Phát hiện virus Passionfruit Vietnam (PVNV) trong chanh dây bằng RT-PCR

Khóa luận trình bày phương pháp phát hiện virus PVNV trong chanh dây bằng kỹ thuật RT-PCR, góp phần bảo vệ cây trồng tại Việt Nam.

• Tác giả: Tran Thi Ngoc Ha
• Người hướng dẫn: Huynh Van Biet, Ph.D
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Phát hiện virus Passionfruit Vietnam (PVNV) trong chanh dây bằng phương pháp RT-PCR
• Loại tài liệu: Graduation thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER 1: OBJECTIVES OF THE RESEARCH
• 1.1. Objectives of the research
• 1.2. Content research
• 1.2.1. Content 1: Establishment of RT-PCR assay for the detection of PVNV by using positive control samples
• 1.2.2. Optimization of annealing temperature of the RT-PCR
• 1.2.3. Optimization of primer concentration of the RT-PCR
• 1.2.4. Specificity evaluation of the RT-PCR assay
• 1.2.5. Determination of the limit of detection (LOD) of the RT-PCR assay
• 1.2.6. Content 2: Application of the established RT-PCR assay on field samples
• 2. CHAPTER 2: OVERVIEW OF PASSIONFRUIT
• 2.1. Origin of passionfruit
• 2.2. Botanical features of Passiflora edulis
• 2.3. Classification
• 2.4. Nutrients of passionfruit
• 2.5. Passionfruit extract uses
• 2.6. Cultivation and exportation
• 2.6.1. International
• 2.6.2. National
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Location of the research
• 3.2. Equipment and chemicals
• 3.3. Research workflow
• 3.4. Genomic DNA removal by enzyme Dnase I
• 3.5. cDNA synthesis by Reverse Transcription
• 3.6. Polymerase chain reaction and electrophoresis
• 3.7. Sequencing of the obtained PCR products
• 3.8. Cloning and sequence examination
• 3.9. Annealing temperature optimization
• 3.10. Primers concentration optimization
• 3.11. Evaluation of the specificity of the RT-PCR
• 3.12. Sensitivity and determination for limit of detection (LOD) of the RT-PCR
• 3.13. Application of the established RT-PCR assay on field samples
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Results of establishment of RT-PCR assay for the detection of PVNV by using positive control samples
• 4.2. RNA extraction and quantification
• 4.3. Sequencing of the target gene amplification
• 4.4. Cloning and sequence examination
• 4.5. Annealing temperature optimization
• 4.6. Primer concentration optimization
• 4.7. Evaluation of the specificity of the RT-PCR
• 4.8. Sensitivity and determination for limit of detection (LOD) of the RT-PCR
• 4.9. Application of the established RT-PCR assay on field samples
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus Passionfruit Vietnam PVNV và chanh dây

Virus Passionfruit Vietnam (PVNV) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho cây chanh dây (Passiflora edulis). Bệnh hoá ban vỏ trái chanh dây (PWD) do PVNV gây ra đã dẫn đến thiệt hại lớn cho sản xuất chanh dây tại Việt Nam. Việc phát hiện sớm và chính xác sự hiện diện của virus này là rất cần thiết để kiểm soát và giảm thiểu thiệt hại cho nông nghiệp.

1.1. Đặc điểm và tác động của virus Passionfruit

PVNV thuộc họ Potyvirus, gây ra nhiều triệu chứng khác nhau trên cây chanh dây như lá biến dạng, quả bị biến dạng và giảm năng suất. Việc hiểu rõ về virus này giúp nông dân có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tình hình chanh dây tại Việt Nam

Chanh dây là một trong những cây trồng quan trọng tại Việt Nam, với diện tích trồng ngày càng tăng. Tuy nhiên, sự lây lan của PVNV đã gây ra nhiều thách thức cho người nông dân trong việc duy trì sản xuất.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện virus PVNV

Việc phát hiện virus PVNV gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng của các loại virus có thể gây bệnh cho chanh dây. Các triệu chứng của bệnh thường không rõ ràng, dẫn đến việc chẩn đoán sai. Điều này làm tăng nguy cơ lây lan virus trong các vườn chanh dây.

2.1. Các triệu chứng của bệnh chanh dây

Các triệu chứng của bệnh do PVNV gây ra có thể bao gồm lá biến dạng, quả nhỏ và không phát triển. Những triệu chứng này có thể bị nhầm lẫn với các bệnh khác, gây khó khăn trong việc phát hiện sớm.

2.2. Khó khăn trong việc kiểm tra virus

Việc kiểm tra virus bằng các phương pháp truyền thống thường không hiệu quả và tốn thời gian. Do đó, cần có các phương pháp hiện đại hơn để phát hiện virus một cách nhanh chóng và chính xác.

III. Phương pháp RT PCR trong phát hiện virus PVNV

Phương pháp RT-PCR đã được thiết lập để phát hiện virus PVNV trong chanh dây. Đây là một phương pháp nhạy bén và chính xác, cho phép phát hiện virus ngay cả khi nồng độ virus thấp.

3.1. Nguyên lý hoạt động của RT PCR

RT-PCR là phương pháp kết hợp giữa phản ứng chuỗi polymerase và phiên mã ngược, cho phép khuếch đại DNA từ RNA của virus. Phương pháp này giúp phát hiện virus một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.2. Quy trình thực hiện RT PCR

Quy trình RT-PCR bao gồm các bước như chiết xuất RNA, tổng hợp cDNA, và khuếch đại sản phẩm PCR. Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện như nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi để đạt được kết quả tốt nhất.

3.3. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp RT-PCR đã được kiểm tra bằng cách sử dụng các mẫu virus khác nhau. Kết quả cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện PVNV với độ chính xác cao.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã phát hiện 9/34 mẫu chanh dây dương tính với virus PVNV, chiếm 26.47%. Kết quả này cho thấy sự lây lan của virus trong các vùng trồng chanh dây tại Việt Nam và nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát hiện sớm.

4.1. Kết quả phát hiện virus trong mẫu thực địa

Kết quả cho thấy có sự hiện diện của PVNV trong nhiều mẫu chanh dây, điều này cho thấy virus đã lây lan rộng rãi. Việc phát hiện sớm sẽ giúp nông dân có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

4.2. Ứng dụng của phương pháp RT PCR trong nông nghiệp

Phương pháp RT-PCR không chỉ giúp phát hiện PVNV mà còn có thể áp dụng cho các loại virus khác. Điều này mở ra cơ hội cho việc kiểm soát dịch bệnh trong nông nghiệp một cách hiệu quả hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu virus PVNV

Việc phát hiện virus PVNV bằng phương pháp RT-PCR đã mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát bệnh hoá ban vỏ trái chanh dây. Nghiên cứu này không chỉ giúp nông dân bảo vệ mùa màng mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp.

5.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm virus

Phát hiện sớm virus là yếu tố quyết định trong việc kiểm soát dịch bệnh. Điều này giúp nông dân có thể áp dụng các biện pháp phòng ngừa kịp thời, giảm thiểu thiệt hại.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng để phát triển các phương pháp phát hiện virus hiệu quả hơn. Đồng thời, cần có các chiến lược quản lý dịch bệnh toàn diện để bảo vệ cây chanh dây khỏi các tác nhân gây hại.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây chanh dây (Passiflora edulis Sims) là loại cây ăn trái nhiệt đới và cận nhiệt đới có giá trị kinh tế cao nhờ hàm lượng dinh dưỡng phong phú và hương vị đặc trưng chứa hơn 130 hợp chất tạo mùi thơm. Nhu cầu tiêu thụ quả tươi và phục vụ công nghiệp chế biến nước ép ngày càng tăng đã thúc đẩy việc mở rộng diện tích canh tác chanh dây tại nhiều quốc gia. Tại Việt Nam, diện tích trồng chanh dây đã tăng trưởng nhanh chóng từ 1.500 ha năm 2015 lên 10.000 ha năm 2022 và định hướng đạt 25.000 ha vào năm 2025. Các vùng trồng tập trung chủ yếu tại khu vực Tây Nguyên và Nam Trung Bộ (Đắk Nông, Gia Lai, Lâm Đồng) cũng như miền Bắc (Sơn La, Nghệ An). Trong đó, tỉnh Gia Lai là vùng sản xuất lớn nhất với diện tích trên 4.263 ha và sản lượng đạt hơn 134.000 tấn.

Tuy nhiên, ngành sản xuất chanh dây đang phải đối mặt với thiệt hại nghiêm trọng do bệnh hóa bần vỏ trái (Passionfruit Woodiness Disease - PWD). Bệnh khiến lá bị khảm, nhăn nheo, xuất hiện đốm vàng hoặc đốm vòng, quả bị biến dạng, vỏ quả hóa gỗ cứng, làm suy giảm nghiêm trọng sức sống, rút ngắn tuổi thọ cây và làm giảm năng suất thương phẩm. Đến nay, hơn 20 loại virus đã được ghi nhận gây bệnh trên chanh dây. Trong đó, Passionfruit Vietnam virus (PVNV) là một thành viên mới thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae, được phân loại dưới loài của Passiflora mottle virus (PaMoV). Virus này lây truyền qua các loài rệp muội (Myzus persicae, Aphis gossypii) theo phương thức không bền vững (non-persistent), nhưng con đường lan truyền chính và nguy hiểm nhất trong thực tế canh tác là thông qua việc nhân giống vô tính (chiết, ghép, giâm cành).

Do bệnh do virus hiện chưa có thuốc hóa học điều trị đặc hiệu, việc chẩn đoán sớm và chính xác sự hiện diện của virus là điều kiện tiên quyết để chọn lọc nguồn vật liệu sạch bệnh và kiểm soát dịch tấy lây lan. Đề tài khóa luận tập trung giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể:

• Mục tiêu tổng quát: Thiết lập thành công quy trình RT-PCR phát hiện virus PVNV (Passionfruit Vietnam virus) và ứng dụng quy trình này để kiểm tra sự hiện diện của virus trên các mẫu chanh dây thu thập tại thực địa.
• Nội dung nghiên cứu cụ thể:
  1. Thiết lập quy trình RT-PCR phát hiện PVNV sử dụng mẫu chứng dương: thiết kế mồi đặc hiệu, tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$), tối ưu hóa nồng độ mồi, đánh giá độ đặc hiệu với các virus khác và xác định giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD).
  2. Ứng dụng quy trình RT-PCR đã tối ưu để đánh giá tỷ lệ nhiễm PVNV trên 34 mẫu lá chanh dây thu thập tại thực địa.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Cây chanh dây (Passiflora edulis Sims), virus gây bệnh Passionfruit Vietnam virus (PVNV), các mẫu chứng dương/chứng âm và các loài virus đối chứng.
  • Phạm vi không gian: Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử A204 – A205, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường (RIBE), Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Các mẫu thực địa được thu thập tại 3 trang trại thuộc TP. Thủ Đức (TP.HCM), Buôn Hồ (Đắk Lắk) và Gia Nghĩa (Đắk Nông).
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai từ tháng 07/2023 đến tháng 10/2023; hoàn thiện khóa luận vào tháng 04/2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử thực vật và vi sinh vật học, ứng dụng kỹ thuật phiên mã ngược kết hợp phản ứng chuỗi polymerase (RT-PCR). Virus PVNV có vật chất di truyền là phân tử RNA mạch đơn dương (ssRNA(+)), do đó quy trình chẩn đoán đòi hỏi phải tách chiết RNA tổng số, loại bỏ triệt để DNA bộ gen tạp nhiễm và tổng hợp thành complementary DNA (cDNA) trước khi tiến hành khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm các bước kỹ thuật chuẩn hóa:

• Thiết kế mồi chuyên biệt (Primer Design): Cặp mồi được thiết kế dựa trên các vùng trình tự bảo thủ của hệ gen PVNV công bố trên ngân hàng gen NCBI GenBank, sử dụng công cụ NCBI Primer-BLAST để kiểm tra tính đặc hiệu lý thuyết và tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu.
• Tách chiết và tinh sạch RNA: Sử dụng bộ kít tách chiết cột silica EZ-10 Spin Column Plant RNA Miniprep Kit (Biobasic, Canada). Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của RNA thông qua máy đo quang phổ BioDrop Lite ở tỷ số hấp thụ quang học $A_{260}/A_{280}$.
• Xử lý loại bỏ DNA bộ gen (gDNA Removal): Sử dụng enzyme DNase I (Thermo Scientific, USA) ủ ở 37°C trong 30 phút và bất hoạt enzyme bằng EDTA ở 65°C trong 10 phút.
• Tổng hợp cDNA: Thực hiện phản ứng phiên mã ngược với kít SensiFAST cDNA Synthesis Kit (Meridian Life Science) trên máy luân nhiệt LifeEco Thermo Cycler theo chu trình: 25°C (10 phút), 42°C (15 phút), 48°C (15 phút), 85°C (5 phút) và giữ ở 4°C.
• Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR:
  • Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) trong dải nhiệt độ từ 56°C đến 65°C.
  • Tối ưu hóa nồng độ mồi trong dải từ 0,025 µM đến 0,4 µM.
  • Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, điện thế 100V trong 30 phút, nhuộm GelRed và quan sát dưới ánh sáng tia UV.
• Dòng hóa phân tử và giải trình tự: Sản phẩm PCR đặc hiệu được dòng hóa vào vector pJET1.2 blunt (CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo Scientific), biến nạp vào vi khuẩn, chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin (100 µg/mL). Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng colony PCR và giải trình tự Sanger tại Viện Sinh học Phân tử Loci; đối chiếu trình tự với ngân hàng gen NCBI qua thuật toán BLAST.
• Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy (LOD): Thử nghiệm chéo với cDNA của 3 loại virus thực vật gồm Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) và Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV). Xác định giới hạn phát hiện bằng cách pha loãng bậc 10 nồng độ plasmid chuẩn từ $10^0$ đến $10^9$ copies/µL (lặp lại 10 lần tại các dải nồng độ $10^0, 10^1, 10^2$ copies/µL).
• Khảo sát mẫu thực địa: Áp dụng toàn bộ quy trình tối ưu để kiểm tra 34 mẫu lá chanh dây thu thập ngẫu nhiên tại 3 vùng sinh thái khác nhau.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu (Objectives and Content Research)

Chương này xác định tầm quan trọng của việc xây dựng công cụ chẩn đoán phân tử phục vụ công tác giám sát bệnh PWD tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần rõ rệt: thiết lập - tối ưu hóa quy trình RT-PCR trên mẫu chuẩn trong phòng thí nghiệm và ứng dụng quy trình đã hoàn thiện để tầm soát tỷ lệ nhiễm virus PVNV trên các mẫu thực địa thu thập từ các nông hộ.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Overview of Passionfruit, PWD and Diagnosis)

Chương 2 trình bày có hệ thống về nguồn gốc, đặc điểm thực vật học, giá trị dinh dưỡng và tiềm năng dược liệu của cây chanh dây (Passiflora edulis). Tác giả tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như polyphenol, piceatannol trong hạt và lá chanh dây, cùng tác dụng chống oxy hóa in vitro/in vivo. Phần tiếp theo phân tích chi tiết về bệnh hóa bần vỏ trái (PWD), tác nhân gây bệnh thuộc chi Potyvirus, phương thức lây truyền qua rệp muội và các biện pháp quản lý tổng hợp.

Chương này cũng tổng quan và so sánh các phương pháp chẩn đoán virus thực vật hiện nay:

• Chẩn đoán lâm sàng: Quan sát triệu chứng hình thái ngoài đồng ruộng, dễ nhầm lẫn với hiện tượng thiếu dinh dưỡng hoặc sâu hại.
• Kỹ thuật miễn dịch ELISA: Dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể, phù hợp sàng lọc số lượng lớn nhưng độ nhạy hạn chế hơn kỹ thuật phân tử.
• Kỹ thuật PCR và RT-PCR: Công cụ khuếch đại acid nucleic có độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, cho phép phát hiện mầm bệnh ở giai đoạn sớm khi cây chưa biểu hiện triệu chứng rõ rệt.

Đồng thời, chương tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến PVNV và PaMoV. Đáng chú ý là công trình phân lập potyvirus trên chanh dây tại Phúc Kiến - Trung Quốc (Xie et al.) và các khảo sát dịch tễ tại Việt Nam giai đoạn 2017–2020 của Đỗ Duy Hùng và cộng sự, ghi nhận các phân lập PaMoV/PVNV tại Nghệ An, Đắk Nông, Lâm Đồng (các mã số GenBank: MG087833 – MG087836, MT990976.1) cùng thử nghiệm thành công chủng PaMoV-Es3Is1 giảm độc lực để bảo vệ chéo cây chanh dây.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương 3 mô tả cụ thể các trang thiết bị máy móc, hóa chất, sinh phẩm sử dụng và sơ đồ quy trình nghiên cứu toàn diện từ khâu thiết kế mồi, xử lý mẫu đến phân tích kết quả. Chi tiết về 3 địa điểm thu mẫu thực địa được chuẩn hóa theo tọa độ địa lý:

• Trang trại 1 (Mẫu 1 – 9): Khu phố 6, phường Đông Hòa, TP. Dĩ An / TP. Thủ Đức (10°52’28.7”N, 106°47’37.1”E).
• Trang trại 2 (Mẫu 10 – 21): 73 Lý Tự Trọng, TDP 1, phường Thiện An, thị xã Buôn Hồ, tỉnh Đắk Lắk (12°54’06.5”N, 108°16’07.1”E).
• Trang trại 3 (Mẫu 22 – 34): TDP 4, phường Nghĩa Tân, TP. Gia Nghĩa, tỉnh Đắk Nông (11°97’40.90”N, 107°65’38.99”E).

Chương cũng quy định chi tiết công thức tính số lượng bản sao plasmid phục vụ xác định LOD theo công thức của Staroscik (2004):

$$\text{Copies} = \frac{\text{Khối lượng plasmid (ng)} \times 6,022 \times 10^{23}}{\text{Chiều dài phân tử (bp)} \times 10^9 \times 650}$$

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương 4 phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được qua từng giai đoạn:

• Thiết kế mồi và kiểm tra chất lượng RNA: Cặp mồi PVNV-F (5'-TTCTCGAACCAACACGACC-3') và PVNV-R (5'-GTCTGCATTTGCACCAGTTC-3') có nhiệt độ nóng chảy lý thuyết lần lượt là 57,63°C và 57,00°C. RNA tách chiết từ mẫu lá chứng dương đạt nồng độ cao và độ tinh sạch đạt tỷ lệ $A_{260}/A_{280} \approx 2,0$, đáp ứng tiêu chuẩn tổng hợp cDNA.
• Khuếch đại và xác nhận trình tự gen đích: Phản ứng PCR cho ra một băng điện di duy nhất có kích thước đúng 410 bp. Kết quả giải trình tự Sanger và đối chiếu BLAST trên NCBI cho thấy độ bao phủ (query cover) đạt 100% và độ tương đồng nucleotide đạt 98,54% – 100% so với trình tự PVNV phân lập tại Việt Nam (mã truy cập MT990976.1). Sản phẩm dòng hóa vào vector pJET1.2 cho kích thước đoạn chèn kèm vùng plasmid là 528 bp.
• Tối ưu hóa điều kiện PCR: Khảo sát dải nhiệt độ bắt cặp từ 56°C đến 65°C cho thấy tại 59°C băng sản phẩm sáng và rõ nét nhất, không xuất hiện băng phụ. Khảo sát nồng độ mồi cho thấy nồng độ 0,2 µM đảm bảo hiệu quả khuếch đại tối ưu mà không gây lãng phí hóa chất hay hình thành dimer mồi.
• Độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện (LOD): Phản ứng RT-PCR không khuếch đại bất kỳ sản phẩm nào từ cDNA của 3 loại virus ToMV, ToMMV và SPFMV, khẳng định tính đặc hiệu cao của cặp mồi đối với PVNV. Giới hạn phát hiện được xác định ở mức $10^1$ (10 copies/µL), với tỷ lệ phát hiện dương tính đạt 10/10 lần lặp lại (ở nồng độ $10^0$ bản sao, tỷ lệ phát hiện giảm xuống 2/10 lần).
• Ứng dụng trên mẫu thực địa: Kiểm tra 34 mẫu lá thực địa thu nhận kết quả 9/34 mẫu (26,47%) dương tính với virus PVNV. Toàn bộ 9 mẫu dương tính đều thuộc Trang trại 1 tại TP. Thủ Đức. Các mẫu thu thập tại Buôn Hồ (Đắk Lắk) và Gia Nghĩa (Đắk Nông) cho kết quả âm tính dù một số mẫu ngoài đồng ruộng có biểu hiện triệu chứng tương tự PWD. Tác giả thảo luận nguyên nhân có thể do nông dân tại các vùng trọng điểm đã sử dụng cây giống sạch bệnh TN-1 hoặc triệu chứng quan sát được là do các tác nhân virus khác (như EAPV, PaMoV chủng khác) gây ra.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Recommendation)

Tổng kết toàn bộ các chỉ số kỹ thuật đã thiết lập thành công và đề xuất 3 kiến nghị khoa học nhằm cải tiến quy trình: mở rộng khảo sát mẫu thực địa trên diện tích lớn hơn, tiếp tục đánh giá cặp mồi để nâng cao độ đặc hiệu và chuyển đổi quy trình từ RT-PCR hai bước (two-step) sang quy trình RT-PCR một bước (one-step) nhằm rút ngắn thời gian và hạn chế rủi ro ngoại nhiễm.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình chẩn đoán sinh học phân tử có độ chính xác cao để phát hiện virus Passionfruit Vietnam virus (PVNV) trên cây chanh dây tại Việt Nam.

Bảng thông số tối ưu của quy trình RT-PCR phát hiện PVNV

Thông số kỹ thuật	Giá trị xác lập tối ưu	Ghi chú thực nghiệm
Cặp mồi khuếch đại	PVNV-F (19 bp) / PVNV-R (20 bp)	Kích thước sản phẩm khuếch đại đặc hiệu: 410 bp
Nhiệt độ bắt cặp ($T_a$)	59°C (30 giây)	Khảo sát trong dải 56°C – 65°C; 59°C cho băng sáng rõ nhất
Nồng độ mồi tối ưu	0,2 µM	Khảo sát dải 0,025 – 0,4 µM; 0,2 µM triệt tiêu dimer mồi
Độ đặc hiệu	100% đối với PVNV	Không phản ứng chéo với ToMV, ToMMV, SPFMV
Giới hạn phát hiện (LOD)	10 bản sao ($10^1$ copies/µL)	Độ lặp lại đạt 10/10 lần ở $10^1$ copies
Chu trình nhiệt PCR	95°C (5 phút) $\rightarrow$ 40 chu kỳ [95°C (30s) - 59°C (30s) - 72°C (40s)] $\rightarrow$ 72°C (7 phút)	Thực hiện trên máy LifeEco Thermo Cycler

Bảng kết quả khảo sát mẫu lá chanh dây thực địa

Điểm thu mẫu	Vị trí địa lý / Nông trại	Số lượng mẫu	Số mẫu dương tính PVNV	Tỷ lệ dương tính
Nông trại 1	KP.6, P. Đông Hòa, TP. Dĩ An / TP. Thủ Đức	9 (Mẫu 1 – 9)	9	100%
Nông trại 2	P. Thiện An, TX. Buôn Hồ, Tỉnh Đắk Lắk	12 (Mẫu 10 – 21)	0	0%
Nông trại 3	P. Nghĩa Tân, TP. Gia Nghĩa, Tỉnh Đắk Nông	13 (Mẫu 22 – 34)	0	0%
Tổng cộng	3 địa phương	34 mẫu	9 mẫu	26,47%

Đóng góp của đề tài:

• Đây là một trong những công bố đầu tiên tại Việt Nam thiết lập hoàn chỉnh quy trình two-step RT-PCR tối ưu chuyên biệt cho việc phát hiện tác nhân mới Passionfruit Vietnam virus (PVNV).
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về giới hạn phát hiện ở mức độ phân tử cực kỳ nhạy (10 copies), hỗ trợ phát hiện virus ngay ở giai đoạn tiềm ẩn khi nồng độ virus trong mô thực vật còn rất thấp.
• Đưa ra bức tranh dịch tễ học bước đầu về sự phân bố của PVNV tại một số vườn trồng chanh dây, làm cơ sở khoa học cho công tác kiểm định cây giống và quản lý dịch hại tổng hợp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã thẳng thắn ghi nhận các điểm hạn chế trong quá trình thực hiện dựa trên phạm vi nghiên cứu và đề xuất các hướng phát triển tiếp theo:

• Hạn chế:

  • Quy trình chẩn đoán được thiết lập theo phương thức RT-PCR hai bước (two-step RT-PCR), đòi hỏi thao tác mở nắp ống sau phản ứng phiên mã ngược, làm tăng nguy cơ lây nhiễm chéo giữa các mẫu và kéo dài thời gian phân tích.
  • Số lượng mẫu thực địa khảo sát còn hạn chế (34 mẫu tại 3 khu vực), chưa phản ánh toàn diện hiện trạng nhiễm PVNV trên phạm vi cả nước.
  • Phép thử độ đặc hiệu mới chỉ tiến hành trên 3 loại virus đối chứng ngoài chi (ToMV, ToMMV, SPFMV), chưa kiểm tra phản ứng chéo trực tiếp với các potyvirus khác thường xuất hiện trên chanh dây tại Việt Nam như East Asian Passiflora virus (EAPV).

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Chuyển đổi và tối ưu hóa quy trình sang dạng RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) nhằm tích hợp phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại trong cùng một tube, giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm và tiết kiệm thời gian.
  • Mở rộng quy mô điều tra, thu thập mẫu lá và quả trên diện rộng tại các vùng chuyên canh chanh dây trọng điểm khác (Gia Lai, Lâm Đồng, Sơn La, Nghệ An).
  • Tiếp tục tinh chỉnh và đánh giá cặp mồi trên nhiều biến thể/chủng phân lập khác nhau để gia tăng độ đặc hiệu chẩn đoán phân biệt giữa PVNV và các thành viên khác trong phức hợp gây bệnh PWD.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thực tiễn và học thuật cho các nhóm đối tượng:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Bệnh học Thực vật, Nông nghiệp: Tham khảo cấu trúc nghiên cứu thực nghiệm sinh học phân tử, phương pháp thiết kế mồi, kỹ thuật dòng hóa gen vào vector blunt-end và quy trình thẩm định độ nhạy/độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán phân tử.
• Cán bộ kỹ thuật tại các Trung tâm Giống cây trồng, Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ Thực vật: Ứng dụng trực tiếp thông số chu trình nhiệt, thành phần hóa chất và nồng độ mồi đã được tối ưu để xây dựng quy trình kiểm nghiệm virus định kỳ trên cây giống chanh dây trước khi xuất vườn.
• Phần nội dung có giá trị tham khảo cao: Quy trình xử lý loại bỏ DNA bộ gen bằng DNase I, công thức và phương pháp tính toán số bản sao plasmid xác định LOD, các bảng thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt chuẩn.

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu có trình tự như thế nào và tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thước bao nhiêu?

Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ của hệ gen PVNV gồm: mồi xuôi PVNV-F (5'-TTCTCGAACCAACACGACC-3', chiều dài 19 bp) và mồi ngược PVNV-R (5'-GTCTGCATTTGCACCAGTTC-3', chiều dài 20 bp). Kích thước sản phẩm khuếch đại PCR đặc hiệu là 410 bp.

2. Các điều kiện tối ưu đã được xác lập cho phản ứng PCR phát hiện PVNV là gì?

Điều kiện tối ưu bao gồm nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) là 59°C và nồng độ mồi trong phản ứng là 0,2 µM. Chu trình luân nhiệt tối ưu: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 40 chu kỳ lặp lại gồm [95°C trong 30 giây, 59°C trong 30 giây, 72°C trong 40 giây]; và kéo dài chuỗi lần cuối ở 72°C trong 7 phút.

3. Độ nhạy và giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình RT-PCR được xác định ở mức nào?

Quy trình đạt giới hạn phát hiện (LOD) ở mức 10 bản sao ($10^1$ copies/µL) plasmid mang gen đích, với độ lặp lại ổn định đạt 10/10 lần thử nghiệm dương tính. Tại nồng độ thấp hơn ($10^0$ bản sao), tỷ lệ phát hiện giảm xuống còn 2/10 lần.

4. Kết quả kiểm tra trên 34 mẫu lá thực địa cho thấy tỷ lệ nhiễm virus PVNV như thế nào?

Có 9/34 mẫu (chiếm tỷ lệ 26,47%) dương tính với virus PVNV. Toàn bộ 9 mẫu dương tính đều nằm trong nhóm mẫu thu thập tại Trang trại 1 (TP. Thủ Đức, TP.HCM). Tất cả 25 mẫu thu thập tại Đắk Lắk (12 mẫu) và Đắk Nông (13 mẫu) đều cho kết quả âm tính.

5. Vì sao một số mẫu lá tại Đắk Lắk và Đắk Nông có biểu hiện triệu chứng PWD nhưng kết quả RT-PCR lại âm tính với PVNV?

Các mẫu thực địa này âm tính với PVNV có thể do hai nguyên nhân chính: thứ nhất, các trang trại tại khu vực trọng điểm có thể đã sử dụng nguồn giống sạch bệnh (như giống vô tính TN-1); thứ hai, triệu chứng tương tự PWD trên đồng ruộng có thể do các loài virus khác trong phức hợp gây bệnh (như East Asian Passiflora virus - EAPV hoặc các chủng potyvirus khác) gây ra chứ không phải do PVNV.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Ngọc Hà đã thiết lập thành công quy trình RT-PCR hai bước có độ đặc hiệu cao và độ nhạy đạt 10 bản sao để phát hiện tác nhân virus Passionfruit Vietnam virus (PVNV) gây bệnh hóa bần vỏ trái chanh dây. Việc ứng dụng quy trình trên 34 mẫu lá thực địa đã xác định được tỷ lệ nhiễm PVNV là 26,47%, tập trung chủ yếu tại khu vực TP. Thủ Đức. Đây là đóng góp thực nghiệm quan trọng, cung cấp một công cụ chẩn đoán sinh học phân tử tin cậy phục vụ công tác giám sát dịch bệnh và chọn lọc cây giống chanh dây sạch bệnh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES DETECTION OF Passionfruit Vietnam virus (PVNV) IN PASSIONFRUIT BY RT-PCR Major : BIOTECHNOLOGY Student : TRAN THI NGOC HA Student code : 19126248 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 04/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS DETECTION OF Passionfruit Vietnam virus (PVNV) IN PASSIONFRUIT BY RT-PCR Advisor: Student: HUYNH VAN BIET, Ph.D TRAN THI NGOC HA Thu Duc City, 04/2024 ACKNOWLEDGEMENTS I would like to express my sincere gratitude towards the Board of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Board of Faculty of Biological Sciences for creating the most favorable conditions for me to finish this study. In addition, I also want to thank Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh City for providing me the facilities to conduct this research. Iam genuinely honored to my advisor Dr. Huynh Van Biet who has guided and encouraged me from the beginning to the end of my graduation thesis.

It would be impossible for the study to be accomplished if it hadn’t been the help of all members of Molecular Biology Room A204 — A205 who have accompanied with me during the hard time and especially MSc. Truong Quang Toan for all the support and guidance. And last but not least, I also would like to express my gratitude to my family for giving me the opportunity to complete my thesis. They are the reason for me to carry on and manage the study, and I promise I will try harder to be successful to become your pride.

Sincere CONEIRMATION AND COMMITMENT My name is Tran Thi Ngoc Ha, Class: DH19SHC, Student ID: 19126248, Nong Lam University Ho Chi Minh City. I guarantee that this research was conducted by myself and that the results presented are utterly truthful and objective. This graduation thesis had been done all by myself. The data and information in the research are completely honest and objective.

I will take all responsibilities before the Council for Thu Duc City, April 2024 Student’s signature il ABSTRACT Passionfruit Woodiness Disease has caused by the Passionfruit Vietnam virus (PVNV) and has led to serious damage for passionfruit production because of having no effective treatment. The presence of viruses on passionfruit is necessary to detect early and accurately for effective control. In this study, RT-PCR was established to determine the presence of Passionfruit Vietnam Virus (PVNV) in Viet Nam. Primer was designed specifically to detect PVNV with the amplified product of 410 bp.

The optimal annealing temperature, primer concentration and limit of detectetion was 59°C, 0.2 uM and 10 copies, respectively. A total of 3 types of virus ToMV, TOMMV, SPFMV was tested to verify the specificity of the assay. There were 9/34 field samples detected with PVNV of which 26.47% samples were infected with the virus. This study has successfully established an optimal RT-PCR assay to detect the presence of PVNV.

Keyword: passionfruit, PVNV, RT-PCR. 1H TÓM TẮT Bệnh hoá ban vỏ trái chanh dây (PWD) do Passionfruit Vietnam virus (PVNV) gây ra và gây thiệt hại nghiêm trọng cho việc sản xuất chanh dây vì không có biện pháp điều trị hiệu quả. Cần phát hiện sớm và chính xác sự có mặt của virus trên cây chanh dây dé có biện pháp phòng trừ hiệu quả. Trong nghiên cứu nay, RT-PCR được thiết lập dé xác định sự hiện diện của Passionfruit Vietnam Virus (PVNV) tại Việt Nam.

Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp, nồng độ mồi và giới han phát hiện lần lượt là 59°C, 0,2 uM và 10 copIes. Độ đặc hiệu của quy trình được thử nghiệm trên 3 loại virus ToMV, ToMMV, SPFMV. Có 9 mẫu trên tổng 34 mẫu thực địa được phát hiện dương tính với PVNV chứng minh có 26,47% mẫu nhiễm virus. Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình RT-PCR tối ưu dé phát hiện sự hiện diện của PVNV.

Từ khoá: cây chanh dây, PVNV, RT-PCR. iv TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGEMENTS. sssssssscssnenonnanneseannaxennnssannnnsncnanticomnnnanausunnsexuenscancacncsamssanssnaonss i CONFIRMATION AND COMMITMENT,.-- -- c5 S+cs+ssesrsrrrrrerrrrrrrrrrrrre ul BS | RA (sec ssysszsss056055126559590/8L7305300-EDEGSSBIGIAJĐSSE2.0580g8g8E ili ee iv TABLE OF CONTENTS1011 —. vill EIST @ORMABES naasgrodptisliosgtoboiiGcbtf4G‡B3SGS)0NGSGEIIGS-EES2SGIEGGEIEHEGSQBi⁄20)A00iGi3010100300800HE 1X LIST OF FIGURES si nnesisosseiitsiiiS11811648 1 10LSE1413555316313461463561583E8S9850S01358-8ESEESEHSLE41081483g3) X CHAPTER 1.-- --- -- S5 S222 2n HH HH HH HH re re 1 II Jun.

Objectives of the research na. Gontent-researe it secon seveunnsmeaeareraveaummaeinurmaaaaiea wee REET 2 2. Overview of passionfruit an. Origin of passionfruit na.

Botanical features of Passiflora CQUlis .ecceccceccesceeceeseeeeeeseeneeeseesenseeeenseeeenseens 3 đố 51C LASSTELCGTTO Tì-:syssoszoyssety0:2062590930853272g8RB)920300210gS02303)28h0992E089y. )NUTf1CTIESEO1,IDDOSSIQTIIEUTozzssssesysrsssssstStESSES0S38908800105305089:038800G4E3GI.ESĐSSI-NGBDSEES3.E358051303g3Ỏ 4 Pu 0i ni cv.1L1UTIO ssssxysusssuib62%6z98s959848696100ã44GPHQISipRUBšNBLHGD0488p4ã9i8300dHbiiisliaablassxeiauai 5 2201/1000 ẽ.ốố ốc ốc ốc ốc ca cố ca RTI 5 2. Passionfruit woodiness disease (PWD) .2, Cause of Passiontruit Woodiness DiSCase csscccessasensacncesaavessasnese 15104401 05583183566 1658 6 2-3-3. ÑI€aii§ G1 (AN SIDISS ON acon cenosteoe dunce encteanmupcnenstewalian bvsteusdoyacunn lonateonsenedemcusecoues tenets 7 252) 5515151 UADUOUNS szsxetssuototoiosrtotitojEbggeStvHS0dG2002 080i56008803Gi300080-2SG1G30J.0LG01008105030 i} 2325, 121112 GIL1C TÌ + sssssossszssssesgessoeos02B0035098001385805.407 8 P Virus diagnosis ha.

§ 2 AEG limical 1A BNO S18 2xssssssssstrobtbodobtbstfSSSEEEEHSSIHHRASIGEHEOSBBEUSRTSHBSEDIBGSIESNSBSB0GSĐG. 9 EAPO CCC Uta UES a aoe Se Se a SR cac 9 DATA RAPER CRETE CMINIG US ieci-crs ereseeweneeecanracew erica rumen ieee aes 9 2, De 109100211011 LESCALON ,s.S80-30đ0- 10 2D, lasHICETIALLOHifI TESEATCH sessssssssorsersebstssgtSSD11AE018010468380200538580460816593EL39568080/03810/0603864538166 10 2. MATERIALS AND METHOIDS.localion of the research csscccccssessuspssinrsszcsesesesenssenaniseseoresernusssectveemeacseensts 12 Diss NIGP AS POS CALG Hh sssasarccrsmsesssemssinnon ae nncesnasounn rears leo TE AO RAT 12 3. Equipment and chemicals T8.

13 3,4,1; Research worktlow so sssssscsssss2 8116104 05656016/4636591A1663348385uE64653 .E3/005G1A614504035145/401883G04E 13 006100 VIN printers Ce STG cain sásesgbas bit tysetidkniesultnAliuengaslắnugtornaikustrrôrkiuistglardeki Euairdoetrdesaglk 14 SUAS ARI NANOS TRA GU OTs cossesasssosesstsibSpktcsgSeoSiigogiSi0i305. Genomic DNA removal by enzyme Dnase Ì. cDNA synthesis by Reverse Transcription. Polymerase chain reaction and electrophoresis.

Sequencing of the obtained PCR producfs. Cloning and sequence eXaim1Iaf1OI. Annealing temperature OpfIN1ZfIOII. Primers conicentfation GpLH1Z4HOTiiiscecessesscissssssseE5611155501508360866536956805300383883.

Evaluation of the specificity of the RT-PCR.---------+++++sc+sc+sczerrerrxe 19 3. Sensitivity and determination for limit of detection (LOD) of the RT-PCR. Application of the established RT-PCR assay on field samples. RESULTS AND DISCUSSION.

Results of establishment of RT-PCR assay for the detection of PVNV by using positve control samples TA. Lala, PEUDTSF OCSI SN cosecconsersuscanev snes eames me enna OR anon REEEES 22 4. RNA extraction and quantIfICafIOH.08080300NS13LG3EH4130g5ip0SU1Gg35)203ã0 23 vi 4. Sequencing of the target gene amplIficafIOñ.

Cloning and sequence ©Xa1m11AfIOII. Annealing temperature OpfI1ZAf1OI1. Primer concentration Optimization. Evaluation of the specificity of the RT-PCR.

Sensitivity and determination for limit of detection (LOD) of the RT-PCR. Application of the established RT-PCR assay on field samples. 28 CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATTION.-------- 31 al a ces tol ST | eee eee eee ee eee Š.2uIGGOIIIff1ET SHOÍELsssensnsoskoasoadcosasblikimiokokionctBikoBring2dnadggniBiigieE2sas4s4l83o-/99/59a00303un0048 31 3535135019. 32 vii LIST OF ABBREVIATIONS BLAST : Basic Local Alignment Search Tool : Base pair cDNA : Complementary DNA ddNTPs : Dideoxynucleotide triphosphates DEPC : Diethyl pyrocarbonate DNA : Deoxyribonucleic acid DV : Daily Value EAPV : East Asian Passiflora virus ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent assay GPx : Glutathione peroxidase GR : Glutathione reductase GSH : Thiol group contents NCBI : National Center for Biotechnology Information NGS : Next-generation sequencing oligo dT : Deoxy-thymidine nucleotide sequence PaMoV : Passiflora mottle virus PCR : Polymerase Chain Reaction PVNV : Passionfruit Vietnam Virus PWD : Passionfruit Woodiness Disease RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcription — Polymerase Chain Reaction SOD : Superoxide dismutase : Optimal annealing temperature : Thiobarbituric acid reactive substances Tn : Melting temperature USDA : United States Department of Agriculture Vill LIST OE TABLES Page Table3.

ETElO: saiTfi0I1SS 16 CA G1 ssennaeininsiondsdiiiilsiiStguaS8i4008631085GSI33i0E0U-03880218080003/88g880đ80. Reagent to remove DNA contamination .5: cDNA: synthesis T©A0 G15 seecsssenecse S216: 111681360 08901 00338SEG9EEE0EUGSSEESE0189 2358. Reagents for PCR 1. Reagents for PCR annealing temperature optimization.

Thermocycle program for PCR annealing temperature optimization. Reagents for PCR primers concentration OptIN1ZatION. Thermocycle program for PCR primers concentration optimization. Information on the viruses used to detemine specificity of RT-PCR.

PVNV primers InÍOrIaf1OT. RNA quantification T€SuUÏẲ. Repetitions of the RT-PCR for determining the limit of detection (LOD). Results of established RT-PCR assay on field samples.

-- --28 ix LIST OF FIGURES Eloure 3.1: WGTKHIGW OF This SOO sascscnssecsacawcvewcesnessnscaneisnsncsessanamnaatsnlunanernanneesmasenads 13 Figure 4. Result of the primers compared to the target sequences by using Primer Blast tool on NGHI CienbaHi: se nsessessssxcssecstecci0151400601360315095S04093SEUGHSSREESGSSSE2U203E5g04350 22 Figure 4. Amplified cDNA fragments of PVNV were analysed by electrophoresis on 1. The obtained nucleotide sequences were verified by BLAST from NCBI.

Electrophoresis of colony polymerase chain reaction of pJET primer C00001). Effect of annealing temperature on detection of PVNV by RT-PCR. Electrophoresis results of the primer concentration evaluation. Electrophoresis results for the specificity evaluation of the RT-PCR.

Electrophoresis results of determination for LOD of the RT-PCR assay. Background Passionfruit (Passiflora edulis Sims) 1s an economically important fruit crop in tropical and subtropical regions (Do Duy Hung ef a/. The passionfruit plantation areas in Viet Nam are mainly located at Dak Nong, Gia Lai, Lam Dong provinces in South Central, the Son La province in Northern Vietnam, and Nghe An province in North Central Vietnam. Because of its high nutrition and unique flavor with 130 aromatic substances, therefore the increasing demand for fresh fruit by markets and especially by the juice industry has boosted the development of new technologies that favor the expansion of passionfruit plantations (Garcéz e/ al.

In the recent years, passionfruit have been considered as one of the most imported fruits which bring high economic income for local farmers and companies in Viet Nam. The planted area of passionfruit in Viet Nam have expanded from 1,500 ha (2015) to 10,000 ha (2022) and expected to be 25,000 ha in 2025. However, a viral disease called Passionfruit Woodiness Disease (PWD) is prevalent in all major passionfruit growing areas of the world (Cerqueira-Silva ef aÏ. Passionfruit plants affected by PWD exhibit a wide range of symptoms from leaf mosaic, rugose, chlorotic spots and/or ringspots to woodiness and deformation of the fruits.

Collectively, these abnormities shorten the lifespan of passionfruit and cause significant yield losses (Ochwo-Ssemakula ef a/. At the present, there are more than 20 viruses have been reported to infect passionfruit (Chen ef zỉ. Among them, Passionfruit Vietnam virus (PVNV) is a new member of the genus Potyvirus, a below-species classification of Passiflora mottle virus (PaMoV). Potyviruses are vectored by aphids, nevertheless, according to Baker ef a/.

(2014), insects are probably not the major source of virus spread, the major means of virus spread is the vegetative propagation of these plants, a fact that also contributes to multiple virus infections. In this study, RT-PCR detection of passionfruit samples collected in various areas unveiled that PWD primarily atributed to PVNV which is wide spread all over the country. In order to minimize the disadvantages caused by PVNV, it is necesary to detect the virus in the early phase. This finding is necessary for a better understanding of the PWD situation in Viet Nam and to develop effective control strategies.

Objectives of the research Establish successful RT-PCR assay for the detection of PVNV (Passionfruit Vietnam Virus) and successfully apply the established RT-PCR assay on field samples. Content research Content 1: Establishment of RT-PCR assay for the detection of PVNV by using positve control samples. Optimization of anealing temperature of the RT-PCR. Optimization of primer concentration of the RT-PCR.

Specificity evaluation of the RT-PCR assay. Determination of the limit of detection (LOD) of the RT-PCR assay. Content 2: Application of the established RT-PCR assay on field samples. Overview of passionfruit 2.

Origin of passionfruit The passionfruit (Passiflora edulis) was discovered in 1569 by Spanish explorers in Peru, who saw the flowers as symbolic of the passion of Christ and, therefore, a sign of Christ’s approval of their efforts. The major producers of passion fruit are found in South America mainly Brazil, Colombia, Peru and Ecuador (Deshmukh ef al. Passionfruit was imported into Vietnam around the beginning of the 20th century.