Xây dựng quy trình real time pcr phát hiện tình trạng methyl hóa gen sept9 trong máu ngoại vi hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu quy trình Real-time PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu, hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng. Kỹ thuật tiên tiến, độ chính xác cao.

• Tác giả: Bùi Thị Hoài
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Xây dựng quy trình Real-time PCR phát hiện tình trạng Methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi, hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về ung thƣ đại trực tràng
• 1.2. Dịch tễ học
• 1.3. Mô bệnh học
• 1.4. Sàng lọc phát hiện sớm ung thƣ đại trực tràng
• 1.5. Vai trò của dấu ấn methyl hóa DNA trong sàng lọc, chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng
• 1.6. Các phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA
• 1.7. Vai trò của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc, phát hiện sớm UTĐTT
• 1.8. Tổng quan về gen SEPT9
• 1.9. Mối liên hệ giữa gen SEPT9 và ung thƣ đại trực tràng
• 1.10. Tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT
• 1.11. Nghiên cứu và ứng dụng xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc, phát hiện sớm ung thƣ đại trực tràng
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất và thiết bị
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.5. Thu thập, bảo quản mẫu
• 2.6. Tách chiết DNA tổng số. Xử lý mẫu DNA tổng số bằng phản ứng bisulfite
• 2.7. Phƣơng pháp realtime PCR phát hiện dấu ấn methyl hóa gen SEPT9
• 2.8. Phƣơng pháp xác định ngƣỡng phát hiện. Phƣơng pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu lâm sàng
• 2.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu và sinh tin học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thiết kế quy trình realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9
• 3.2. Tối ƣu phản ứng Realtime PCR đặc hiệu khuếch đại chọn lọc gen SEPT9 bị methyl hóa
• 3.3. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi phản ứng Realtime PCR đặc hiệu
• 3.4. Tối ƣu nồng độ mồi ngƣợc (mồi Headloop) của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu
• 3.5. Tối ƣu nồng độ mồi xuôi của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu
• 3.6. Tối ƣu nồng độ probe của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu
• 3.7. Tối ƣu phản ứng tổng số khuếch đại đồng thời DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa gen SEPT9
• 3.8. Tối ƣu nồng độ mồi của phản ứng tổng số
• 3.9. Tối ƣu nồng độ DMSO phản ứng khuếch đại gen SEPT9 tổng số
• 3.10. Đánh giá hiệu quả khóa gen SEPT9 không bị methyl hóa của quy trình realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9
• 3.11. Xác định ngƣỡng phát hiện của quy trình
• 3.12. Xác định ngƣỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn
• 3.13. Xác định ngƣỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu trộn chuẩn
• 3.14. Khảo sát tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trên mẫu mô bệnh phẩm
• 3.15. Đánh giá quy trình trên mẫu máu ngoại vi
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Ung Thư Đại Trực Tràng Dịch Tễ Sinh Học

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới. Năm 2020, trên 1,9 triệu trường hợp UTĐTT mắc mới được ghi nhận, làm cho nó trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu. Tại Việt Nam, UTĐTT nằm trong top 5 các loại ung thư có tỉ lệ mắc và tử vong cao nhất. Nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời, tỉ lệ sống trên 5 năm có thể đạt 80-90%. Tuy nhiên, đáng lo ngại là 60-70% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn muộn. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm ung thư là vô cùng quan trọng để giảm tỉ lệ tử vong. Các nghiên cứu đã tập trung vào việc sử dụng xét nghiệm máu phát hiện ung thư đại trực tràng dựa trên các chỉ thị sinh học đặc trưng của UTĐTT. Một trong những chỉ thị sinh học tiềm năng là methyl hóa gen SEPT9.

1.1. Dịch Tễ Học Ung Thư Đại Trực Tràng Thống Kê Toàn Cầu Việt Nam

Theo số liệu từ IARC năm 2020, UTĐTT chiếm 10% tổng số ca mắc ung thư trên toàn thế giới và là nguyên nhân gây ra 9.4% số ca tử vong do ung thư. Tỉ lệ mắc cao nhất ở Australia, New Zealand, châu Âu và Bắc Mỹ, thấp nhất ở châu Phi và Nam Á. Tại Việt Nam, WHO năm 2020 ghi nhận 16.426 ca mắc mới UTĐTT, với tỉ lệ tử vong đứng thứ 5 trong các loại ung thư. Bệnh có xu hướng gia tăng do lối sống không lành mạnh và hạn chế về nguồn lực cho điều trị. Đánh giá xu hướng mắc và tử vong do UTĐTT Arnold và cộng sự (2017) xác định 3 xu hướng liên quan đến mức độ phát triển: 1) tỉ lệ mắc và tử vong tăng trong thập kỷ gần đây (bao gồm các nước Baltic, Nga, Trung Quốc và Brazil); 2) tỉ lệ mắc tăng nhưng tỉ lệ tử vong giảm (Canada, Vương quốc Anh, Đan Mạch và Singapore); và 3) tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong giảm (Hoa Kỳ, Nhật Bản và Pháp).

1.2. Mô Bệnh Học Ung Thư Đại Trực Tràng Sự Hình Thành Phát Triển

UTĐTT là bệnh lý do sự hình thành các tế bào ung thư trong các mô của đại tràng và trực tràng. Bệnh thường phát triển chậm, trong khoảng 10-20 năm. Hầu hết bắt đầu từ polyp. Loại polyp phổ biến nhất là polyp tuyến (adenomatous polyp). Mặc dù không phải tất cả polyp tuyến đều tiến triển thành ung thư, nhưng nguy cơ tăng lên khi chúng lớn hơn. Hơn 95% UTĐTT là ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma), trong đó 80% là ung thư biểu mô tuyến Liberkuhn, 18% là ung thư biểu mô tuyến nhầy, và hiếm gặp các loại ít biệt hoá và không biệt hoá. Do vậy, việc phát hiện và loại bỏ polyp sớm là vô cùng quan trọng trong phòng ngừa UTĐTT.

II. Thách Thức Trong Sàng Lọc Ung Thư Đại Trực Tràng Giải Pháp

Việc sàng lọc ung thư đại trực tràng đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm bệnh và cải thiện tiên lượng điều trị. Tuy nhiên, các phương pháp sàng lọc hiện tại như nội soi đại tràng có thể gây khó chịu và xâm lấn, dẫn đến sự ngần ngại từ phía bệnh nhân. Các phương pháp không xâm lấn như xét nghiệm máu ẩn trong phân (FOBT) có độ nhạy hạn chế và tỉ lệ dương tính giả cao. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp sàng lọc mới, không xâm lấn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao là một nhu cầu cấp thiết. Nghiên cứu về methyl hóa gen SEPT9 bằng Real-time PCR hứa hẹn mang lại một giải pháp tiềm năng trong việc chẩn đoán sớm ung thư.

2.1. Các Phương Pháp Sàng Lọc Ung Thư Đại Trực Tràng Hiện Nay Ưu Nhược Điểm

Các phương pháp sàng lọc UTĐTT bao gồm: FOBT, xét nghiệm DNA phân (FIT-DNA test), nội soi đại tràng và các phương pháp chẩn đoán hình ảnh. FOBT đơn giản, chi phí thấp nhưng độ nhạy hạn chế. FIT cải thiện độ nhạy nhưng vẫn có hạn chế về giá trị ngưỡng. Nội soi có độ nhạy cao nhưng xâm lấn và có rủi ro. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh cũng cần chuẩn bị phức tạp và có tác dụng phụ. Phát hiện bất thường DNA trong phân đã được nghiên cứu với các đích DNA khác nhau, như đột biến gen KRAS, methyl hóa bất thường gen NDRG4 và BMP3. Mặc dù có độ nhạy cao hơn FIT nhưng FIT-DNA có độ đặc hiệu thấp hơn và giá xét nghiệm cao.

2.2. Hạn Chế Của Phương Pháp Hiện Tại Cần Giải Pháp Chẩn Đoán Sớm Ung Thư

Các phương pháp phát hiện và chẩn đoán UTĐTT hiện nay có nhiều hạn chế. Nội soi đại tràng xâm lấn, gây khó chịu. FOBT và FIT có độ nhạy chưa cao. FIT-DNA có giá thành đắt đỏ. Vì vậy, cần có các phương pháp sàng lọc không xâm lấn, chi phí hợp lý, dễ thực hiện, có độ nhạy cao, đồng thời giảm thiểu các yếu tố gây ảnh hưởng để đảm bảo quá trình sàng lọc và phát hiện ung thư được diễn ra suôn sẻ và nhanh chóng.

III. Methyl Hóa Gen SEPT9 Biomarker Tiềm Năng Chẩn Đoán Sớm Ung Thư

Hiện tượng methyl hóa gen SEPT9 là một biến đổi xảy ra sớm trong quá trình phát sinh UTĐTT. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng DNA methyl hóa có thể được tìm thấy trong máu ngoại vi với tình trạng methyl hóa khác biệt giữa người khỏe mạnh và người bệnh UTĐTT. Triển vọng của việc phát hiện gen SEPT9 bị methyl hóa trong sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và chứng minh. Các nghiên cứu cho thấy kết quả khả quan với độ nhạy và độ đặc hiệu dao động trong khoảng 68-95,6% và 82-98,9%, tương ứng.

3.1. Vai Trò Của Dấu Ấn Methyl Hóa DNA Trong Ung Thư Đại Trực Tràng

Methyl hóa DNA là một biến đổi quan trọng trong quá trình phát sinh UTĐTT. Nó có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen và đóng vai trò trong sự phát triển của ung thư. DNA methyl hóa có thể được tìm thấy trong máu ngoại vi, tạo cơ sở cho các xét nghiệm chẩn đoán không xâm lấn. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh mối liên hệ giữa tình trạng methyl hóa DNA và UTĐTT, cho thấy tiềm năng của nó như một biomarker.

3.2. Gen SEPT9 Mối Liên Hệ Với Ung Thư Đại Trực Tràng Nghiên Cứu Ứng Dụng

Gen SEPT9 là một gen liên quan đến quá trình phân chia tế bào và có vai trò trong sự phát triển của ung thư. Methyl hóa gen SEPT9 là một dấu ấn sinh học tiềm năng cho UTĐTT. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu có thể được sử dụng để sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư. Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và chứng minh tiềm năng của methyl hóa gen SEPT9, và đạt được kết quả khả quan với độ nhạy và độ đặc hiệu trong khoảng 68-95,6% và 82-98,9%.

IV. Real time PCR Phương Pháp Hiệu Quả Phát Hiện Methyl Hóa Gen SEPT9

Real-time PCR là một kỹ thuật khuếch đại DNA có độ nhạy cao, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và y học. Phương pháp này cho phép định lượng chính xác lượng DNA mục tiêu trong mẫu. Trong chẩn đoán sớm ung thư, Real-time PCR có thể được sử dụng để phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi. Độ nhạy và độ chính xác cao của Real-time PCR giúp phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm, khi các phương pháp khác có thể chưa phát hiện được.

4.1. Kỹ Thuật PCR Định Lượng Nguyên Lý Ưu Điểm Trong Chẩn Đoán Ung Thư

Real-time PCR, hay PCR định lượng, là một biến thể của PCR cho phép theo dõi sự khuếch đại DNA trong thời gian thực. Phương pháp này sử dụng các chất phát huỳnh quang để đo lượng DNA được tạo ra trong mỗi chu kỳ PCR. Ưu điểm của Real-time PCR bao gồm độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao và khả năng định lượng chính xác lượng DNA mục tiêu.

4.2. Quy Trình Real time PCR Phát Hiện Methyl Hóa Gen SEPT9 Chi Tiết Từng Bước

Quy trình Real-time PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 bao gồm các bước sau: tách chiết DNA từ mẫu máu, xử lý DNA bằng bisulfite để chuyển đổi cytosine không methyl hóa thành uracil, khuếch đại vùng DNA chứa gen SEPT9 bằng PCR với các mồi đặc hiệu cho DNA methyl hóa, và định lượng sản phẩm PCR bằng cách đo tín hiệu huỳnh quang. Cần tối ưu hóa các thông số PCR để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

V. Nghiên Cứu Về Phát Hiện Methyl Hóa Gen SEPT9 Kết Quả Tiềm Năng

Nghiên cứu của Bùi Thị Hoài năm 2022 tại Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã xây dựng quy trình Real-time PCR phát hiện tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi, hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu này đã tối ưu hóa các thông số PCR để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả cho thấy quy trình này có tiềm năng ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư. Thành công của nghiên cứu hứa hẹn đưa ra được quy trình/bộ kit xét nghiệm máu phát hiện sớm UTĐTT với độ nhạy cao, chi phí thấp, giúp Việt Nam chủ động hơn trong sản xuất kit sàng lọc UTĐTT.

5.1. Đánh Giá Độ Nhạy Độ Đặc Hiệu Xét Nghiệm SEPT9 Trong UTĐTT

Các nghiên cứu trên thế giới đã đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu dao động trong khoảng 68-95,6% và 82-98,9%, tương ứng. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu bao gồm kỹ thuật PCR, thiết kế mồi và probe, chất lượng mẫu và ngưỡng phát hiện.

5.2. Ứng Dụng Lâm Sàng Xét Nghiệm SEPT9 ColonFlag Hiệu Quả Thực Tế

Xét nghiệm SEPT9 ColonFlag là một xét nghiệm máu thương mại được FDA phê duyệt để sàng lọc UTĐTT. Tuy nhiên, các thử nghiệm lâm sàng cho thấy độ nhạy phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm I, II chỉ là 41,1% và 72%. Do đó, cần có các nghiên cứu thêm để đánh giá hiệu quả thực tế của xét nghiệm này trong sàng lọc UTĐTT trên diện rộng.

VI. Phát Hiện Methyl Hóa Gen SEPT9 Tương Lai Của Chẩn Đoán Sớm

Phát hiện methyl hóa gen SEPT9 bằng Real-time PCR hứa hẹn là một phương pháp chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng tiềm năng. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này có thể giúp phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm, khi việc điều trị có hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và đánh giá hiệu quả trên diện rộng. Phát triển các bộ kit xét nghiệm với chi phí hợp lý cũng là một yếu tố quan trọng để ứng dụng rộng rãi phương pháp này trong sàng lọc UTĐTT.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Tối Ưu Hóa Quy Trình Đánh Giá Hiệu Quả

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình Real-time PCR để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu, xác định ngưỡng phát hiện tối ưu, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nhiễu, và thực hiện các thử nghiệm lâm sàng trên diện rộng để đánh giá hiệu quả của phương pháp trong sàng lọc UTĐTT.

6.2. Tiềm Năng Phát Triển Bộ Kit Xét Nghiệm Methyl Hóa Gen SEPT9 Chi Phí Thấp

Phát triển các bộ kit xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 với chi phí hợp lý là một yếu tố quan trọng để ứng dụng rộng rãi phương pháp này trong sàng lọc UTĐTT. Cần nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật sản xuất bộ kit với chi phí thấp nhưng vẫn đảm bảo chất lượng và độ chính xác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên toàn cầu. Theo số liệu của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế năm 2020, có khoảng 1,9 triệu ca mắc mới UTĐTT, chiếm 10% tổng số ca ung thư toàn thế giới, đứng thứ ba về tỷ lệ mắc sau ung thư phổi và ung thư vú. Tại Việt Nam, UTĐTT nằm trong top 5 loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất, với hơn 16.000 ca mắc mới mỗi năm. Đáng chú ý, tỷ lệ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn chiếm khoảng 60-70%, làm giảm hiệu quả điều trị và tỷ lệ sống trên 5 năm chỉ đạt 10-40% so với 80-90% nếu phát hiện sớm.

Nghiên cứu này tập trung xây dựng quy trình phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi bằng kỹ thuật real-time PCR, nhằm hỗ trợ chẩn đoán sớm UTĐTT. Methyl hóa DNA là một biến đổi epigenetic xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thư, trong đó gen SEPT9 được xác định là dấu ấn sinh học tiềm năng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phát hiện UTĐTT. Tuy nhiên, các bộ kit thương mại hiện nay như Epi proColon® 2.0 có chi phí cao và chưa được tối ưu cho người Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm mẫu máu ngoại vi và mô bệnh phẩm của bệnh nhân UTĐTT tại Việt Nam, thực hiện trong giai đoạn 2020-2022. Mục tiêu chính là phát triển quy trình real-time PCR sử dụng phương pháp Headloop PCR để nâng cao độ nhạy, độ đặc hiệu và giảm chi phí xét nghiệm, góp phần cải thiện hiệu quả sàng lọc và chẩn đoán sớm UTĐTT trong thực tiễn y tế Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Epigenetics và methyl hóa DNA: Methyl hóa DNA tại vùng promoter gen là một cơ chế điều hòa biểu hiện gen, trong đó methyl hóa bất thường có thể dẫn đến bất hoạt gen ức chế khối u, góp phần vào quá trình ung thư hóa. Phương pháp bisulfite chuyển đổi DNA không methyl hóa thành uracil là tiêu chuẩn vàng trong phân tích methyl hóa.

• Gen SEPT9 và ung thư đại trực tràng: Gen SEPT9 mã hóa protein septin-9, tham gia vào quá trình phân chia tế bào và ổn định bộ gen. Methyl hóa vùng promoter gen SEPT9 làm giảm biểu hiện protein, liên quan đến sự phát triển UTĐTT. Đây là dấu ấn sinh học tiềm năng trong sàng lọc UTĐTT.

• Phương pháp Headloop PCR: Là kỹ thuật PCR đặc hiệu cao, sử dụng mồi Headloop để khóa và ngăn khuếch đại DNA không bị methyl hóa, chỉ khuếch đại DNA methyl hóa. Phương pháp này có độ nhạy phát hiện methyl hóa DNA rất cao (0,01%-0,001%), vượt trội so với các kỹ thuật truyền thống như HeavyMethyl.

Các khái niệm chính bao gồm: methyl hóa DNA, CpG island, bisulfite conversion, real-time PCR, độ nhạy và độ đặc hiệu xét nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 25 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân UTĐTT và 259 mẫu của người khỏe mạnh làm nhóm chứng. Ngoài ra, 9 mẫu mô bệnh phẩm FFPE từ bệnh nhân UTĐTT và các loại ung thư khác được sử dụng để khảo sát methyl hóa gen SEPT9.

• Phương pháp phân tích: DNA được tách chiết từ mẫu huyết tương và mô, xử lý bằng phản ứng bisulfite để chuyển đổi DNA không methyl hóa. Phản ứng real-time PCR được thực hiện đồng thời hai phản ứng: phản ứng đặc hiệu khuếch đại DNA methyl hóa gen SEPT9 sử dụng mồi Headloop và phản ứng tổng số khuếch đại cả DNA methyl hóa và không methyl hóa để đánh giá chất lượng mẫu.

• Tối ưu hóa quy trình: Nghiên cứu tối ưu các điều kiện phản ứng PCR như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi xuôi, mồi ngược (Headloop), probe và DMSO để đạt hiệu quả khuếch đại cao nhất với độ nhạy và độ đặc hiệu tối ưu.

• Xác định ngưỡng phát hiện: Sử dụng bộ mẫu chuẩn DNA methyl hóa và mẫu trộn chuẩn với tỷ lệ DNA methyl hóa khác nhau để xác định ngưỡng phát hiện tối thiểu của quy trình với độ tin cậy 95%.

• Phân tích thống kê: Độ nhạy và độ đặc hiệu được tính toán dựa trên kết quả xét nghiệm mẫu bệnh và mẫu chứng, sử dụng phần mềm MedCalc và chương trình PODLOD.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và thực hiện thí nghiệm từ năm 2020 đến 2022 tại Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y, Hà Nội.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và tối ưu quy trình real-time PCR: Phản ứng đặc hiệu sử dụng mồi Headloop PCR đã được tối ưu với nhiệt độ gắn mồi 57°C, nồng độ mồi ngược 0,4 µM, mồi xuôi 0,8 µM và probe 0,2 µM. Phản ứng tổng số được tối ưu đồng thời để kiểm soát chất lượng mẫu. Các điều kiện này cho phép khuếch đại chọn lọc DNA methyl hóa gen SEPT9 với giá trị Ct thấp nhất, đảm bảo độ nhạy cao.

2. Ngưỡng phát hiện quy trình: Quy trình có thể phát hiện DNA methyl hóa gen SEPT9 với ngưỡng thấp nhất khoảng 2,5 copy/µL trong bộ mẫu chuẩn và tỷ lệ DNA methyl hóa thấp nhất 0,1% trong mẫu trộn chuẩn, đạt độ tin cậy 95%. Đây là mức độ nhạy tương đương hoặc vượt trội so với các phương pháp hiện có.

3. Đánh giá trên mẫu bệnh phẩm: Trong 25 mẫu máu bệnh nhân UTĐTT, quy trình phát hiện methyl hóa gen SEPT9 cho kết quả dương tính với độ nhạy khoảng 80%, trong khi nhóm chứng 259 mẫu người khỏe mạnh có độ đặc hiệu trên 95%. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế và cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sàng lọc UTĐTT tại Việt Nam.

4. So sánh với phương pháp HeavyMethyl: Phương pháp Headloop PCR cho thấy khả năng khóa DNA không methyl hóa hiệu quả hơn, giảm hiện tượng dương tính giả và tăng độ nhạy phát hiện DNA methyl hóa gen SEPT9. Điều này giúp cải thiện chất lượng xét nghiệm và giảm chi phí do sử dụng ít hóa chất hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định vai trò quan trọng của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong phát hiện sớm UTĐTT, phù hợp với các báo cáo quốc tế cho thấy độ nhạy dao động 68-95% và độ đặc hiệu 82-98%. Việc áp dụng phương pháp Headloop PCR giúp nâng cao độ nhạy phát hiện DNA methyl hóa với ngưỡng phát hiện rất thấp, phù hợp với mẫu máu ngoại vi có lượng DNA methyl hóa thấp.

So với các phương pháp truyền thống như HeavyMethyl, Headloop PCR có ưu điểm về độ đặc hiệu và khả năng khóa DNA không mong muốn, giảm sai số xét nghiệm. Điều này đặc biệt quan trọng trong sàng lọc dân số lớn, giúp giảm tỷ lệ dương tính giả và chi phí xét nghiệm.

Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng methyl hóa gen SEPT9 tăng dần theo tiến triển bệnh, phù hợp với mô hình sinh học của UTĐTT. Việc phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi có thể trở thành công cụ hỗ trợ chẩn đoán không xâm lấn, thuận tiện và có khả năng áp dụng rộng rãi tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong chuẩn của phản ứng PCR, bảng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu giữa các phương pháp và biểu đồ tỷ lệ phát hiện methyl hóa gen SEPT9 theo giai đoạn bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai quy trình real-time PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong các chương trình sàng lọc UTĐTT: Áp dụng quy trình đã tối ưu tại các bệnh viện tuyến trung ương và tuyến tỉnh nhằm nâng cao tỷ lệ phát hiện sớm, giảm tỷ lệ tử vong do UTĐTT. Thời gian thực hiện: 1-2 năm.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ y tế về kỹ thuật Headloop PCR và xử lý mẫu DNA methyl hóa: Đảm bảo chất lượng xét nghiệm và khả năng vận hành quy trình trong thực tế. Chủ thể thực hiện: Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y phối hợp với các bệnh viện. Thời gian: 6-12 tháng.

3. Nghiên cứu mở rộng quy mô mẫu và đa dạng hóa đối tượng nghiên cứu: Bao gồm các nhóm nguy cơ cao, người có tiền sử polyp đại trực tràng để đánh giá hiệu quả sàng lọc trên diện rộng. Thời gian: 2-3 năm.

4. Phát triển bộ kit xét nghiệm nội địa dựa trên quy trình Headloop PCR: Giảm chi phí xét nghiệm, tăng khả năng tiếp cận cho người dân Việt Nam, góp phần chủ động trong công nghệ sinh học y tế. Chủ thể thực hiện: Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học. Thời gian: 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học phân tử: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về methyl hóa DNA, kỹ thuật PCR đặc hiệu và ứng dụng trong chẩn đoán ung thư.

2. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và nội soi tiêu hóa: Tham khảo quy trình xét nghiệm mới giúp nâng cao hiệu quả sàng lọc và chẩn đoán UTĐTT không xâm lấn.

3. Các cơ quan y tế và quản lý chương trình sàng lọc ung thư: Đánh giá tiềm năng áp dụng kỹ thuật mới trong các chương trình tầm soát ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và phát triển kit xét nghiệm: Tham khảo quy trình tối ưu để phát triển sản phẩm xét nghiệm nội địa, giảm chi phí và nâng cao chất lượng xét nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

1. Methyl hóa gen SEPT9 là gì và tại sao quan trọng trong UTĐTT?
   Methyl hóa gen SEPT9 là sự gắn thêm nhóm methyl vào vùng promoter của gen này, làm giảm biểu hiện protein septin-9, góp phần vào quá trình ung thư hóa đại trực tràng. Đây là dấu ấn sinh học giúp phát hiện sớm UTĐTT qua xét nghiệm máu.

2. Phương pháp Headloop PCR có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác?
   Headloop PCR có độ nhạy rất cao (phát hiện methyl hóa DNA với tỷ lệ 0,01%-0,001%), khả năng khóa DNA không methyl hóa hiệu quả, giảm sai số dương tính giả, giúp nâng cao độ chính xác xét nghiệm.

3. Quy trình real-time PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 có thể áp dụng rộng rãi không?
   Với chi phí thấp hơn và độ nhạy, độ đặc hiệu cao, quy trình này có tiềm năng áp dụng trong các chương trình sàng lọc UTĐTT tại Việt Nam, đặc biệt ở các bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương.

4. Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 là bao nhiêu?
   Nghiên cứu cho thấy độ nhạy khoảng 80% và độ đặc hiệu trên 95%, tương đương hoặc cao hơn các nghiên cứu quốc tế, phù hợp để sử dụng trong sàng lọc và hỗ trợ chẩn đoán UTĐTT.

5. Có những yếu tố nào ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9?
   Tuổi tác, giới tính, các bệnh lý nền như tiểu đường, viêm khớp, lối sống (hút thuốc, uống rượu) và kỹ thuật xử lý mẫu có thể ảnh hưởng đến kết quả, do đó cần kiểm soát chặt chẽ quy trình xét nghiệm.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình real-time PCR sử dụng phương pháp Headloop PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
• Quy trình có khả năng phát hiện DNA methyl hóa gen SEPT9 với ngưỡng thấp nhất khoảng 2,5 copy/µL và tỷ lệ methyl hóa 0,1%, phù hợp với mẫu máu ngoại vi.
• Kết quả khảo sát trên mẫu bệnh nhân UTĐTT và nhóm chứng cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán sớm UTĐTT tại Việt Nam.
• Phương pháp Headloop PCR vượt trội so với các kỹ thuật truyền thống về độ chính xác và chi phí, mở ra hướng phát triển bộ kit xét nghiệm nội địa.
• Đề xuất triển khai quy trình trong các chương trình sàng lọc UTĐTT, đào tạo nhân lực và nghiên cứu mở rộng để nâng cao hiệu quả phòng chống ung thư đại trực tràng.

Khuyến khích các cơ quan y tế và đơn vị nghiên cứu phối hợp triển khai ứng dụng quy trình, đồng thời phát triển sản phẩm xét nghiệm thương mại phù hợp với điều kiện Việt Nam nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng là một trong những loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới, đứng thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới với trên 1,9 triệu trƣờng hợp UTĐTT mắc mới năm 2020 [85] và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, UTĐTT là một trong 5 loại ung thƣ có tỉ lệ mắc và tử vong cao nhất, xếp thứ 4 ở nam giới (sau ung thƣ gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thƣ vú và phổi). Nếu đƣợc phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỉ lệ sống trên 5 năm đạt 80-90%, tuy nhiên, 60-70% ngƣời bệnh đƣợc phát hiện ở giai đoạn muộn của UTĐTT trong lần chẩn đoán đầu tiên [3, 60]. Do đó, các phƣơng pháp giúp phát hiện sớm UTĐTT đã không ngừng đƣợc phát triển nhằm giúp giảm tỉ lệ tử vong do UTĐTT gây ra.

Nội soi và sinh thiết đại trực tràng đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng trong sàng lọc, chẩn đoán UTĐTT. Tuy nhiên đây là một xét nghiệm với quy trình thực hiện phức tạp, nhiều bƣớc chuẩn bị tạo ra tâm lý ngần ngại của những ngƣời muốn tham gia các chƣơng trình sàng lọc. Do đó để nâng cao hiệu quả sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT, nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện theo hƣớng sử dụng xét nghiệm máu để phát hiện sớm UTĐTT dựa vào các chỉ thị sinh học (biomarker) đặc trƣng của UTĐTT. Các chỉ thị sinh học này có nguồn gốc từ khối u và lƣu hành trong máu ngoại vi.

Hiện tƣợng methyl hóa bất thƣờng DNA [93] là những biến đổi xảy ra sớm trong quá trình phát sinh UTĐTT [17, 72]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh DNA methyl hóa đã đƣợc tìm thấy trong máu ngoại vi với tình trạng methyl hóa khác biệt giữa ngƣời khỏe mạnh và ngƣời bệnh UTĐTT [24, 55]. Triển vọng của việc phát hiện gen SEPT9 bị methyl hóa trong sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và chứng minh [18, 55, 64, 96]. Các nghiên cứu này đều cho kết quả khả quan với độ nhạy và độ đặc hiệu dao động trong khoảng 68-95,6% và 82-98,9%, tƣơng ứng [18, 28, 40, 68, 87, 90, 96].

Đồng thời xét nghiệm phát hiện methyl hóa DNA của gen SEPT9 cũng đã đƣợc FDA phê duyệt nhƣ một xét nghiệm máu đầu tiên trong sàng lọc UTĐTT vào tháng 4 năm 2016 với bộ kit thƣơng mại Epi proColon® 2. Các thử nghiệm lâm sàng bƣớc đầu cho thấy mặc dù Epi proColon® 2.0 có độ nhạy lên tới 80,6% và độ đặc hiệu là 1 96,9% nhƣng độ nhạy phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm I, II chỉ là 41,1% và 72%. Tuy nhiên, cho đến nay, chƣa có nghiên cứu nào trong nƣớc đƣợc thực hiện nhằm làm rõ tiềm năng của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT ở ngƣời Việt Nam. Mặt khác, chi phí cho một xét nghiệm sàng lọc UTĐTT sử dụng bộ kit Epi proColon® 2.0 rất cao (8-10 triệu VNĐ), do đó rất khó để áp dụng vào các chƣơng trình sàng lọc UTĐTT tại Việt Nam.

Có lẽ vì thế xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc UTĐTT ở nƣớc ta còn hạn chế mặc dù xét nghiệm này đã khá phổ biến ở Mỹ và Châu Âu. Để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc DNA bị methyl hóa gen SEPT9 thì phƣơng pháp sử dụng là một yếu tố vô cùng quan trọng. Phƣơng pháp phát hiện DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 mà bộ kit Epi proColon® 2.0 hiện đang áp dụng là phƣơng pháp HeavyMethyl [16]. Phƣơng pháp này đã có nhiều nghiên cứu sử dụng để tối ƣu và đánh giá hiệu quả phát hiện DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 [18, 28, 87, 96, 102].

Trong khi đó, chƣa có nghiên cứu nào sử dụng phƣơng pháp Headloop PCR để phát hiện methyl hóa gen SEPT9. Vì thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu xây dựng quy trình phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi với độ nhạy cao giúp cải thiện khả năng phát hiện sớm UTĐTT và giảm giá thành xét nghiệm. Thành công của nghiên cứu hứa hẹn đƣa ra đƣợc quy trình/bộ kit xét nghiệm máu phát hiện sớm UTĐTT với độ nhạy cao, chi phí thấp, giúp Việt Nam chủ động hơn trong sản xuất kit sàng lọc UTĐTT. 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.

Tổng quan về ung thƣ đại trực tràng 1. Dịch tễ học  Ung thư đại trực tràng trên thế giới Theo số liệu thống kê mới nhất của Cơ quan nghiên cứu ung thƣ quốc tế (The International Agency for Research on Cancer - IARC) năm 2020 có 1,9 triệu ca mắc mới (chiếm 10% trên tổng số ca mắc ung thƣ trên toàn thế giới), là loại ung thƣ phổ biến thứ 3 chỉ đứng sau ung thƣ phổi và ung thƣ vú.000 ca tử vong (chiếm 9,4% trên tổng số ca mắc ung thƣ trên toàn thế giới), đứng thứ 2 về ngƣỡng báo động nguy cơ tử vong cao chỉ sau ung thƣ phổi (1,8 triệu ca tử vong, chiếm 18%) [85]. Tỉ lệ mắc cao nhất là ở Australia, New Zealand, châu Âu và Bắc Mỹ, trong khi các nƣớc châu Phi và Nam Á có tỉ lệ mắc thấp, cũng có thể do mật độ phân bố dân cƣ tại các vùng chƣa đều nên các nƣớc đang và đã phát triển thƣờng cao hơn rất nhiều [9, 85]. Khi xét về giới tính, tỉ lệ mắc ở nam giới cao hơn nữ giới ở hầu hết các nơi trên thế giới.

Một số lý do có thể đánh giá khách quan nam giới luôn có tỉ lệ mắc cao hơn nữ giới là: do thói quen ăn uống không lành mạnh, ăn quá nhiều chất đạm, mỡ sẽ làm tăng yếu tố sinh ung thƣ, làm tăng sản các tế bào biểu mô bất thƣờng và phát triển thành ung thƣ. Ngoài ra, thuốc lá là một tác nhân nguy cơ cao gây ung thƣ đại tràng cho cả hai giới, nhất là khi kết hợp với sử dụng rƣợu bia. UTĐTT có thể đƣợc coi là dấu hiệu của sự phát triển kinh tế xã hội. Đánh giá xu hƣớng mắc và tử vong do UTĐTT Arnold và cộng sự (2017) [5] xác định 3 xu hƣớng liên quan đến mức độ phát triển: 1) tỉ lệ mắc và tử vong tăng trong thập kỷ gần đây (bao gồm các nƣớc Baltic, Nga, Trung Quốc và Brazil); 2) tỉ lệ mắc tăng nhƣng tỉ lệ tử vong giảm (Canada, Vƣơng quốc Anh, Đan Mạch và Singapore); và 3) tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong giảm (Hoa Kỳ, Nhật Bản và Pháp).

Một số nƣớc có tỉ lệ mắc thấp đang có xu hƣớng mắc UTĐTT tăng lên. Ngày nay, tỉ lệ tử vong do ung thƣ đại trực tràng giảm ở nhiều nƣớc trên thế giới do quá trình sàng lọc sớm phát hiện dấu ấn ung thƣ trên tế bào, giảm các yếu tố 3 nguy cơ gây bệnh và cải thiện những phƣơng pháp điều trị trƣớc đây. Tuy nhiên, ở các nƣớc đang phát triển tỉ lệ tử vong vẫn tăng, bao gồm các nƣớc ở Nam Mỹ, Đông Âu và các nƣớc đang phát triển do nguồn kinh tế còn hạn hẹp, kéo theo các phƣơng pháp và công nghệ điều trị còn hạn chế [88]. Hơn nữa, công nghệ sinh học ở đây còn chƣa đƣợc quan tâm đề đầu tƣ phát triển nên quá trình sàng lọc phát hiện sớm các loại dấu ấn gây ung thƣ trên ngƣời còn hạn chế (thƣờng là theo nhu cầu của ngƣời bệnh) và do chi phí để trả cho một xét nghiệm còn quá cao khiến cho căn bệnh UTĐTT càng gia tăng.

 Ung thư đại trực tràng tại Việt Nam Theo số liệu thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO) năm 2020, tại Việt Nam có 16.426 ca mắc mới ung thƣ đại trực tràng, trong đó có 8.539 nữ đứng thứ 5 trên tổng số ca mắc mới các bệnh ung thƣ thƣờng gặp. Ở nam giới, ung thƣ đại trực tràng đứng thứ 4 về tỉ lệ số ca mắc mới trên tổng các bệnh ung thƣ thƣờng gặp, đứng thứ 2 về các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa chỉ sau ung thƣ dạ dày (với 11.059 ca mắc mới). Trong khi đó, nữ giới với 7.539 ca mắc mới đứng thứ 3 sau ung thƣ vú (với 15.229 ca) và ung thƣ phổi (với 7.577 ca), và đứng thứ nhất các bệnh liên quan đến tiêu hóa. UTĐTT đang có chiều hƣớng gia tăng, một phần do Việt Nam là một nƣớc đang phát triển, nguồn kinh phí để đầu tƣ cho các trang thiết bị, các phƣơng pháp điều trị còn hạn hẹp.

Hai là, do nhịp sống của con ngƣời hiện đại đang chạy theo công việc, kéo theo đó là những thói quen sinh hoạt không lành mạnh nhƣ ăn đồ ăn nhanh nhiều dầu mỡ, đồ uống có CO2, hút thuốc hay thức khuya làm ảnh hƣởng quá trình đào thải và tái tạo chu trình tế bào. Ngoài ra, những ngƣời có tiền sử bị ung thƣ buồng trứng, polyps trực tràng có kích thƣớc từ 1 cm trở lên hoặc có tế bào trông không bình thƣờng dƣới kính hiển vi cũng có nguy cơ cao mắc ung thu đại trực tràng. U nhung mao, viêm loét đại trực tràng mãn tính có nguy cơ ung thƣ từ 20-25%. Ngoài ra, ngƣời ta đã nhận thấy rằng những ngƣời thừa cân, béo phì cũng rất dễ mắc UTĐTT [2].

Tỉ lệ tử vong do ung thƣ đại trực tràng đứng thứ 5 với 8.203 ca, trong đó đứng thứ 4 ở nam giới sau ung thƣ gan, ung thƣ phổi và ung thƣ dạ dày và đứng thứ 5 ở nữ giới sau ung thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ gan và ung thƣ dạ dày. Cho thấy 4 tình trạng báo động về căn bệnh này, nên có những biện pháp khắc phục từ bên trong và những xét nghiệm tầm soát từ sớm để kiểm soát, điều trị dứt điểm trong thời gian ngắn khi bệnh mới ở gia đoạn đầu. Khi đó, bệnh dễ dàng đƣợc loại bỏ mà không gây thƣơng tổn cho các tế bào vùng khác, hơn nữa quá trình tái tạo tế bào cũng nhanh hơn, sự hồi phục của cơ thể cũng đảm bảo hơn khi chúng ta phát hiện bệnh ở những giai đoạn cuối vì ung thƣ là căn bệnh để lại nhiều hệ quả đi kèm nhƣ sức khỏe giảm sút, các tế bào chết đi gây ảnh hƣởng chu trình của các tế bào khác hay sự di căn của chúng. Mô bệnh học Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) là một bệnh lý gây ra bởi sự hình thành các tế bào ung thƣ trong các mô của đại tràng và trực tràng.

Ung thƣ đại trực tràng bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống.