Luận văn thạc sĩ hus ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen rassf1a gstp1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai điểm trong phát hiện methyl hóa gen rassf1a gstp1 ở bệnh nhân ung thư vú và tuyến tiền liệt.

• Tác giả: Đoàn Thị Hồng Vân
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƯ
• 1.1.1. Methyl hóa DNA
• 1.1.2. Methyl hóa DNA và ung thư
• 1.1.3. Methyl hóa gen GSTP1
• 1.1.4. Methyl hóa gen RASSF1A
• 1.2. MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA DNA
• 1.2.1. Các kỹ thuật phân tích phổ biến
• 1.2.2. Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)
• 1.2.3. KỸ THUẬT LAI ĐIỂM
• 1.2.3.1. Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic
• 1.2.3.2. Phương pháp đánh dấu đầu dò
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
• 2.2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP
• 2.3.1. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thư vú
• 2.3.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite
• 2.3.3. Phương pháp PCR
• 2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.5. Phương pháp xác định nồng độ DNA bằng quang phổ hấp thụ
• 2.3.6. Phương pháp lai điểm
• 2.3.7. Phương pháp phân tích thống kê sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. ĐIỀU KIỆN LAI ĐIỂM TỐI ƯU CỦA ĐẦU DÒ G200 VÀ R200 PHÂN BIỆT TRÌNH TỰ BỊ METHYL HÓA VÀ TRÌNH TỰ KHÔNG BỊ METHYL HÓA
• 3.1.1. Kết quả tinh sạch các trình tự nucleotide bị methyl hóa và trình tự nucleotide không bị methyl hóa
• 3.1.2. Kết quả tổng hợp đầu dò
• 3.1.3. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) với đầu dò G200
• 3.1.4. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200
• 3.2. PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA PROMOTER GEN GSTP1 VÀ RASSF1A BẰNG KỸ THUẬT MSP
• 3.2.1. Tách chiết DNA
• 3.2.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite
• 3.2.3. Xác định sự methyl hóa promoter của hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các mẫu bệnh phẩm
• 3.2.4. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa và các thông số sinh học
• 3.2.5. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về methyl hóa gen RASSF1A và GSTP1 trong ung thư

Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen, có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như phát triển phôi và điều hòa phiên mã. Đặc biệt, sự methyl hóa của các gen như RASSF1A và GSTP1 đã được chứng minh có liên quan mật thiết đến sự phát triển của các loại ung thư, bao gồm ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phát hiện sự methyl hóa của hai gen này, từ đó mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán và điều trị ung thư.

1.1. Methyl hóa DNA và vai trò của nó trong ung thư

Methyl hóa DNA là hiện tượng thêm một gốc methyl vào vị trí carbon số 5 của cytosine, dẫn đến sự hình thành 5-methylcytosine. Hiện tượng này có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen và liên quan đến nhiều loại ung thư. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự methyl hóa bất thường có thể dẫn đến sự bất hoạt của các gen ức chế khối u, từ đó thúc đẩy sự phát triển của khối u.

1.2. Tầm quan trọng của RASSF1A và GSTP1 trong ung thư

Gen RASSF1A và GSTP1 được biết đến như là những gen ức chế khối u. Sự methyl hóa của chúng có thể dẫn đến việc mất chức năng ức chế, tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng sự methyl hóa của hai gen này có thể được sử dụng như là một chỉ thị sinh học trong chẩn đoán và tiên lượng ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện methyl hóa gen

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong việc phát hiện sự methyl hóa gen, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Các phương pháp hiện tại như Methylation-Specific PCR (MSP) có độ nhạy cao nhưng lại không định lượng chính xác. Điều này có thể dẫn đến những kết quả không chính xác trong việc đánh giá mức độ methyl hóa của các gen như RASSF1A và GSTP1.

2.1. Những hạn chế của các phương pháp hiện tại

Các phương pháp như MSP mặc dù phổ biến nhưng có nhược điểm như không định lượng được và có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Điều này gây khó khăn trong việc xác định chính xác mức độ methyl hóa của các gen trong các mẫu bệnh phẩm.

2.2. Nhu cầu cải tiến kỹ thuật phát hiện methyl hóa

Cần thiết phải phát triển các kỹ thuật mới có khả năng định lượng chính xác hơn sự methyl hóa của DNA. Việc kết hợp các phương pháp hiện có với các công nghệ mới như lai điểm có thể giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phát hiện methyl hóa gen.

III. Phương pháp phát hiện methyl hóa gen RASSF1A và GSTP1

Để phát hiện sự methyl hóa của gen RASSF1A và GSTP1, nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật lai điểm kết hợp với Methylation-Specific PCR. Phương pháp này cho phép xác định chính xác sự methyl hóa của các gen trong các mẫu bệnh phẩm ung thư vú và tuyến tiền liệt.

3.1. Kỹ thuật lai điểm trong phát hiện methyl hóa

Kỹ thuật lai điểm cho phép phát hiện sự hiện diện của các trình tự DNA bị methyl hóa một cách chính xác. Phương pháp này sử dụng các đầu dò đặc hiệu để phân biệt giữa các trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa, từ đó cung cấp thông tin chi tiết về mức độ methyl hóa của các gen.

3.2. Quy trình thực hiện thí nghiệm

Quy trình thực hiện bao gồm các bước tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm, xử lý DNA với sodium bisulfite, và sau đó thực hiện PCR để khuếch đại các trình tự mục tiêu. Kết quả thu được sẽ được phân tích để xác định mức độ methyl hóa của gen RASSF1A và GSTP1.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa của gen RASSF1A và GSTP1 có thể được phát hiện một cách chính xác thông qua kỹ thuật lai điểm. Điều này mở ra cơ hội mới trong việc sử dụng các chỉ thị methyl hóa này để chẩn đoán sớm và tiên lượng ung thư vú và tuyến tiền liệt.

4.1. Phân tích kết quả methyl hóa gen

Kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa của gen RASSF1A và GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và tuyến tiền liệt cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy sự liên quan giữa methyl hóa gen và sự phát triển của ung thư.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Sự phát hiện methyl hóa của các gen này có thể được sử dụng như là một chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm ung thư. Điều này không chỉ giúp cải thiện khả năng phát hiện mà còn có thể hỗ trợ trong việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về methyl hóa gen RASSF1A và GSTP1 đã chỉ ra rằng sự methyl hóa có thể đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư. Việc phát hiện chính xác sự methyl hóa của các gen này không chỉ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

5.1. Tương lai của nghiên cứu methyl hóa gen

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để phát hiện sự methyl hóa gen một cách chính xác hơn. Điều này sẽ giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị ung thư, đồng thời mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế của sự methyl hóa trong ung thư.

5.2. Tầm quan trọng của methyl hóa trong y học

Methyl hóa DNA không chỉ là một chỉ thị sinh học trong ung thư mà còn có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác của y học. Việc hiểu rõ hơn về vai trò của methyl hóa trong các bệnh lý khác nhau sẽ giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen, có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học nhƣ: phát triển phôi, điều hòa phiên mã, cấu trúc nhiễm sắc thể, bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và ổn định hệ gen. Do những vai trò quan trọng đó nên hiện tƣợng methyl hóa DNA có mối liên hệ với nhiều bệnh ở ngƣời. Đối với bệnh ung thƣ, hiện tƣợng methyl hóa DNA bất thƣờng đƣợc quan sát ở các tế bào bắt đầu bị tổn thƣơng cho tới các tế bào ở các giai đoạn khác nhau. Bởi vậy, methyl hóa DNA có thể trở thành dấu chuẩn tiềm năng hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lƣợng và điều trị đích ung thƣ.

Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA ngày càng phát triển và hoàn thiện không chỉ để đáp ứng độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà còn có khả năng ứng dụng thực tiễn. Hiện nay, kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm, bởi có độ nhạy cao và không yêu cầu thiết bị đặc biệt. Mặc dù vậy, nhƣợc điểm của MSP là không định lƣợng, có hiện tƣợng dƣơng tính giả và cần thời gian chuẩn bị gel để phân tích kết quả. Do vậy, nhiều nghiên cứu đã cải tiến kỹ thuật MSP cũng nhƣ kết hợp với các kỹ thuật khác nhằm mục đích tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, khả năng ứng dụng trong thực tế và giảm chi phí.

Tiếp nối các nghiên cứu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khối u cũng nhƣ kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa DNA của Phòng Thí nghiệm Sinh Y, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ vú và ung thƣ tuyến tiền liệt”. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ 1. Methyl hóa DNA Di truyền ngoại gen là những thay đổi sự biểu hiện hoặc kiểu hình có khả năng di truyền qua các thế hệ nhƣng không do biến đổi về trình tự DNA [44].

Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen liên quan trực tiếp tới sự biến đổi hóa học DNA. Đây là hiện tƣợng thêm một gốc methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 của cytosine thành dạng 5-methylcytosine [44]. Hiện tƣợng này xảy ra ở prokaryote và eukaryote [24]. Ở vi khuẩn, methyl hóa DNA phân biệt DNA genome vi khuẩn với DNA của thực khuẩn thể, nhờ đó DNA của thực khuẩn thể bị cắt bởi các enzyme vật chủ.

Đối với thực vật, sự methyl hóa xảy ra ở các cấu trúc CG, CHG và CHH (trong đó H có thể là A, C hoặc T). Nhƣng ở động vật có vú, sự methyl hóa xảy ra ở cytosine trong dinucleotide CpG [24]. Ở động vật có vú, sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) chuyển một gốc methyl từ S-adenyl methionine (SAM) vào carbon số 5 của gốc cytosine thành dạng 5-methylcytosine [24, 44]. DNMT3A và DNMT3B có thể thiết lập sự methyl mới trên sợi DNA không đƣợc biến đổi.

Mặt khác, chức năng DNMT1 trong quá trình tái bản DNA để sao chép sự methyl hóa của sợi DNA bố mẹ tới sợi mới. Cả ba enzyme này đều liên quan tới quá trình phát triển của phôi nhƣng giảm biểu hiện vào cuối giai đoạn biệt hóa [44]. Sự methyl hóa DNA có liên quan và đóng vai trò quan trọng trong bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen, ổn định hệ gen và điều hòa biểu hiện gen [12, 61]: Bất hoạt nhiễm sắc thể X: Ở giới tính cái của động vật có vú (kiểu gen XX), một trong hai nhiễm sắc thể X bị bất hoạt để bù lại sự mất cân bằng các gen liên kết với nhiễm sắc thể X so với giới tính đực (kiểu gen XY). Quá trình này xảy ra trong giai 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đoạn phát triển phôi sớm [12].

Sự bất hoạt xảy ra ngẫu nhiên với một trong hai nhiễm sắc thể và đƣợc duy trì trên cùng nhiễm sắc thể đó trong quá trình nguyên phân của tế bào cho tới khi phát triển thành mô trƣởng thành. Cơ chế duy trì nhiễm sắc thể X bị bất hoạt là sự methyl hóa quá mức đảo CpG vùng promoter các gen phân bố dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể X bị bất hoạt (Hình 1. Sự methyl hóa DNA trong trƣờng hợp này xảy ra khá muộn [61]. Quá trình bất hoạt đƣợc khởi đầu bởi sự hoạt hóa các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis (cis-acting noncoding RNA), từ đó làm kích hoạt sự thay thế các nhân tố phiên mã, thay đổi nhiễm sắc thể và sau cùng, các CpG bị methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter [43].

Sự methyl hóa DNA rất cần thiết cho việc duy trì ổn định trạng thái không phiên mã của các gen nằm trên nhiễm sắc thể X bị bất hoạt [12]. In dấu gen: Ở động vật có vú, hệ gen có nguồn gốc từ bố và từ mẹ có chức năng không cân bằng nhau nhƣng đều cần cho sự phát triển bình thƣờng. Tính trạng của gen đƣợc biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ. Những gen đƣợc in dấu thƣờng định vị theo cụm và các allen đƣợc đánh dấu khác nhau nhờ sự methyl hóa DNA, acetyl hóa/khử acetyl hóa histone, methyl hóa histone và thƣờng liên quan tới các sợi antisene RNA [61].

Các gen trong cụm thƣờng chịu kiểm soát của vùng điều khiển in dấu ICR (Imprinting Control Region) (Hình 1. Phôi sau khi thụ tinh, methyl hóa ICR ở dòng tế bào mầm không chịu sự tái lập chƣơng trình của genome nhƣng trong quá trình phát triển của tế bào mầm, sự methyl hóa ICR bị xóa và đƣợc thiết lập lại. ICR hoạt động khi không bị methyl hóa và không hoạt động khi bị methyl hóa. Ở trạng thái hoạt động, ICR sẽ điều khiển các gen bị in dấu biểu hiện [48].

Ổn định hệ gen: Methyl hóa DNA đóng vai trò ổn định hệ gen bằng cách bất hoạt phiên mã các trình tự DNA lặp lại và các transposon nội sinh [61]. Hoạt động phiên mã ở các vùng này bị ức chế bởi sự methyl hóa quá mức. Nếu các transposon không bị ức chế bởi sự methyl hóa thì có thể làm đồng hoạt hóa các gen xung quanh hoặc phiên mã các yếu tố có khả năng di chuyển (Hình 1. Nếu vùng lặp lại ở gần 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tâm động đƣợc hoạt hóa phiên mã thì gây ra sắp xếp lại các vùng lân cận tâm động, có khả năng là nguyên nhân dẫn đến các nhiễm sắc thể không xếp hàng trong nguyên phân (Hình 1.

Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú [43]. (A) Phân loại promoter của gen dựa trên mật độ CpG bị methyl hóa. (B) Các transposon bị ức chế bởi sự methyl hóa DNA. (C) Sự methyl hóa DNA ức chế phiên mã của các trình tự lặp lại vùng tâm động.

(D) Sự methyl hóa DNA duy trì bất hoạt gen trên một nhiễm sắc thể X. (E) In dấu gen điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu allen. Sự methyl hóa DNA tại vùng điều khiển in dấu điều hòa các protein bám hoặc biểu hiện của các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis. Điều hòa biểu hiện gen: Phân bố CpG đƣợc coi là vùng quan trọng cho sự điều hòa của di truyền ngoại gen tới biểu hiện gen [41].

CpG phân bố không ngẫu nhiên trong genome mà tập trung thành vùng đƣợc gọi là đảo CpG [11]. Đảo CpG chiếm 1- 2% genome, dài 200 bp đến vài kb, thành phần G và C ít nhất chiếm 50% với tỉ lệ quan sát/mong đợi >0,6 [11, 41]. Các nghiên cứu hiện tại bổ sung thêm vào xung quanh đảo CpG các vùng CpG lân cận. Mặc dù các vùng này có mật độ CpG thấp hơn nhƣng lại có chức năng quan trọng đối với điều hòa biểu hiện gen.

Ví dụ, trong quá trình biệt hóa 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tế bào, sự methyl hóa vùng CpG cách đảo CpG 2 kb diễn ra mạnh hơn sự methyl hóa tại đảo CpG, chứng tỏ vai trò chính của vùng lân cận này đối với hƣớng biệt hóa của tế bào [14]. Đảo CpG thƣờng gần với vùng promoter và/hoặc exon của gen [11]. Mật độ CpG vùng promoter xác định sự methyl hóa sẽ ảnh hƣởng tới biểu hiện gen (Hình 1. Theo nghiên cứu của Lister và cs.

(2009), vùng promoter giàu CpG (High- density CpG Promoter, HCP) không bị methyl hóa ở tất cả các mô ngay cả khi sự phiên mã của gen liên quan bị bất hoạt. Vùng promoter mật độ CpG thấp (Low-density CpG Promoter, LCP) hầu nhƣ bị methyl hóa không kể tới sự hoạt hóa hay ức chế của gen. Ngƣợc lại, sự methyl hóa ở vùng promoter có mật độ CpG trung bình (Intermediate- density CpG Promoter, ICP) có liên quan tới sự bất hoạt gen [40]. Bất hoạt phiên mã bởi sự methyl hóa DNA chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ mặc dù đã có nhiều cơ chế đƣợc đƣa ra.

Cơ chế thứ nhất, sự methyl hóa tại trình tự DNA điều hòa đặc hiệu và việc thêm nhóm methyl vào DNA có thể ngăn cản các protein điều hòa bám vào trình tự này [12]. Vì thế, sự methyl hóa DNA theo cơ chế này sẽ trực tiếp ngăn cản các gen hoạt động. Một cơ chế khác điều hòa gián tiếp thông qua protein bám DNA. Những protein này có vùng bám DNA bị methyl hóa nên có thể nhận biết và bám vào một hoặc nhiều CpG bị methyl hóa.

Sau đó, chúng tƣơng tác hoặc tham gia vào phức bất hoạt quá trình phiên mã nhƣ phức tái cấu trúc nhiễm sắc thể và/hoặc các enzyme biến đổi histone [12]. Methyl hóa DNA và ung thƣ Methyl hóa DNA có nhiều ƣu điểm để trở thành chỉ thị sinh học trong ung thƣ và ứng dụng trong lâm sàng. Thứ nhất, các chỉ thị methyl hóa DNA đặc hiệu cho các tế bào khối u và xảy ra với phần trăm cao hơn so với biến đổi di truyền [30]. Thứ hai, DNA là phân tử hóa học ổn định, vì thế, có thể khuếch đại và phát hiện dễ dàng.

Thứ ba, các khối u có nhiều vùng bị methyl hóa bất thƣờng, một trong số đó đặc hiệu cho từng loại khối u trong khi một số khác có mặt ở hầu hết các loại khối u [30]. Do đó, methyl hóa bất thƣờng DNA có thể đƣợc tìm thấy trong các tế bào biểu mô có vẻ bình 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thƣờng [30].