassiaaies rset asninanat eneesetedcovamanes 11 5.

Cross protection = vaccination with a mild VirUs. cece eeccecceeteeeceeneeeeeeeneeeees 12 MMechanilsffi öf6†055 Pr Ol6 Ct OD line sònndsbbotibtoaGITG1ABEOSSA181i54599G1G408338810011ÐĐTSEISSSSEESENHBIS4E22300054 12 Methods to create effective mild strains for cross DTOf€CfIOH.- ¿52 22+ S2 *+£+svesrerrrsres l5 A proper mild strain is a prerequisite for cross DTOf€CfIOH1.-- 56 2c SE S+vsreeerrsreree 14 The advantages and disadvantages of cross-protectiOn .:cceccecceceeceesceseeseeseeseeeeceneeerensenes 15 Control the mixed infection by cross protection 1n CUCULDItS.eceeceeeesceeteeeeceneceseeeseeeeees 16 Objectives of the Study 121. 18 FRGICTON CGS sua gsxscottisg65200210554054G1133gã0605308800856038/25855.ã680ữ/35 gi48308S23538ò302S3E5801G3086i08S0388g880đ/0:G001830Ó80590/588::3385888 19 Chapter 2: Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by fwo-in-one yaccine. Ee sun Biaariane CS Men neeneneesvneesonesvenesnornerenenneesnaesensneeseerssenns 33 AD StHA CL as csscssssussaszasscsanass ous svanaausnascsiss LÔ, CME AEN ẤP.gE+ 34 TNtOdUCHON: cessceseeaxee cease emcee Ea womweneons means 00001161500 Đ801901554GE0910000151830880298 35 Materials and methods 7.

38 Plant néatertals and wirUSfSouff6S. 38 Co-infection of mild mutant PRSV HA5-1 and ZYMV-ZAC against two different severe potyviruses of PRSV P-HA and ZYMV-GFP in horn melon.-- --- 38 Modification of HC-Pro for the generation of mild mutant PRSV-WAC. 39 Inoculation of horn melon plants with PRSV-WAC, ZYMV-ZAC or both. 40 Examination of titer of PRSV and ZYMV.:ccccccsscssecsscssscesssencesneeseseecesscestecseenatonnee 41 Analysis of the RNA silencing suppression ability of mutated HC-Pros of PRSV and ZAC by aproInflÏlralOTiussescedsesssoiesoaaidsnpAG154082103841300135Y0ESGSĐNNSSEIRNEYSRERMESSASEESEISSS3088 41 Cross protection effectiveness of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or together, against severe strains of PRSV W-CI and ZYMV-GFP under greenhouse CONCILL OTIS gọn no bn no ng A0 BEBE118014G118BASBEESILERGRISHISIRSESHASBEEAASEESGIGTOSKEISRESHHSEXEIGEIESERICHSSREEEDBSS4 42 SH ÍB cececemeunenin cone eeceieiidie ices Gaerne errr ee eerie 43 Co-infection of mild viruses PRSV P HAS-1 (HAS-1) and ZYMV-ZAC (ZAC) provides protection against severe isolates of cognate PRSV P-HA and ZYMV- GPP nho rire lon: DAHIESisssssssseseboseiineiibidBibLEihbsgSdlndlss2ddo39tE4B880X031AL2380G000813001010480888452880g186 43 Generation of attenuated mutant from PRSV W-CI by modification of the pathopenicity factOt Cs PO -erecccsessvesessmmsnersesinnay earner eecorasrersereenn este 91003100042070501301190930003888 43 Symptoms and accumulation dynamics of WAC and ZAC in co-infected horn melon pÏanfs.

ge BR aches ebay bi, BUD. Mee vaseasccteseonsinseeseavacanertecnesesenevnenstaves 44 Mutated HC-Pros of both PRSV and ZYMV have lower RNA silencing suppression abilities but without additive effect. cece eseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeteneeeeens 45 Co-infection of WAC and ZAC in horn melon, muskmelon, and watermelon plants provides complete or high degree of cross protection against both PRSV W-Cl and ZYMV-GED secsnsnoooorBEoonooooe ERUEEoosisoooEoooooikđ Ân nho nga gg sen 46 Discussion. 48 Acknowled ements s5 cá neo tu UIẤ couse 01641411013511E11NG1911835634815 138815) l srst02110001511661848338138% 32 References sine NATIONAL CHUNG HSIMG.

n1 vê, Đa Chapter 3: Development of bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbÏfS. - ---- 555cc ss+ecsxeecee 73 PS DSEL TỔ oi soucugiigtgix6055640534854054100638136i05g03036090335883ã28E5383039E0:80103809401a9880038G30084303546.G66 180116 SSO BaG SDRAM EE 74 Tntto duction ssssscsc2266560111100213401101401038100400340068081850S01SLREEGGEEEESSESAGEESEEIESUEAGEESEEIEEELEAXSEEEESZ9EEE4EE 75 Materials and methods. 78 ‘Vitus SOUICES and PLOPACALION boáa 6c iti6146L68%5036i240L9 38063 U5ug án GỆ4%SUNS 383 šg0g881438.5938205g BạxSgRukSi 78 Construction of PRSV W type mild strain WAC carrying CMV MP reading frame. 78 vi Construction of PRSV W mild strain WAC carrying different lengths of CMV CP T68 IHB (ATG eco cncteeniereennernnluniusies reentrant meuniere tere eES Evaluation for the pathogenicity of recombinant Viruses.

5 +5 +55 <++<xs++ Time-course accumulation levels of recombinants in horn melon planfs. Accumulation of the severe virus PRSV W-CI (W-C]) and CMV, alone or topether 1n HOt MELON Plats ie scessssrssaevrssnsmaveansaenscaenss 1853E814331G00.IAASIGSL-44GESESGSEEESSB The stability of individual recombinant viruses in C. Cross-protection effectiveness of individual recombinants against two unrelated Infectivity and cross-protection effectiveness of recombinant virus WAC-MP in hos Melon Plants ccccccceveserescmensee Me AO Mls enerecseenmcemmemmermreeme nme Infectivity of mild strain PRSV WAC carrying different lengths of the CP gene of Genetic stability of PRSV WAC carrying different lengths of CMV CP. Time-course accumulation levels of the PRSV WAC carrying different lengths of CMV-CP-vfusesNATIONAI.CHUHNG HSING UNIVERSITY.

scsssmmemsrnetatt eaves The mild recombinant WAC-CP provides high degrees of cross protection against both PRSV W-CI and CMV, alone or together, in horn melon and muskmelon vii List of tables Chapter 1 Table 1. The function of protein encoded by CMV RNAS .eecceeseeseeseceeeeteenseeeeeeeees 9 Chapter 2 Table 1. Cross protection effectiveness (in percentages) of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or in combination, against two different severe potyvirus strains of PRSV W-CI and ZYMYV-GFPP. c1 2 2211222111 2511 15211151511 eree 59 Supplementary Table S1.

Details of primers used in this study .