Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học detection of salmonella enterica subsp enterica and salmonella enterica serovar enteritidis in swiftlet houses by multilex pcr and investigating the presence of virulence genes sipb and flic

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học detection of salmonella enterica subsp enterica and salmonella, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Do Thi Trinh
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Phát hiện Salmonella enterica subsp. enterica và Salmonella enterica serovar Enteritidis trong nhà yến bằng kỹ thuật Multiplex PCR
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• CONFIRMATION COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: INTRODUCTION
• 1.1. Objectives
• 1.2. Salmonella as pathogen
• 2. CHƯƠNG 2: REVIEW
• 2.1. Classification and nomenclature
• 2.2. Virulence genes sipB and fliC of the Salmonella. Clinical signs and macroscopic lesions
• 2.3. Treatment and prevention of the disease
• 2.4. Laboratory diagnostic methods. Polymerase Chain Reaction - PCR
• 2.5. Other diagnostic methods
• 3. CHƯƠNG 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Materials, equipment, and instruments
• 3.2. DNA extraction from field samples and recovery of DNA target
• 3.3. Primers used and thermal cycles for the research
• 3.4. Optimization of the mPCR protocol
• 3.4.1. Optimization of the annealing temperature for s-PCR reaction
• 3.4.2. Optimization of the annealing temperature for mPCR reaction
• 3.4.3. Optimization of the primer concentration for mPCR reaction
• 3.5. Evaluation of primer specificity in mPCR reaction
• 3.6. Determination of the detection limit for m-PCR reaction
• 3.7. Determination of the presence of virulence genes sipB and fliC
• 4. CHƯƠNG 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Optimization of the annealing temperature for mPCR reaction
• 4.2. Optimization of the primer concentration for mPCR reaction
• 4.3. Examination of primer specificity in mPCR reaction
• 4.4. Determination of the detection limit for mPCR reaction
• 4.5. Result of detection of Salmonella
• 4.6. Investigating the presence of virulence genes sipB and fliC
• 4.7. Result of the detection limit for mPCR reaction
• 4.8. Results of detection of Salmonella
• 4.9. Results of investigating the presence of virulence genes sipB and fliC
• CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• REFERENCE
• APPENDIX
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện Salmonella enterica trong nhà yến

Phát hiện Salmonella enterica trong nhà yến là một vấn đề quan trọng trong ngành chăn nuôi và an toàn thực phẩm. Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất, ảnh hưởng đến sức khỏe của cả gia cầm và con người. Việc phát hiện sớm và chính xác Salmonella enterica giúp ngăn ngừa sự lây lan của bệnh tật và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện Salmonella enterica

Việc phát hiện Salmonella enterica giúp giảm thiểu rủi ro cho sức khỏe con người và gia cầm. Nghiên cứu cho thấy rằng Salmonella có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu về Salmonella trong nhà yến

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định sự hiện diện của Salmonella enterica trong môi trường nhà yến, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện Salmonella enterica

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện Salmonella enterica, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc áp dụng chúng trong thực tế. Các yếu tố như môi trường, điều kiện vệ sinh và kỹ thuật lấy mẫu đều ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc phát hiện Salmonella

Điều kiện môi trường như độ ẩm và nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại của Salmonella. Việc lấy mẫu không đúng cách cũng có thể dẫn đến kết quả sai lệch.

2.2. Thách thức trong việc áp dụng Multiplex PCR

Kỹ thuật Multiplex PCR mặc dù hiệu quả nhưng yêu cầu thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao. Điều này có thể là một rào cản lớn đối với nhiều cơ sở chăn nuôi nhỏ.

III. Phương pháp Multiplex PCR trong phát hiện Salmonella enterica

Kỹ thuật Multiplex PCR là một trong những phương pháp hiện đại nhất để phát hiện Salmonella enterica. Phương pháp này cho phép phát hiện nhiều loại vi khuẩn trong một lần xét nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Multiplex PCR

Kỹ thuật Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu của Salmonella. Điều này giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp.

3.2. Quy trình thực hiện Multiplex PCR

Quy trình thực hiện bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, thêm hóa chất và thực hiện chu trình nhiệt. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

IV. Kết quả nghiên cứu về Salmonella enterica trong nhà yến

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ mẫu dương tính với Salmonella enterica trong nhà yến là 6.67%. Kết quả này cho thấy sự hiện diện của Salmonella trong môi trường nuôi yến, cần có biện pháp kiểm soát hiệu quả.

4.1. Tỷ lệ phát hiện Salmonella trong mẫu

Trong 90 mẫu được kiểm tra, có 6 mẫu dương tính với Salmonella enterica. Điều này cho thấy mức độ lây nhiễm trong môi trường nuôi yến là đáng lo ngại.

4.2. Ý nghĩa của kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho các nhà quản lý trong việc xây dựng các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong phát hiện Salmonella

Việc phát hiện Salmonella enterica trong nhà yến là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và an toàn thực phẩm. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện kỹ thuật phát hiện và kiểm soát dịch bệnh.

5.1. Tương lai của nghiên cứu về Salmonella

Nghiên cứu cần tiếp tục phát triển các phương pháp phát hiện nhanh và chính xác hơn để ứng phó kịp thời với sự lây lan của Salmonella.

5.2. Các biện pháp phòng ngừa hiệu quả

Cần có các biện pháp phòng ngừa như cải thiện vệ sinh trong nhà yến và giáo dục người nuôi về an toàn thực phẩm để giảm thiểu rủi ro.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES DETECTION OF Salmonella enterica subsp. enterica AND Salmonella enterica serovar Enteritidis INSWIFTLET HOUSES BY MULTILEX PCR AND INVESTIGATING THE PRESENCE OF VIRULENCE GENES sipB AND fliC Major : BIOTECHNOLOGY Student implementation : DO THI TRINH Student code : 18126192 Academic year : 2018 - 2022 Thu Duc City, March 2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS DETECTION OF Salmonella enterica subsp. enterica AND Salmonella enterica serovar Enteritidis INSWIFTLET HOUSES BY MULTILEX PCR AND INVESTIGATING THE PRESENCE OF VIRULENCE GENES sipB AND fliC Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT DO THI TRINH Thu Duc City, March 2023 ACKNOWLEDGMENTS I would like to express my sincere thanks to the Board of Nong Lam University and the Board of Directors in charge of the Faculty of Biological Sciences for creating the most favorable conditions for me to complete my thesis.

I would also like to thank all the teachers of the Faculty of Biological Sciences who have transferred valuable knowledge during my years at the university. And especially, I would like to express my deep gratitude to Dinh Xuan Phat. PhD for wholeheartedly teaching, guiding, supporting, and giving me inspiration throughout the process of the thesis. Many thanks to Assoc.

Tran Thi Le Minh and all members of DH18SHA have always been with me throughout the learning process at the university. In particular, thanks to Ms. Nguyen Thi Mi Mi, Ms. Nguyen Hoai Thuong, Ms.

Cao Tran Quynh Nhu, and Mr. Hoang Gia Lam for always helping, sharing, and supporting me. And finally, I would like to thank dad, mom, and family for always loving, trusting, and encouraging me. And my friends have accompanied me on this long journey.

CONEIRMATION COMMITMENT My name is Do Thi Trinh, Student ID: 18126192, Class: DH18SHA, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University Ho Chi Minh City, I hereby declare: this is the graduation thesis conducted by myself, the data and information in the research are completely honest and objective. This study was a part of the research “Isolation and molecular identification of potentially pathogenic Escherichia coli, Salmonella, and Clostridium perfrigens on swiftlet houses environments in Southern Vietnam”. I take full responsibility to the council for these commitments. Thu Duc City, March 2023 Student’s signature Do Thi Trinh ABSTRACT Salmonella infections in poultry flocks can cause acute and chronic clinical diseases and in recent years, there have been consecutive foodborne outbreaks of human illness associated with Salmonella.

Thus, this study was performed to investigate the presence of Salmonella enterica subsp. enterica and Salmonella enterica serovar Enteritidis from fecal samples and nest surface swabs collected from 30 swiftlet houses in Southern Vietnam by multiplex PCR assay, and investigation of the prevalence of virulence genes as sipB and fliC genes. The assay used two specific primer pairs designed to detect the STM gene of S. enterica and the Insertion Element sequence of S.

Enteritidis, with product sizes of 137 bp and 316 bp, respectively. The thermal cycle was optimized as follows: initial denaturation at 95°C for 5 min, followed by 35 cycles of amplification encompassing denaturation at 95°C for 30 sec, annealing at 56°C for 30 sec, extension at 72°C for 40 sec, and ending by a final extension step at 72°C for 7 min. The mPCR was established with the limit of detection for each gene at 1*10° ng/uL. The results of this study indicated that with ninety field samples, 6.67% (6/90) of samples were found to be positive for S.

enterica and samples positive with S. Enteritidis accounted for 3. For the virulence gene, samples positive with the sipB and fliC genes were 66. The results demonstrated that the mPCR procedure was optimized and functioned well in routine veterinary diagnosis.

Keywords: mPCR, Salmonella enterica subsp. Enteritidis, swiftlet house. TÓM TẮT Phát hiện Salmonella enterica subsp. enterica và Salmonella enterica serovar Enteritidis trong nhà Yến bang kỹ thuật Multiplex PCR va khảo sát sự hiện diện của các gene độc lực sipB và fliC Salmonella một trong những nguyên nhân gây tình trạng nhiễm khuẩn trên gia cầm và chim hoang dã với các bệnh lâm sàng cấp tính và mãn tính, trong những năm gần đây, liên tiếp xuất hiện các đợt bùng phát dịch bệnh ở người do thực phẩm có liên quan đến Salmonella.

Vì vay, nghiên cứu nay được thực hiện để khảo sát sự hiện điện của Salmonella enterica subsp. enterica va Salmonella serovar Enteritidis từ mẫu phân và mẫu phết bề mặt tô yến được thu thập từ 30 nha Yến ở miền Nam Việt Nam bằng kỹ thuật multiplex PCR, đồng thời khảo sát sự lưu hành các gen độc lực sipB và fliC ở Salmonella. Trong nghiên cứu này sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dé phát hiện gen STM của S. enterica và trình tự Insertion Element của S.

Enteritidis, với kích thước sản phâm khuếch đại lần lượt là 137 bp và 316 bp. Chu trình nhiệt được tối ưu hóa như sau: tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ khuếch đại bao gồm biến tính ở 95°C trong 30 giây, bắt cặp ở 56°C trong 30 giây và kéo dai ở 72°C trong 40 giây, và cuối cùng là hậu kéo đài ở 72°C trong 7 phút. Quy trình mPCR được thiết lập với giới han phát hiện cho từng gen ở 1*105 ng/uL. Kết quả của nghiên cứu này khảo sát trên 90 mẫu thực địa, có 6,67% (6/90) mẫu dương tính với S.

enterica và mau dương tính với S. Đối với các gen độc lực, tỷ lệ mẫu dương tính với gen sipB và fliC lần lượt là 66,67% (4/6) và 50% (3/6). Kết quả trên chứng minh rằng quy trình mPCR đã tối ưu và hoạt động tốt trong chân đoán thú y thường quy. Từ khóa: nhà Yến, mPCR, Salmonella enterica subsp.

Enteritidis TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGMENTS se bán gan he 11 19865111183156165143113E4RSS313556395358814464S8SEGEG1414EE0L5058 8380 i CONFIRMATION COMMITMENT,.- --- cà 1 TT HH Heul ABSTRACT .Ô iv TABLEOF CONTEN US wsessssuscavesscseng sear aes deren nee nuemnmesead V LIST OF ABBREVIATIONS ssssssssosssssscessevesssossesaonsusenvesesovasossoseentesvenesveanmaneunansausenses vill LIS 2 OO) TAB CSS sccseseenamsrse smart ct xe LE REO TOTS STO STH TEBE 1X I9) 05160). 1 Vole Introd wetiOw ssscxsszzsczztg)s62g5510503SG280828804ng0i86GlAGS-G0%SigSuiuigGuiqgslk2biSisgtibgS2EiMIxQG5SBA01000882i0x28 1 Wen OD] CC LIV CS sree poco thư ngHữNggtgEAHIIEDSSB'NSSGE.GHISIGHDEHGBEIUGGHBHHEHISRBQHHG2IGHHĐNNGGBHRE2GDEHSIERURGIBIUEENHSGSHSSH/83 2 TICSFy 0)010519 ene eee eee eee eee 2 Chapter 2. RE VIBW sssssesxssssss saves sie instiesoavesusinactasnasnatavnstastauhobasectassisessesinan 3 D1, Salmon aS PAthO GOR PP SA socsxa sn annsnes cevrucen senegeaacuneuaen coueseeees eancenre ốc 3 Decl Tes Maat OI porter epee cee ee oer cn a gee 3 2. Classification and nomenclature .cccecceesceesccesceeeseeeseeescecseesscecneeesceeseeceseeeeeeeseeeeeeeseeeees 4 ZA A, CU|HIESL-GHRERGSGTISHOGE sccccsancaenscss sean reesei eerste asa sen se anato raaeetoneIE TS 5 z5: MSCHONIS SETUETfE tuisasystrtsdbsssttsinlbssbbkSsb33ASEEAsggis8tsegtsbBsslpssBkSãxtisisdihisbxistosxBsialdExEslIstrite 7 2 ASG.

LLEATISTHHSSTOTE51755+ s5: 5203871 1539015: G080103190588338ẸSESS539iUSS8. Virulence genes sipB and fliC ofthe SalmonelÏa. Clinical signs and macroscopic Ï@SIOTIS.-- -- 5-22 S+£2+£++£++E+eEeeEererrrrrrrrrs 12 De De Biel (bịLUMGSSTDTÌS sessssessssstzSEs02E8086520800130i03E6:G008E30580002U/5:83H3EE0SIGH0. Treatment and prevention of the đ1s€asSe.-- ---- 522 +22 *+2E*2E£*2E£zeszxezrrsres 13 Did« VGCAUM CID scans sconssncasmaemabeesermssasence nara ne memennamnee meen 13 DDD), (PC VICHIL|OTÏtxetrrsotidtntcdiSict8,8irgNhing3G104ctstBSUDESMGLSSSGSEoSVStgBSEBEENNGAISAIGUSSGS0A20r4GI0M5000463NG0003ã0800:8.

Laboratory diagnostic methods. Polymerase Chain Reaction - PCT.- --- 5 2+ St + St Ssseksrrrrrrrrrrrrerreree 14 259L: Prine plesOl PCR: piusxscsi62011150208513054359868S858838SAHBSNSXSGIGEEGRHESERSSGSRIERGGISSSEHISGIRISHSIS0858 15 DB led: Stages Ol PCR se uceesesce socom cguema steam mee uemeanuenon crn recent ceeeeua toner career 16 23. Applicationot PCR: f6€HTHđDbsesssseseeniigissisiigiioEiDuSg0DE103G03880133:13g311680 461006383056 17 2. Other diagnostic methods T0.

MATERIALS AND METHODS tesscssseovennaanrsasrannerrsstacsreneeranesemmneveass 19 Sul.placeot researe lt ce.sgsencormsumenlesaurwepanineacinats alas uinsnsamusereniauansimecsutnete 19 3. Materials, equipment, and 1nS(TUIN€TIES.42qU10fiER{f 8H StU CIS bien sessssessx1t240156860G05EES4BEUSSESS6S2HS0SEBSRSSRGISDEHI-SSI38833003 20 BiB. UGS0lfCGDAW OLNS ve sizioszkcits22306 3 di2ckgiodsgozlfEtruksgrliirinkSshuzetSonÊtộötigudlctgaBSobmtigl0nö:EogiiufrEEnioS8tfouhrgtsdfsie 20 3. DNA extraction from field samples and recovery of DNA target.

Primers used and thermal cycles for the researchh. Optimization of the mPCR prOfOCOIÏL. Optimization of the annealing temperature for s-PCR reaction. Optimization of the annealing temperature for mPCR reaction.

Optimization of the primer concentration for mPCR reaction. Evaluation of primer specificity in mPCR reaction. Determination of the detection limit for m-PCR reactIon. Enteritidis in field samples.

Determination of the presence virulence genes sipB and /Ï¡C.-- ------ 27 Chapter 4, RESULTS AND DISCUSSION vsessccesssnsceonsesansneanancenemanceateanersnonveccnmneemnase 28 an. Optimization of the annealing temperature for mPCR reaction. Optimization of the primer concentration for mPCR reaction. Examination of primer specificity in mPCR reaction.

Determination of the detection limit for mPCR react1ON. Result of detection of S. Investigating the presence of virulence genes sipB and /ÏC. Result of the detection limit for mPCR TreactIOA:.

Results of detection of S. Results of investigating the presence of virulence genes sipB and /liC. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS. 38 REFERENCE 6 cung edy code BI onc 54C HESXGSỒNHRSHISSE.4SDIENGHHSENEHESREGEAHSISNGNSGESRSSIGBBSEUESHS4C3SEEN 39 APPENDIX, s:ssezss:sz2szsse:Sos21680: 15g18 050501030 8016052350028 nSE0kh33SoSL|gi-3001S89n0083390000345880puag 43 LIST OF ABBREVIATIONS BG : Brilliant Green BPW : Buffered Peptone Water CDS : Coding sequence CNS : Central Nervous System DEPC : Diethyl pyrocarbonate dNTPs : deoxynucleotide triphosphates DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay LPS : lipopolysaccharide mPCR : Multiplex Polymerase Chain Reaction S.

Enteridis : Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis SPI : Salmonella pathogenicity island RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA XLD : Xylose Lysine Deoxycholate TAE : Tris - Acetate - EDTA TSI : Triple Sugar Iron TTSS : type III secretion systems LIST OF TABLES Page Table 2. Specific biochemical tests of Salmonella. Primers:used for the m-P CR vweseessesessnsaccossxsaseussenssasseancorntiessennunnaeeveomaesenenase 23 Table 3.

Primer used for s-PCR to detect virulence øenes. Thermal cycles used for m-PCR react1on.- -- 5-5-5 5252 s+++<++sse+sseszsss 23 Table 3. Thermal cycles used for s-PCR for the detection of virulence genes. The components of mPCR for optimizing primer concentration.

Results of DNA concentration before and after dilution. Repetitions of mPCR determining detection limIt. Results of diagnosing S. 34 LIST OF FIGURES Page Figure 2.

Diagram representing the Salmonella gefus.- ----- 5555 + ++s++ss++ss+ssss2 4 Figure 2. Scanning of electron micrographs of Sa/monella Enteritidis cells. Colony morphologies of Salmonella Enter1tId1s. Isolation of the Salmonella from clinical specImens.

Colonial morphology and biochemical features of Salmonella. Circular representation of the S. Enteritidis PT4 chromosome. Egg contamination by Sa/monella Enter1tId1s.

Gross lesions of Sa/monella infection in pouÏtry. The components of Polymerase Chain ReactIon.10; Prineiple Gf PCR. cscccssensnensescnsnessansnp vay tHE33SSSS4ESGEEBESSES/3H48S3S4BSGHSBS. Scheme described optimized processing mPCR reaction.

Scheme described the detection ofsipB and fliC genes. Optimization of annealing temperature in s-PCR. Optimization of annealing temperature in mPCT. Products of s-PCRs and mPCRS.

Result of specificity primers f€Sf. The detection limit of the mPCTR. Electrophoresis results of PCR products of field samples. Electrophoresis results of PCR products for each virulence gene.

Introduction In recent years, statistics have shown us that swiftlet farming and swiftlet products have become an extremely developed industry in Vietnam and some countries around the world. According to the Vietnam News, in 2022, Vietnam has more than 22,000 swiftlet houses in 42 out of 63 provinces and cities with an annual yield of about 120 tons worth 500 million USD (The Vietnam News: https://vietnam news. Thus, understanding infectious pathogens is important to protect this new and prosperous profession. Currently, Salmonellosis an infection caused by the bacterium Salmonella remains one of the global problems in a wide range of hosts, causes huge losses in poultry and/or wild birds, and foodborne outbreaks of human illness.

Investigations of Salmonella shown that they are found in all species of mammals, pigs, poultry, wild birds, reptiles, amphibians, and humans all over the world (Porwollik et al., 2004; Hamer et al., 2012; Krawiec et al., 2015) and in the environment in sites such as moist soil, water, fecal particles, and animal feeds, etc. In 2013, Obukhovska conducted research to identify natural reservoirs of Sa/monella Enteritidis in wild birds in National Park 'Askania Nova' and peninsula 'Arabat arrow' (the Azov Sea coast) and confirmed circulation of Salmonella in this group of wild birds.