Kiểm soát đồng thời hai loại virus trong cây họ bầu bí

Luận án tiến sĩ nghiên cứu concurrent control of two different virus species in cucurbits by two in one or bivalent mild, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Thi-Ngoc-Bich Tran
• Người hướng dẫn: Dr. Shyi-Dong Yeh
• Trường học: National Chung Hsing University
• Chuyên ngành: Plant Pathology
• Đề tài: Kiểm Soát Đồng Thời Hai Loại Virus Trong Cây Họ Bầu Bí Bằng Vắc-Xin Hai Trong Một
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Taiwan

Mục lục chi tiết

• Acknowledgments
• Abstract
• 1. CHƯƠNG 1: Literature review and research objectives
• 1.1. Aphid-borne viruses threatening the production of cucurbits worldwide
• 1.2. Papaya ringspot virus (PRSV)
• 1.3. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
• 1.4. Cucumber mosaic virus (CMV)
• 1.5. The role of helper component-protease (HC-Pro) and coat protein genes (CP) of OfyVHTUSSGS
• 1.6. The role of the movement protein (MP) and the coat protein (CP) of CMV
• 1.7. Strategies for controlling aphid-borne viruses infecting cucurbits
• 1.8. Agricultural practices
• 1.9. Cross protection = vaccination with a mild virus
• 1.10. Methods to create effective mild strains for cross protection
• 1.11. A proper mild strain is a prerequisite for cross protection
• 1.12. The advantages and disadvantages of cross-protection
• 1.13. Control the mixed infection by cross protection in cucurbits
• 1.14. Objectives of the Study
• 2. CHƯƠNG 2: Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by two-in-one vaccine
• 2.1. Introduction
• 2.2. Materials and methods
• 2.3. Plant materials and virus sources
• 2.4. Co-infection of mild mutant PRSV HA5-1 and ZYMV-ZAC against two different severe potyviruses of PRSV P-HA and ZYMV-GFP in horn melon
• 2.5. Modification of HC-Pro for the generation of mild mutant PRSV-WAC
• 2.6. Inoculation of horn melon plants with PRSV-WAC, ZYMV-ZAC or both
• 2.7. Examination of titer of PRSV and ZYMV
• 2.8. Analysis of the RNA silencing suppression ability of mutated HC-Pros of PRSV and ZAC
• 2.9. Cross protection effectiveness of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or together, against severe strains of PRSV W-CI and ZYMV-GFP under greenhouse conditions
• 2.10. Co-infection of mild viruses PRSV P HAS-1 (HAS-1) and ZYMV-ZAC (ZAC) provides protection against severe isolates of cognate PRSV P-HA and ZYMV-GPP
• 2.11. Generation of attenuated mutant from PRSV W-CI by modification of the pathogenicity factor
• 2.12. Symptoms and accumulation dynamics of WAC and ZAC in co-infected horn melon plants
• 2.13. Mutated HC-Pros of both PRSV and ZYMV have lower RNA silencing suppression abilities but without additive effect
• 2.14. Co-infection of WAC and ZAC in horn melon, muskmelon, and watermelon plants provides complete or high degree of cross protection against both PRSV W-CI and ZYMV-GED
• 2.15. Discussion
• Acknowledgments
• References
• 3. CHƯƠNG 3: Development of bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbits
• 3.1. Introduction
• 3.2. Materials and methods
• 3.3. Virus sources and propagation
• 3.4. Construction of PRSV W type mild strain WAC carrying CMV MP reading frame
• 3.5. Construction of PRSV W mild strain WAC carrying different lengths of CMV CP
• 3.6. Evaluation for the pathogenicity of recombinant viruses
• 3.7. Time-course accumulation levels of recombinants in horn melon plants
• 3.8. Accumulation of the severe virus PRSV W-CI (W-CI) and CMV, alone or together in horn melon plants
• 3.9. The stability of individual recombinant viruses
• 3.10. Cross-protection effectiveness of individual recombinants against two unrelated viruses
• 3.11. Infectivity and cross-protection effectiveness of recombinant virus WAC-MP in horn melon plants
• 3.12. Infectivity of mild strain PRSV WAC carrying different lengths of the CP gene
• 3.13. Genetic stability of PRSV WAC carrying different lengths of CMV CP
• 3.14. Time-course accumulation levels of the PRSV WAC carrying different lengths of CMV-CP viruses
• 3.15. The mild recombinant WAC-CP provides high degrees of cross protection against both PRSV W-CI and CMV, alone or together, in horn melon and muskmelon

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vắc xin 2 Trong 1 Cho Cây Họ Bầu Bí 55 ký tự

Cây họ bầu bí như dưa chuột, bí ngô, dưa hấu, dưa lê là những cây trồng quan trọng về mặt kinh tế. Tuy nhiên, chúng dễ bị nhiễm nhiều loại virus gây thiệt hại đáng kể. Trong số đó, ba loại virus phổ biến và gây hại nhất là papaya ringspot virus (PRSV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) và cucumber mosaic virus (CMV). Phương pháp kiểm soát virus truyền thống thường gặp nhiều khó khăn và tốn kém. Nghiên cứu gần đây đã tập trung vào việc phát triển vắc-xin cho cây họ bầu bí, đặc biệt là vắc-xin hai trong một, để kiểm soát đồng thời nhiều loại virus. Vắc-xin này hứa hẹn mang lại giải pháp hiệu quả và bền vững cho người trồng trọt. Theo nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich, vắc-xin hai trong một có thể cung cấp khả năng bảo vệ đồng thời chống lại hai loại virus khác nhau, giảm chi phí và công sức so với việc sử dụng nhiều loại vắc-xin đơn lẻ.

1.1. Bệnh Virus Thường Gặp ở Bầu Bí và Mức Độ Thiệt Hại

Các bệnh virus như khảm lá dưa chuột, đốm vòng dưa hấu và héo xanh vi khuẩn bầu bí gây ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng. PRSV gây bệnh đốm vòng trên đu đủ và các cây họ bầu bí. ZYMV gây bệnh khảm vàng trên bí xanh. CMV gây bệnh khảm lá trên dưa chuột. Mức độ thiệt hại do các virus này gây ra có thể lên đến 80-90% nếu không có biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc kiểm soát đồng thời nhiều loại virus là một thách thức lớn, đòi hỏi các giải pháp sáng tạo như vắc-xin phòng bệnh virus cho bầu bí.

1.2. Giới Thiệu Về Vắc xin Hai Trong Một và Ưu Điểm Nổi Bật

Vắc-xin hai trong một là một loại vắc-xin được thiết kế để bảo vệ cây trồng chống lại hai hoặc nhiều loại virus khác nhau cùng một lúc. Ưu điểm chính của loại vắc-xin này là giảm số lần tiêm chủng, tiết kiệm chi phí và công sức cho người nông dân. Nó cũng có thể giúp giảm nguy cơ phát triển các chủng virus kháng thuốc. Ưu điểm của vắc-xin hai trong một bao gồm tính tiện lợi, hiệu quả cao và khả năng kiểm soát đồng thời nhiều bệnh, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

II. Thách Thức Trong Phòng Trừ Virus Hại Bầu Bí Hiện Nay 57 ký tự

Việc phòng trừ virus hại bầu bí hiện nay gặp nhiều khó khăn do tính đa dạng của virus, khả năng lây lan nhanh chóng và sự thiếu hụt các biện pháp kiểm soát hiệu quả. Các biện pháp truyền thống như sử dụng thuốc trừ sâu chỉ có thể kiểm soát vector truyền bệnh (như rệp) chứ không thể tiêu diệt virus trực tiếp. Việc sử dụng giống kháng bệnh cũng gặp nhiều hạn chế do sự xuất hiện của các chủng virus mới, phá vỡ khả năng kháng bệnh của giống. Thêm vào đó, điều kiện thời tiết và canh tác không thuận lợi cũng làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Do đó, cần có những giải pháp mới, sáng tạo và bền vững hơn để giải quyết vấn đề này. Việc nghiên cứu và phát triển biện pháp phòng bệnh virus cho dưa chuột và các cây họ bầu bí khác là vô cùng quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực và thu nhập cho người nông dân.

2.1. Sự Đa Dạng Của Virus và Khả Năng Lây Lan Nhanh Chóng

Các loại virus gây bệnh cho cây họ bầu bí rất đa dạng, bao gồm PRSV, ZYMV, CMV và nhiều loại virus khác. Mỗi loại virus có các chủng khác nhau, với khả năng gây bệnh và phạm vi lây nhiễm khác nhau. Virus có thể lây lan qua nhiều con đường, bao gồm rệp, côn trùng khác, hạt giống, dụng cụ làm vườn và tiếp xúc trực tiếp giữa các cây. Tốc độ lây lan nhanh chóng của virus khiến cho việc kiểm soát dịch bệnh trở nên vô cùng khó khăn, đặc biệt là trong điều kiện canh tác mật độ cao.

2.2. Hạn Chế Của Các Biện Pháp Kiểm Soát Truyền Thống

Các biện pháp kiểm soát truyền thống như sử dụng thuốc trừ sâu để kiểm soát rệp có thể gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Việc sử dụng giống kháng bệnh có thể hiệu quả trong một thời gian ngắn, nhưng virus có thể tiến hóa và vượt qua khả năng kháng bệnh của giống. Các biện pháp canh tác như luân canh và vệ sinh đồng ruộng có thể giúp giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm, nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn virus. Do đó, cần có những giải pháp mới và hiệu quả hơn để kiểm soát virus gây bệnh cho cây họ bầu bí.

III. Phương Pháp Tạo Vắc xin Hai Trong Một Hiệu Quả 52 ký tự

Phương pháp tạo vắc-xin hai trong một hiệu quả cho cây họ bầu bí thường liên quan đến việc sử dụng các chủng virus suy yếu (mild strains) của hai hoặc nhiều loại virus khác nhau. Các chủng virus suy yếu này có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cây trồng mà không gây ra các triệu chứng bệnh nghiêm trọng. Vắc-xin có thể được tạo ra bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền để chèn các gen từ các loại virus khác nhau vào một chủng virus suy yếu duy nhất. Một phương pháp khác là sử dụng kỹ thuật đột biến định hướng để tạo ra các chủng virus suy yếu từ các chủng virus hoang dại (wild type). Nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich đã sử dụng cả hai phương pháp này để tạo ra các vắc xin kiểm soát bệnh khảm dưa chuột và các bệnh khác trên cây họ bầu bí.

3.1. Sử Dụng Chủng Virus Suy Yếu Mild Strains và Kỹ Thuật Di Truyền

Các chủng virus suy yếu được sử dụng trong vắc-xin phải có khả năng lây nhiễm và nhân lên trong cây trồng, nhưng không gây ra các triệu chứng bệnh nghiêm trọng. Kỹ thuật di truyền có thể được sử dụng để loại bỏ các gen gây bệnh từ virus hoặc để chèn các gen từ các loại virus khác nhau vào một chủng virus duy nhất. Việc lựa chọn chủng virus suy yếu phù hợp và sử dụng kỹ thuật di truyền chính xác là rất quan trọng để tạo ra vắc-xin hiệu quả và an toàn.

3.2. Kỹ Thuật Đột Biến Định Hướng và Tạo Chủng Virus Suy Yếu

Kỹ thuật đột biến định hướng là một phương pháp tạo ra các chủng virus suy yếu bằng cách gây ra các đột biến cụ thể trong bộ gen của virus. Các đột biến này có thể làm giảm khả năng gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm và nhân lên của virus. Việc sử dụng kỹ thuật đột biến định hướng cho phép tạo ra các chủng virus suy yếu có đặc tính mong muốn và có thể được sử dụng để tạo ra vắc-xin hiệu quả.

IV. Quy Trình Tiêm Vắc xin 2 Trong 1 Cho Bầu Bí Đúng Cách 59 ký tự

Quy trình tiêm vắc-xin cho cây họ bầu bí cần tuân thủ các nguyên tắc nghiêm ngặt để đảm bảo hiệu quả và an toàn. Thời điểm tiêm vắc-xin thường là giai đoạn cây con, khi cây còn non và hệ miễn dịch dễ dàng được kích thích. Liều lượng vắc-xin cần được xác định dựa trên loại cây, kích thước cây và mức độ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Phương pháp tiêm có thể bao gồm phun lên lá, tiêm vào thân hoặc rễ. Sau khi tiêm, cây cần được theo dõi chặt chẽ để đảm bảo không có phản ứng phụ và đánh giá hiệu quả của vắc-xin. Theo kinh nghiệm, việc tuân thủ đúng quy trình giúp vắc-xin phòng bệnh virus cho bầu bí phát huy tối đa hiệu quả.

4.1. Thời Điểm Tiêm Vắc xin Thích Hợp và Các Lưu Ý Quan Trọng

Thời điểm tiêm vắc-xin thích hợp là giai đoạn cây con, khi cây còn non và hệ miễn dịch dễ dàng được kích thích. Cần tránh tiêm vắc-xin khi cây đang bị stress do các yếu tố như thiếu nước, thiếu dinh dưỡng hoặc bị nhiễm bệnh khác. Trước khi tiêm, cần đảm bảo rằng cây đã được tưới nước đầy đủ và được bón phân cân đối. Việc chuẩn bị kỹ lưỡng trước khi tiêm sẽ giúp tăng cường hiệu quả của vắc-xin.

4.2. Liều Lượng Vắc xin và Phương Pháp Tiêm Hiệu Quả Nhất

Liều lượng vắc-xin cần được xác định dựa trên loại cây, kích thước cây và mức độ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Thông thường, liều lượng vắc-xin được khuyến cáo là khoảng 1-2 ml/cây. Phương pháp tiêm có thể bao gồm phun lên lá, tiêm vào thân hoặc rễ. Phương pháp tiêm hiệu quả nhất là tiêm vào thân, vì nó giúp vắc-xin tiếp cận trực tiếp với hệ thống mạch dẫn của cây.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Về Hiệu Quả Vắc xin Hai Trong Một 58 ký tự

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng vắc-xin hai trong một có hiệu quả cao trong việc kiểm soát đồng thời hai hoặc nhiều loại virus gây bệnh cho cây họ bầu bí. Theo nghiên cứu của Tran Thi-Ngoc-Bich, việc sử dụng vắc-xin hai trong một có thể giúp giảm thiểu đáng kể thiệt hại do virus gây ra, tăng năng suất và chất lượng cây trồng. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng vắc xin kiểm soát bệnh khảm dưa chuột và các bệnh khác có thể kéo dài thời gian bảo vệ của cây trồng, giúp giảm số lần tiêm chủng và tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên, hiệu quả của vắc-xin có thể khác nhau tùy thuộc vào loại cây, chủng virus và điều kiện canh tác.

5.1. Mức Độ Bảo Vệ và Ảnh Hưởng Đến Năng Suất Cây Trồng

Vắc-xin hai trong một có thể cung cấp mức độ bảo vệ cao cho cây trồng, giúp giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vắc-xin có thể giảm số lượng cây bị nhiễm bệnh, giảm mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng bệnh và tăng năng suất cây trồng. Mức độ bảo vệ và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng có thể khác nhau tùy thuộc vào loại cây, chủng virus và điều kiện canh tác.

5.2. So Sánh Với Các Phương Pháp Kiểm Soát Virus Khác

So với các phương pháp kiểm soát virus khác, như sử dụng thuốc trừ sâu và giống kháng bệnh, vắc-xin hai trong một có nhiều ưu điểm vượt trội. Vắc-xin không gây hại cho môi trường và sức khỏe con người, không tạo ra các chủng virus kháng thuốc và có thể cung cấp khả năng bảo vệ lâu dài. Tuy nhiên, vắc-xin cũng có một số nhược điểm, như chi phí ban đầu cao và yêu cầu kỹ thuật tiêm chủng cao.

VI. Hướng Phát Triển Vắc xin Cho Cây Họ Bầu Bí Tương Lai 56 ký tự

Hướng phát triển vắc-xin cho cây họ bầu bí trong tương lai tập trung vào việc tạo ra các loại vắc-xin đa chủng, có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại virus khác nhau. Nghiên cứu cũng đang tập trung vào việc phát triển các phương pháp tiêm chủng đơn giản và hiệu quả hơn, giúp giảm chi phí và công sức cho người nông dân. Ngoài ra, việc nghiên cứu về cơ chế hoạt động của vắc-xin và tương tác giữa vắc-xin và cây trồng cũng rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin. Các nghiên cứu về cách sử dụng vắc-xin cho cây trồng đang được đẩy mạnh để ứng dụng rộng rãi hơn.

6.1. Phát Triển Vắc xin Đa Chủng và Phương Pháp Tiêm Chủng Mới

Việc phát triển vắc-xin đa chủng, có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại virus khác nhau, là một hướng đi quan trọng trong tương lai. Các phương pháp tiêm chủng mới, như sử dụng robot tiêm chủng hoặc phát triển vắc-xin dạng phun sương, cũng đang được nghiên cứu để giúp giảm chi phí và công sức cho người nông dân.

6.2. Nghiên Cứu Về Cơ Chế Hoạt Động và Tương Tác Giữa Vắc xin và Cây Trồng

Nghiên cứu về cơ chế hoạt động của vắc-xin và tương tác giữa vắc-xin và cây trồng là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin. Các nghiên cứu này có thể giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vắc-xin, như loại cây, chủng virus, điều kiện canh tác và thời điểm tiêm chủng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sản xuất cây trồng thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) như dưa hấu (Citrullus lanatus), dưa lưới (Cucumis melo), dưa chuột (Cucumis sativus), bí ngô và bí đỏ (Cucurbita spp.) giữ vai trò kinh tế quan trọng trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu thống kê được ghi nhận trong nghiên cứu, sản lượng toàn cầu năm 2019 đạt 100,4 triệu tấn đối với dưa hấu, 27,5 triệu tấn đối với các loại dưa khác và 22,9 triệu tấn đối với bí ngô và bí đỏ. Tuy nhiên, hơn 50% các bệnh hại mới phát sinh trên cây họ bầu bí xuất phát từ virus, trong đó các loại virus truyền qua rệp (aphid-borne viruses) gây thiệt hại nghiêm trọng nhất. Ba loại virus phổ biến hàng đầu gồm: Papaya ringspot virus type W (PRSV W - chi Potyvirus), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV - chi Potyvirus) và Cucumber mosaic virus (CMV - chi Cucumovirus), có khả năng làm sụt giảm năng suất từ 30% đến 100%.

Các biện pháp phòng trừ truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế kỹ thuật:

• Biện pháp canh tác (nhà lưới, bạt phủ nylon, luân canh, tiêu hủy nguồn bệnh) tốn kém chi phí đầu tư và tiềm ẩn nguy cơ ô nhiễm môi trường từ rác thải nhựa UV.
• Biện pháp hóa học diệt rệp môi giới không đạt hiệu quả phòng bệnh do các virus này lan truyền theo phương thức không bền vững (non-persistent manner), rệp truyền hạt virus sang cây trước khi bị tiêu diệt bởi nồng độ thuốc gây chết.
• Biện pháp chọn tạo giống kháng tự nhiên gặp rào cản do nguồn gen kháng hạn chế, tốn nhiều thời gian và có thể bị phá vỡ tính kháng khi xuất hiện các chủng virus mới hoặc khi đồng nhiễm (chẳng hạn giống dưa chuột Shimson và Delilar kháng CMV bị mất tính kháng khi đồng nhiễm với ZYMV).
• Cây trồng biến đổi gen (transgenic plants) kháng virus bị kiểm soát nghiêm ngặt bởi các quy định an toàn sinh học thực phẩm tại nhiều quốc gia.

Bảo vệ chéo (cross protection) bằng cách sử dụng chủng virus nhược độc (mild strain) được xem là giải pháp sinh học phi chuyển gen hữu hiệu. Tuy nhiên, khoảng trống nghiên cứu lớn tồn tại trên thực địa: các chủng nhược độc cổ điển chỉ có khả năng bảo vệ đơn dòng trước các chủng độc cùng loài (homologous virus), trong khi hiện tượng đồng nhiễm (co-infection/mixed infection) giữa PRSV W với ZYMV, hoặc PRSV W với CMV diễn ra phổ biến (ví dụ tại Việt Nam, Đài Loan, Hoa Kỳ, Brazil, Iran, Síp). Trước đây, việc phối hợp các chủng nhược độc khác nhau thường dẫn đến tương tác hiệp đồng làm tăng độc lực (synergism) hoặc chỉ tạo ra sự bảo vệ cục bộ, chưa có hệ thống vaccine nào kiểm soát đồng thời hai loài virus khác loài mà không gây hại cho cây ký chủ.

Mục tiêu và giả thuyết nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể:

1. Đánh giá tính khả thi của việc phối hợp hai chủng nhược độc PRSV P HA5-1 và ZYMV-ZAC nhằm kiểm soát đồng thời hai chủng virus độc lực cao PRSV P-HA và ZYMV-GFP trên cây dưa gai (Cucumis metuliferus).
2. Tạo chủng nhược độc PRSV W (ký hiệu là WAC) từ dòng vô tính lây nhiễm (infectious clone) của chủng độc PRSV W-CI thông qua kỹ thuật đột biến điểm định hướng trên gen mã hóa protein ức chế câm lặng gen HC-Pro (tại các motif FRNK và PD), đồng thời đánh giá độ ổn định di truyền, hoạt tính ức chế RNA silencing và động thái tích lũy virus.
3. Thiết lập công thức vaccine phối hợp "hai trong một" (two-in-one vaccine) giữa PRSV-WAC và ZYMV-ZAC để phòng trừ đồng thời hai potyvirus PRSV W và ZYMV trên các cây ký chủ bầu bí (Cucumis metuliferus, Cucumis melo, Citrullus lanatus).
4. Phát triển các cấu trúc vaccine nhị giá (bivalent vaccine) trên nền khung virus nhược độc WAC mang khung đọc mở của protein vận chuyển (MP) hoặc các đoạn kích thước khác nhau của protein vỏ (CP) từ virus CMV (gồm WAC-MP, WAC-CP, WAC-CPn, WAC-CPc) nhằm kiểm soát đồng thời PRSV W và CMV.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Các chủng virus PRSV (type P, type W gồm chủng độc W-CI và chủng nhược độc WAC, HA5-1), ZYMV (chủng độc ZYMV-GFP, chủng nhược độc ZAC), CMV và các cấu trúc tái tổ hợp bivalent (WAC-MP, WAC-CP, WAC-CPn, WAC-CPc); các dòng cây ký chủ thuộc họ Cucurbitaceae (Cucumis metuliferus, Cucumis melo, Citrullus lanatus, Cucurbita moschata), Chenopodium quinoa và Nicotiana benthamiana.
• Không gian nghiên cứu: Phòng thí nghiệm và hệ thống nhà lưới cách ly của Khoa Bệnh học Thực vật (Department of Plant Pathology), Đại học Quốc lập Trung Hưng (National Chung Hsing University - NCHU), Đài Loan.
• Thời gian công bố: Tháng 7 năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các nhóm nghiên cứu và công trình khoa học nền tảng:

• Dịch tễ học và tác động của virus họ bầu bí: Doolittle (1916), Jensen (1949), Webb & Scott (1965), Greber (1978), Lisa et al. (1981), Purcifull (1984), Hseu et al. (1987), Bateson et al. (2002), Revill et al. (2004), Ha et al. (2008), Coutts et al. (2011), Ali et al. (2012), Romay et al. (2014), Pozzi et al. (2020), Gadhave et al. (2020), Chan et al. (2020), Grumet et al. (2021). Các nghiên cứu chỉ ra rằng PRSV W chiếm 47% và CMV chiếm 27% mẫu nhiễm tại Việt Nam (Revill et al. 2004); tại Đài Loan, PRSV W xuất hiện trên 43% mẫu bí (Chan et al. 2020).
• Cấu trúc hệ gen Potyvirus và chức năng của HC-Pro: Yeh et al. (1992), Carrington et al. (1989), Kasschau & Carrington (1995, 2001), Maia et al. (1996), Blanc et al. (1997), Pruss et al. (1997), Chung et al. (2008), Revers & Garcia (2015), Inoue-Nagata et al. (2022). Protein HC-Pro giữ vai trò quyết định tính độc (pathogenicity factor), truyền bệnh qua rệp và là protein ức chế hệ thống câm lặng gen sau phiên mã của cây chủ (post-transcriptional gene silencing - PTGS).
• Cấu trúc hệ gen và chức năng các protein của CMV: Bujarski et al. (2019), Scholthof et al. (2011), Kim et al. (2004), Salanki et al. (2011), Takeshita et al. (2001), Mochizuki & Ohki (2011), Nemes et al. (2017), Li et al. (2020).
• Cơ chế và ứng dụng bảo vệ chéo: McKinney (1929), Fulton (1986), Lecoq et al. (1991), Yeh & Gonsalves (1984, 1994), Gal-On (2000), Lin et al. (2007), Ziebell & Carr (2010), Kung et al. (2014), Pechinger et al. (2019), Tuo et al. (2020), Do et al. (2021), Raja et al. (2022a, 2022b), Tran et al. (2022).
• Nghiên cứu về đồng nhiễm và vaccine đa giá: Kosaka & Fukunishi (1997) thử nghiệm tiêm ba chủng nhược độc của ZYMV, WMV và CMV trên dưa chuột nhưng ghi nhận hiện tượng tương tác hiệp đồng làm nặng triệu chứng và chỉ đạt hiệu quả bảo vệ một phần; You et al. (2005) tạo thể khảm giữa PRSV P và W; Taki et al. (2013) sử dụng vector ALSV.

Vị trí của luận án: Kế thừa các phát hiện về đột biến trên motif FRNK và PD/PE của HC-Pro (Lin et al. 2007, Chiang et al. 2007), luận án đã giải quyết hạn chế của các nghiên cứu tiền nhiệm bằng cách tạo đột biến có chủ đích để triệt tiêu tính ức chế PTGS vừa đủ, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng hiệp đồng bệnh hại khi kết hợp hai chủng nhược độc, đồng thời xây dựng thành công chủng nhược độc tái tổ hợp nhị giá mang đoạn gen dị nguồn của Cucumovirus trên khung Potyvirus.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

1. Cơ chế bảo vệ chéo (Cross protection): Giải thích qua 3 pha tương tác ký chủ - virus:
   • Cơ chế câm lặng RNA (RNA silencing/PTGS): dsRNA của virus bảo vệ kích hoạt cơ chế miễn dịch phân hủy đặc hiệu RNA của virus xâm nhập có trình tự tương đồng.
   • Cơ chế kháng qua trung gian protein (Protein-mediated resistance): Protein của virus nhược độc cản trở quá trình cởi vỏ (uncoating), cạnh tranh hoặc cô lập các yếu tố tế bào cây chủ cần cho sự nhân lên và lan truyền của virus độc.
   • Cơ chế kích hoạt miễn dịch tự nhiên (Innate immunity) qua con đường truyền tín hiệu salicylic acid (SA).
2. Mô hình tích lũy zic-zắc (Zigzag accumulation pattern): Chủng nhược độc lý tưởng có nồng độ virus ban đầu tăng cao để kích hoạt RNA silencing của cây, sau đó tụt giảm nhanh do bị hệ thống phòng thủ của cây chủ khống chế (do khiếm khuyết khả năng ức chế silencing của HC-Pro), cuối cùng duy trì ở mức cân bằng dao động thấp, không gây hại cho cây nhưng duy trì trạng thái miễn dịch.

Phương pháp nghiên cứu

• Kỹ thuật gây đột biến điểm định hướng (Site-directed mutagenesis): Sử dụng các mồi đặc hiệu để biến đổi nucleotide trên dòng vô tính cDNA lây nhiễm của PRSV W-CI, thay thế amino acid Arg thành Ile tại vị trí 181 (motif FRNK, vị trí A) và Asp thành Asn tại vị trí 397 (motif PD, vị trí C) của gen HC-Pro, tạo chủng WAC.
• Kỹ thuật tạo dòng virus tái tổ hợp nhị giá: Chèn khung đọc mở MP (gen 3a), CP đầy đủ (full-length CP), đoạn CP đầu N (CPn) và đoạn CP đầu C (CPc) của CMV vào vùng tiếp giáp giữa gen P1 và HC-Pro của chủng WAC.
• Thử nghiệm lây nhiễm và đánh giá độ ổn định di truyền: Lây nhiễm cơ học trên cây chỉ thị Chenopodium quinoa (kiểm tra khả năng hình thành đốm hoại tử cục bộ) và Cucumis metuliferus; đánh giá độ bền vững cấu trúc gen qua 6 thế hệ truyền cây liên tiếp bằng RT-PCR và giải trình tự.
• Thử nghiệm ức chế RNA silencing (Agroinfiltration assay): Đồng thâm nhiễm Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện GFP cùng với các plasmid biểu hiện HC-Pro hoang dại hoặc đột biến trên lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana, soi dưới đèn UV và phân tích Western blot.
• Giám sát động học tích lũy virus (Time-course accumulation): Đo lường nồng độ kháng nguyên virus theo chuỗi thời gian bằng kỹ thuật miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp (Indirect ELISA) sử dụng kháng thể đa dòng đặc hiệu kháng PRSV CP và ZYMV CP.
• Thử nghiệm bảo vệ chéo trong nhà kính: Tiêm chủng bảo vệ trên cây con ở giai đoạn 2 lá thật, sau đó thử thách bằng virus độc lực cao (PRSV W-CI, ZYMV-GFP, CMV) đơn lẻ hoặc phối hợp; theo dõi chỉ số biểu hiện triệu chứng bệnh và phân tích tỷ lệ bảo vệ phần trăm (%).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Literature review and research objectives (Tổng quan tài liệu và mục tiêu nghiên cứu)

Chương này tổng kết cơ sở lý luận về phân loại học, cấu trúc hệ gen của Potyvirus và Cucumovirus, phân tích chi tiết vai trò của từng protein chức năng và tổng hợp các báo cáo dịch tễ học tại Đài Loan, Việt Nam và thế giới.

Bảng 1 trong Chương 1 tổng hợp chức năng các protein do bộ gen phân đoạn của CMV mã hóa:

Phân đoạn RNA	Protein mã hóa	Chức năng chính
RNA1	1a	Sao chép hệ gen virus (Replication of the viral genome)
RNA2	2a	Hoạt tính RdRp, tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép virus
Subgenomic RNA4A	2b	Ảnh hưởng đến sự lây nhiễm toàn thân, ức chế câm lặng gen của cây
RNA3	MP (3a)	Giúp virus di chuyển từ tế bào sang tế bào và di chuyển đường dài
Subgenomic RNA4	CP	Quyết định duy nhất cho sự truyền bệnh qua côn trùng môi giới rệp

Chương 1 làm rõ vai trò đa chức năng của protein HC-Pro ở Potyvirus: tham gia truyền bệnh qua rệp nhờ motif KITC và PTK, tự cắt polyprotein, ức chế PTGS, hỗ trợ di chuyển tế bào và nhân bản virus. Đồng thời, chương này thiết lập mục tiêu khoa học nhằm giải quyết vấn đề đồng nhiễm không thể kiểm soát bằng phương pháp bảo vệ chéo truyền thống.

Chương 2: Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by two-in-one vaccine (Kiểm soát đồng thời hai potyvirus truyền qua rệp trên cây họ bầu bí bằng vaccine hai trong một)

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm quan trọng về việc tạo chủng nhược độc WAC và kết hợp với ZAC thành vaccine "hai trong một":

• Thử nghiệm tiền đề: Tiêm đồng thời hai chủng nhược độc HA5-1 (PRSV P) và ZAC (ZYMV) trên cây dưa gai (Cucumis metuliferus) mang lại khả năng bảo vệ hoàn toàn trước sự tấn công đồng thời của hai chủng độc PRSV P-HA và ZYMV-GFP.
• Tạo chủng đột biến PRSV WAC: Thực hiện đột biến điểm kép R181I và D397N trên HC-Pro của PRSV W-CI. Chủng WAC tạo triệu chứng lốm đốm rất nhẹ ban đầu trên lá dưới và sau đó cây phục hồi hoàn toàn không triệu chứng (symptomless recovery), không tạo đốm hoại tử trên C. quinoa.
• Động học tích lũy và hoạt tính ức chế PTGS: WAC biểu hiện mô hình tích lũy zic-zắc đặc trưng. Thử nghiệm Agroinfiltration trên N. benthamiana chứng minh HC-Pro của WAC và ZAC bị suy giảm rõ rệt khả năng ức chế RNA silencing so với kiểu dại; đặc biệt, khi trộn lẫn hai protein HC-Pro đột biến này, không xuất hiện hiệu ứng cộng gộp (no additive effect) làm tăng khả năng ức chế PTGS.
• Đánh giá hiệu quả bảo vệ chéo:

Chủng bảo vệ	Chủng thử thách (Challenge virus)	Tỷ lệ bảo vệ trên C. metuliferus (%)	Tỷ lệ bảo vệ trên C. melo (%)	Tỷ lệ bảo vệ trên C. lanatus (%)
PRSV-WAC	PRSV W-CI	100	100	100
PRSV-WAC	ZYMV-GFP	0	0	0
ZYMV-ZAC	ZYMV-GFP	100	100	100
ZYMV-ZAC	PRSV W-CI	0	0	0
WAC + ZAC	PRSV W-CI + ZYMV-GFP	100	100	100

Kết quả chứng minh công thức phối hợp WAC và ZAC không xảy ra hiện tượng can thiệp tiêu cực lẫn nhau về tích lũy, không gây tương tác hiệp đồng tăng nặng bệnh và bảo vệ hoàn toàn cả ba loài cây bầu bí trước sự tấn công đơn lẻ hoặc đồng nhiễm của PRSV W và ZYMV.

Chương 3: Development of bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbits (Phát triển vaccine nhị giá nhược độc để kiểm soát đồng thời Papaya ringspot virus và Cucumber mosaic virus trên cây họ bầu bí)

Chương này tập trung phát triển các chủng virus tái tổ hợp nhị giá trên khung của chủng WAC nhằm phòng ngừa đồng thời PRSV W và CMV:

• Thiết kế cấu trúc tái tổ hợp: Chèn các đoạn gen của CMV vào khung WAC, tạo ra 4 dòng: WAC-MP (mang gen MP), WAC-CP (mang gen CP đầy đủ), WAC-CPn (mang đoạn CP đầu N) và WAC-CPc (mang đoạn CP đầu C).
• Tính lây nhiễm và độ ổn định di truyền: Cả 4 cấu trúc tái tổ hợp đều gây nhiễm toàn thân không triệu chứng trên cây dưa gai (C. metuliferus), tương tự như chủng gốc WAC, và không gây vết thương cục bộ trên C. quinoa. Các chủng WAC-CP, WAC-CPn và WAC-CPc duy trì tính ổn định di truyền nguyên vẹn sau 6 thế hệ truyền cây liên tiếp. Động thái tích lũy của các chủng tái tổ hợp vẫn duy trì theo mô hình zic-zắc.
• Hiệu quả bảo vệ chéo của chủng tái tổ hợp WAC-CP:
  • Khi thử thách đơn lẻ với PRSV W-CI hoặc CMV trên C. metuliferus, WAC-CP cung cấp khả năng bảo vệ hoàn toàn (100%).
  • Khi thử thách đồng nhiễm phức hợp cả hai virus độc PRSV W-CI và CMV: WAC-CP đạt hiệu quả bảo vệ 93% trên C. metuliferus và 77% trên cây dưa lưới (Cucumis melo).
  • Các cấu trúc tái tổ hợp khác (WAC-MP, WAC-CPn, WAC-CPc) không ngăn chặn hoàn toàn được sự xâm nhiễm nhưng giúp trì hoãn thời gian phát sinh triệu chứng bệnh của virus độc từ 10 đến 15 ngày so với đối chứng không được bảo vệ.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận khoa học

• Luận án đã làm sáng tỏ cơ chế điều hòa tính độc lực của Potyvirus thông qua hai motif chức năng FRNK (vị trí amino acid 181) và PD (vị trí amino acid 397) trên protein HC-Pro của PRSV W, xác lập rằng việc đột biến đồng thời hai vị trí này làm suy giảm có kiểm soát khả năng ức chế RNA silencing (PTGS).
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định việc dung hòa hai chủng nhược độc mang đột biến HC-Pro (WAC và ZAC) không tạo ra hiệu ứng cộng gộp ức chế PTGS, qua đó triệt tiêu hoàn toàn hiện tượng tương tác hiệp đồng (synergism) vốn là rào cản lớn nhất trong các nghiên cứu đồng nhiễm trước đây.
• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng một Potyvirus nhược độc làm vector mang phân đoạn gen ngoại lai từ một họ virus khác (Bromoviridae) để kích hoạt cơ chế miễn dịch chéo nhị giá.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Tạo thành công chủng nhược độc PRSV WAC có tính di truyền ổn định, không gây hại cho sinh trưởng của cây trồng và không hình thành triệu chứng bệnh nặng.
• Đề xuất giải pháp vaccine phối hợp "hai trong một" (WAC + ZAC) có khả năng bảo vệ 100% trước hai loại bệnh virus nguy hiểm nhất trên dưa gai, dưa lưới và dưa hấu.
• Phát triển thành công vaccine tái tổ hợp nhị giá WAC-CP đầu tiên kiểm soát đồng thời PRSV W và CMV, đạt tỷ lệ bảo vệ từ 77% đến 93% khi bị đồng nhiễm nặng.
• Cung cấp giải pháp kỹ thuật sinh học phi chuyển gen an toàn, dễ nhân nuôi và lưu giữ nguồn mẫu trên cây ký chủ trung gian Cucumis metuliferus.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Toàn bộ các đánh giá hiệu lực bảo vệ chéo của vaccine phối hợp và vaccine nhị giá trong luận án mới chỉ được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới cách ly có kiểm soát, chưa trải qua khảo nghiệm trên quy mô đồng ruộng lớn với mật độ côn trùng môi giới tự nhiên cao. Ngoài ra, hiệu quả bảo vệ của cấu trúc WAC-CP trên dưa lưới (77%) còn thấp hơn so với trên dưa gai (93%), và các cấu trúc phân đoạn (WAC-MP, WAC-CPn, WAC-CPc) mới chỉ đạt mức độ bảo vệ một phần (làm chậm triệu chứng 10-15 ngày).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiến hành các khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng để kiểm tra độ bền vững của vaccine dưới áp lực truyền bệnh tự nhiên của rệp; nghiên cứu tối ưu hóa trình tự biểu hiện của WAC-CP nhằm nâng cao tỷ lệ bảo vệ trên các giống dưa thương phẩm; đánh giá chi tiết cơ chế tương tác ở cấp độ phân tử giữa protein CP của CMV biểu hiện từ vector WAC với hệ thống miễn dịch bẩm sinh của từng loài cây họ bầu bí.

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, giảng viên và nhà khoa học chuyên ngành Bệnh học thực vật, Virus học thực vật và Công nghệ sinh học nông nghiệp: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thiết kế đột biến điểm định hướng trên hệ gen RNA virus kích thước lớn, kỹ thuật đánh giá hoạt tính ức chế PTGS bằng agroinfiltration và chiến lược thiết kế vector virus thực vật mang gen ngoại lai.
• Đối với các nhà chọn tạo giống và chuyên viên bảo vệ thực vật: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về tương tác đồng nhiễm virus trên các cây trồng họ Cucurbitaceae, mở ra hướng ứng dụng vaccine sinh học thực vật không chuyển gen để quản lý dịch bệnh trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng nhược độc PRSV WAC được tạo ra như thế nào và mang các đột biến cụ thể nào?

Chủng nhược độc WAC được tạo ra bằng kỹ thuật đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) từ dòng vô tính cDNA lây nhiễm của chủng độc PRSV W-CI. Hai đột biến điểm được thực hiện trên gen mã hóa protein HC-Pro gồm: thay thế amino acid Arginine bằng Isoleucine tại vị trí 181 (R181I thuộc motif FRNK, gọi là vị trí A) và thay thế Aspartic acid bằng Asparagine tại vị trí 397 (D397N thuộc motif PD, gọi là vị trí C). Chủng WAC cảm ứng triệu chứng khảm rất nhẹ ban đầu và sau đó cây hồi phục hoàn toàn không triệu chứng.

2. Tại sao việc kết hợp hai chủng nhược độc WAC và ZAC không gây ra hiện tượng hiệp đồng bệnh hại (synergism)?

Hiện tượng tương tác hiệp đồng làm tăng độc lực trong các ca đồng nhiễm tự nhiên thường xuất phát từ việc protein HC-Pro của potyvirus ức chế mạnh mẽ hệ thống phòng thủ RNA silencing của cây chủ, hỗ trợ cho virus thứ hai nhân lên. Ở chủng WAC và ZAC, các đột biến trên motif FRNK và PD/PE đã làm suy giảm chức năng ức chế PTGS của HC-Pro. Kết quả thử nghiệm Agroinfiltration trên lá Nicotiana benthamiana chứng minh hỗn hợp HC-Pro của WAC và ZAC không tạo ra hiệu ứng cộng gộp ức chế câm lặng gen, do đó cây chủ vẫn duy trì được cơ chế phòng ngự ở mức cân bằng mà không làm tăng nồng độ virus hay làm nặng triệu chứng.

3. Hiệu quả bảo vệ của vaccine nhị giá WAC-CP trước thách thức đồng nhiễm PRSV W và CMV đạt mức nào?

Cấu trúc WAC-CP (khung WAC mang toàn bộ khung đọc mở gen CP của CMV) cung cấp khả năng bảo vệ 100% trước thử thách đơn nhiễm của PRSV W-CI hoặc CMV trên cây dưa gai (Cucumis metuliferus). Khi thử thách đồng thời bằng cả hai virus độc PRSV W-CI và CMV, WAC-CP mang lại hiệu quả bảo vệ đạt 93% trên dưa gai (C. metuliferus) và 77% trên cây dưa lưới (Cucumis melo).

4. Các cấu trúc tái tổ hợp WAC-MP, WAC-CPn và WAC-CPc thể hiện hiệu quả bảo vệ ra sao so với WAC-CP?

Khác với WAC-CP mang gen CP toàn phần, các cấu trúc tái tổ hợp mang gen protein vận chuyển (WAC-MP) hoặc các đoạn cắt ngắn của protein vỏ (WAC-CPn mang đầu N, WAC-CPc mang đầu C) không mang lại sự bảo vệ hoàn toàn trước các chủng virus độc lực cao. Tuy nhiên, chúng có khả năng làm chậm thời gian khởi phát triệu chứng bệnh từ 10 đến 15 ngày so với cây đối chứng không được tiêm phòng, thể hiện hiệu lực bảo vệ một phần.

5. Mô hình tích lũy zic-zắc (zigzag pattern) phản ánh điều gì về cơ chế bảo vệ chéo của các chủng nhược độc trong luận án?

Mô hình tích lũy zic-zắc mô tả chu trình động học của virus nhược độc trong cây: nồng độ virus ban đầu tăng lên để kích hoạt hệ thống RNA silencing của cây chủ; tiếp theo, nồng độ virus tụt giảm mạnh do hệ miễn dịch của cây tấn công phân hủy RNA virus (vì HC-Pro đột biến không thể kháng cự hoàn toàn); cuối cùng, sự tương tác đạt trạng thái cân bằng động ở nồng độ virus thấp. Trạng thái cân bằng này duy trì mức độ RNA silencing thường trực trong tế bào, sẵn sàng nhận diện và phân hủy ngay lập tức hệ gen của virus độc cùng loài khi chúng xâm nhập.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Trần Thị Ngọc Bích đã giải quyết thành công bài toán kiểm soát đồng thời các phức hợp virus nguy hiểm truyền qua rệp trên cây họ bầu bí bằng phương pháp tiếp cận sinh học phi chuyển gen. Thông qua việc biến đổi chính xác các motif chức năng trên protein HC-Pro, tác giả đã tạo ra chủng nhược độc PRSV WAC ổn định, từ đó phát triển thành công hệ thống vaccine phối hợp "hai trong một" (WAC + ZAC) kháng PRSV W và ZYMV, cùng vaccine tái tổ hợp nhị giá WAC-CP kháng đồng thời PRSV W và CMV với hiệu quả bảo vệ cao. Các kết quả thực nghiệm đóng góp dữ liệu khoa học quan trọng cho lĩnh vực bệnh học thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng thực tiễn trong công tác quản lý dịch hại cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỊ 3 PRK 1ñ 1/0315 18 St A Department of Plant Pathology National Chung Hsing University EERE Doctoral Dissertation wig- F-H-ReEER TR PP ich EP? ñnijá2 TR a Concurrent control of two different virus species in cucurbits by two-in-one or bivalent mild vaccine eB: RHRGL SPA AI: PRISE Advisor: Dr. Shyi-Dong Yeh Co-advisor: Dr. Yuh-Kun Chen Student: Thi-Ngoc-Bich Tran PEA R- pots e#- 3 July, 2023 B] in Pl A 81/025 EE SA Tỷ + A AL a % M8 :š015—@—3 -ifE/EMEIRI)6M/S#+† mae 7 a i Š wa 4: RR EB # FH: _ 8107035003 & U 3Ä lễ 38 FF UL šế OA oh C48 FAIS: Air PRK #1 12 75 F AeA Ain PRK 1ñ 1 1ã 1E eS RAGE = wm R B+ HAY l l2 MARA: AHR # & R # ER 8|53% B ĐÁ, mk © HH + Ể BỊ >.82kÉ 4Š AEE HAE & ARE AR ‡ 8 wf + Bl ie #33 AMA AE PALE “at aS 2 TL #:iM|4- 4H14 + eit 6 34 mY Ro # + 4 BỊ ừ †? KE EAE FE BAS to 1 ÚÉ H+ Z3 Bib RAB Mee ARE BR e A 3S 8 t+ 6 § ae 19+ 14 re Đế. BỊ] từ PEK 181/075 18 St RAGE 4 Bh AEN IEE A aE > rễ ⁄ 8 wt oo (.

bp # R AB # --=~ w A +A HäH Acknowledgments I would like to sincerely thank Dr. Shyi-Dong Yeh and Dr. Yuh-Kun Chen for their guidance, encouragement, and support throughout my research. I would also like to thank Dr.

Fuh-Jyh Jan, Dr. Hui-Liang Wang, Dr. Shih-Shun Lin, Dr. Jun-Yi Yang, Dr.

Tsung-Chi Chen, and Dr. Chin-Chih Chen for participating in my dissertation committee. Their guidance has been invaluable throughout this entire process. Likewise, I would like to thank Dr.

Hao-Wen Cheng, Ms. Xing-Yun Xie, and Dr. Chung-Hao Huang for their teaching and assistance in my understanding of techniques during the experiment period. This work would not have been possible without their expertise.

I would like to thank all my lab members, Dr. Wen-Chi Hu, Ms. Ya-Ling Huang, Dr. Duy-Hung Do, Dr.

Thi-Thu-Yen Tran, Dr. Ya-Chi Lin, Ms. Reun-Ping Goh, Ms. Sine-Lan Wang, Mr.

Sang-You Lin, Ms. Fang-Yu Chang, Ms. Thi-Thuy-Linh Le, and Mr. Xuan-Tung Ngo for their abundant help in each of their own special ways from the first day that I came to the lab, and for making such a friendly environment in which to work.

Special thanks go to Dr. Nguyen Ngoc Thuy, and Dr. Shaw-Yhi Hwang for encouraging me to apply to the Ministry Of Education (MOE) Taiwan Scholarship. I would like to thank the Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University (Taiwan), and the Faculty of Agronomy at Nong Lam University - Ho Chi Minh City (Viet Nam) for supporting me during my Ph.

Finally, I special like to thank my husband, Nguyen Van Hong, for caring for my daughter Nguyen Ngoc Kim Ngan from 18 months old in Vietnam. Thank him and my family for their unconditional support, encouragement, and everything they have done for me during this time in NCHU. Also, I would like to thank all my teachers in Vietnam, who taught me knowledge and made me believe that biology is very interesting. Abstract Plants of the family Cucurbitaceae, such as cucumber, pumpkin, muskmelon, watermelon, and squash, are economically important cucurbit crops.

Among aphid- bore viruses, papaya ringspot virus (PRSV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and cucumber mosaic virus (CMV) are three common and prevalent viruses, causing severe losses in a wide range of cucurbit crops globally. In this study, co-infection of horn melon plants with two mild strains, HAS-1 and ZAC, previously developed mild mutants of PRSV P and ZYMV, respectively, confers concurrent protection against PRSV P type and ZYMV. In addition, mild mutants of PRSV W, denoted WAC, were created by site -directed mutagenesis through modifications of the pathogenicity motifs FRNK and PD in helper component-protease (HC-Pro). Plant of horn melon, muskmelon and watermelon pre-infected with WAC and ZAC showed no synergistic effects on severity and provided near complete protection against both PRSV W and ZYMV.

Subsequently, WAC was used as a backbone for the construction of recombinants carrying movement protein (MP) or different lengths of coat protein (CP) coding sequence of cucumber mosaic virus (CMV). The bivalent recombinant WAC-CP provided a high degree of cross protection for concurrent control of PRSV W and CMV in cucurbits. This dissertation is divided into three chapters as follows. Chapter 1 “Literature review and research objectives” This chapter describes all relevant references related to this study.

The objectives and experimental approaches of this study are also described. Chapter 2 “Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by two-in-one vaccine”. In this chapter, we first disclosed that co-infection of horn melon plants with two mild strains, HA5-1 and ZAC, the previously developed mild mutants of PRSV P and ZYMY\V, respectively, confers concurrent protection against PRSV P- type and ZYMV. Consequently, mild mutants of PRSV W, denoted WAC, were generated by site-directed mutagenesis through modifications of the pathogenicity motifs FRNK and PD in helper component-protease (HC-Pro).

Horn melon (Cucumis metuliferus) plants pre-inoculated with WAC and ZAC showed no apparent interference on viral accumulation with no synergistic effects on severity and provided complete protection against both PRSV W and ZYMV. Similar results were reproduced in muskmelon and watermelon plants, indicating the feasibility of a two-in-one vaccine for concurrent control of PRSV W and ZYMV in cucurbits. Chapter 3 “Development of mild bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbits”. A stable mild strain WAC was used as a backbone for generating bivalent vaccines for concurrent control of PRSV and CMV in cucurbits.

WAC recombinants carrying the CMV movement protein (MP) and different lengths of CMV-CP were constructed. The infectivity assay of individual recombinant constructs in horn melon plants indicated that the recombinants WAC-MP, WAC-CP, WAC-CPn, and WAC-CPc cause symptomless infection similar to WAC. In Chenopodium quinoa plants, all recombinants caused infection without local lesion. WAC-CP, WAC-CPn, and WAC- CPc were stable after six-generation transfers.

All recombinants retain a zigzag accumulation pattern and biological characteristics of WAC, inducing recovered mild symptoms on infected horn melon plants. For cross-protection evaluation, WAC-CP provided complete protection against the individual PRSV W-CI or CMV challenge in horn melon plants. Furthermore, WAC-CP provided 93% and 77% protection against mixed inoculation of PRSV W-CI and CMV in horn melon and muskmelon plants, respectively. Although other recombinants, including WAC-MP, WAC-CPn, and WAC-CPc were ineffective against PRSV W-CI or CMV, alone or together, they still delayed the symptom development for at least 10-15 days, indicating partial protection effectiveness.

Our results showed that WAC-derived bivalent vaccines have great potential for managing aphid-borne cucurbit viruses. Table of Contents Acknowledgment T7. 1 dÀIDNETH Laipss6t0gR43ELDEGGESEGEDEIBEUSEEICEHGBESEGEEEUENHARDERISSEGESEHSIAVEEEIEIEGH-DDEEHSREEIERESRGSNSiiS@moasassi il TEAS CLE CONE IRG sitactescres sates dbs tri es scalable diel da lcs iv ListOf table su nang ngu0 tá Ga 4Ä8138351SSGIARIEGBIGIGSi30000800ã0-006033ãẸ8 SSES.GIRSRSHERRGSHìAG4ã0500034N8A4ãSĐOG8SG3X3SBggsaSE Vili LAS Of T1SUPES. ccrecereaneseeeresenunaennencennnrereannmencmcreninmcmner arcane ix Chapter 1: Literature review and research obj€CfÏV€S.- ch nghệ, 1 Literature TEC OW ten .nesapcimsnan set sarmeneadlnm ame Gere eas eee aR 2 Aphid-borne viruses threatening the production of cucurbits worÏdwide.- --- --‹--s>-+ 2 Papaya ringspot virus (PRSV).

náo ho da 22 0 da Hà ngà 2 Zucchini yellow mosaic’ virus (ZY M VQ Mạ. 4 Cucumber mosaic virus (CMV). 5 The role of helper component-protease (HC-Pro) and coat protein genes (CP) of OfyVHTUSSGS. ee on ee oe ee ee ý The role of the movement protein (MP) and the coat protein (CP) of CMV.

- 9 Strategies for controlling aphid-borne viruses infecting cucurb1S. Agricultural practi ces csssesscsssesensnacenaeniamnennmeanmnnee terme 10 2. 10 Se PCACIIS LOT TESISIANCE puo tong vesensemsntnrvenasriaearianwumrer eens 11 4. PLANS PENIS TESISLANCE wesvicscasncannmsannenerunsannsuartas ceents oxen zenteneassiaaies rset asninanat eneesetedcovamanes 11 5.

Cross protection = vaccination with a mild VirUs. cece eeccecceeteeeceeneeeeeeeneeeees 12 MMechanilsffi öf6†055 Pr Ol6 Ct OD line sònndsbbotibtoaGITG1ABEOSSA181i54599G1G408338810011ÐĐTSEISSSSEESENHBIS4E22300054 12 Methods to create effective mild strains for cross DTOf€CfIOH.- ¿52 22+ S2 *+£+svesrerrrsres l5 A proper mild strain is a prerequisite for cross DTOf€CfIOH1.-- 56 2c SE S+vsreeerrsreree 14 The advantages and disadvantages of cross-protectiOn .:cceccecceceeceesceseeseeseeseeeeceneeerensenes 15 Control the mixed infection by cross protection 1n CUCULDItS.eceeceeeesceeteeeeceneceseeeseeeeees 16 Objectives of the Study 121. 18 FRGICTON CGS sua gsxscottisg65200210554054G1133gã0605308800856038/25855.ã680ữ/35 gi48308S23538ò302S3E5801G3086i08S0388g880đ/0:G001830Ó80590/588::3385888 19 Chapter 2: Concurrent control of two aphid-borne potyviruses in cucurbits by fwo-in-one yaccine. Ee sun Biaariane CS Men neeneneesvneesonesvenesnornerenenneesnaesensneeseerssenns 33 AD StHA CL as csscssssussaszasscsanass ous svanaausnascsiss LÔ, CME AEN ẤP.gE+ 34 TNtOdUCHON: cessceseeaxee cease emcee Ea womweneons means 00001161500 Đ801901554GE0910000151830880298 35 Materials and methods 7.

38 Plant néatertals and wirUSfSouff6S. 38 Co-infection of mild mutant PRSV HA5-1 and ZYMV-ZAC against two different severe potyviruses of PRSV P-HA and ZYMV-GFP in horn melon.-- --- 38 Modification of HC-Pro for the generation of mild mutant PRSV-WAC. 39 Inoculation of horn melon plants with PRSV-WAC, ZYMV-ZAC or both. 40 Examination of titer of PRSV and ZYMV.:ccccccsscssecsscssscesssencesneeseseecesscestecseenatonnee 41 Analysis of the RNA silencing suppression ability of mutated HC-Pros of PRSV and ZAC by aproInflÏlralOTiussescedsesssoiesoaaidsnpAG154082103841300135Y0ESGSĐNNSSEIRNEYSRERMESSASEESEISSS3088 41 Cross protection effectiveness of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or together, against severe strains of PRSV W-CI and ZYMV-GFP under greenhouse CONCILL OTIS gọn no bn no ng A0 BEBE118014G118BASBEESILERGRISHISIRSESHASBEEAASEESGIGTOSKEISRESHHSEXEIGEIESERICHSSREEEDBSS4 42 SH ÍB cececemeunenin cone eeceieiidie ices Gaerne errr ee eerie 43 Co-infection of mild viruses PRSV P HAS-1 (HAS-1) and ZYMV-ZAC (ZAC) provides protection against severe isolates of cognate PRSV P-HA and ZYMV- GPP nho rire lon: DAHIESisssssssseseboseiineiibidBibLEihbsgSdlndlss2ddo39tE4B880X031AL2380G000813001010480888452880g186 43 Generation of attenuated mutant from PRSV W-CI by modification of the pathopenicity factOt Cs PO -erecccsessvesessmmsnersesinnay earner eecorasrersereenn este 91003100042070501301190930003888 43 Symptoms and accumulation dynamics of WAC and ZAC in co-infected horn melon pÏanfs.

ge BR aches ebay bi, BUD. Mee vaseasccteseonsinseeseavacanertecnesesenevnenstaves 44 Mutated HC-Pros of both PRSV and ZYMV have lower RNA silencing suppression abilities but without additive effect. cece eseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeteneeeeens 45 Co-infection of WAC and ZAC in horn melon, muskmelon, and watermelon plants provides complete or high degree of cross protection against both PRSV W-Cl and ZYMV-GED secsnsnoooorBEoonooooe ERUEEoosisoooEoooooikđ Ân nho nga gg sen 46 Discussion. 48 Acknowled ements s5 cá neo tu UIẤ couse 01641411013511E11NG1911835634815 138815) l srst02110001511661848338138% 32 References sine NATIONAL CHUNG HSIMG.

n1 vê, Đa Chapter 3: Development of bivalent vaccines for the concurrent control of papaya ringspot virus and cucumber mosaic virus in cucurbÏfS. - ---- 555cc ss+ecsxeecee 73 PS DSEL TỔ oi soucugiigtgix6055640534854054100638136i05g03036090335883ã28E5383039E0:80103809401a9880038G30084303546.G66 180116 SSO BaG SDRAM EE 74 Tntto duction ssssscsc2266560111100213401101401038100400340068081850S01SLREEGGEEEESSESAGEESEEIESUEAGEESEEIEEELEAXSEEEESZ9EEE4EE 75 Materials and methods. 78 ‘Vitus SOUICES and PLOPACALION boáa 6c iti6146L68%5036i240L9 38063 U5ug án GỆ4%SUNS 383 šg0g881438.5938205g BạxSgRukSi 78 Construction of PRSV W type mild strain WAC carrying CMV MP reading frame. 78 vi Construction of PRSV W mild strain WAC carrying different lengths of CMV CP T68 IHB (ATG eco cncteeniereennernnluniusies reentrant meuniere tere eES Evaluation for the pathogenicity of recombinant Viruses.

5 +5 +55 <++<xs++ Time-course accumulation levels of recombinants in horn melon planfs. Accumulation of the severe virus PRSV W-CI (W-C]) and CMV, alone or topether 1n HOt MELON Plats ie scessssrssaevrssnsmaveansaenscaenss 1853E814331G00.IAASIGSL-44GESESGSEEESSB The stability of individual recombinant viruses in C. Cross-protection effectiveness of individual recombinants against two unrelated Infectivity and cross-protection effectiveness of recombinant virus WAC-MP in hos Melon Plants ccccccceveserescmensee Me AO Mls enerecseenmcemmemmermreeme nme Infectivity of mild strain PRSV WAC carrying different lengths of the CP gene of Genetic stability of PRSV WAC carrying different lengths of CMV CP. Time-course accumulation levels of the PRSV WAC carrying different lengths of CMV-CP-vfusesNATIONAI.CHUHNG HSING UNIVERSITY.

scsssmmemsrnetatt eaves The mild recombinant WAC-CP provides high degrees of cross protection against both PRSV W-CI and CMV, alone or together, in horn melon and muskmelon vii List of tables Chapter 1 Table 1. The function of protein encoded by CMV RNAS .eecceeseeseeseceeeeteenseeeeeeeees 9 Chapter 2 Table 1. Cross protection effectiveness (in percentages) of PRSV-WAC and ZYMV-ZAC alone or in combination, against two different severe potyvirus strains of PRSV W-CI and ZYMYV-GFPP. c1 2 2211222111 2511 15211151511 eree 59 Supplementary Table S1.

Details of primers used in this study .