Chương 1 TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về PCV2 1. Phân loại PCV2 Porcine circovirus (PCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Dựa vào kích thước virion và cấu trúc bộ gen của vi-rút, Ủy ban quốc tế về phân loại vi-rút (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) năm 2017 chia họ Circoviridae thành 2 giống là Circovirus và Cyclovirus (Breitbart và ctv, 2017).
Porcine circovirus gồm 3 type là PCV1, PCV2 và PCV3 (Rosario và ctv, 2017; Lefkowitz và ctv, 2018). Dựa vào kết quả phân tích bộ gen, các nhà nghiên cứu còn phân chia PCV2 thành các genotype. Grau-Roma và ctv (2008) đã đề ra một định nghĩa cho các genotype PCV2, dựa trên các so sánh trình tự theo cặp (PAirwise Sequence Comparisions - PASC) để xác định mức độ biến đổi di truyền (p), giá trị này được tính toán bằng cách chia số nucleotide khác nhau cho tổng số nucleotide so sánh giữa các bộ gen (Kumar và ctv, 2001). Kết quả là xây dựng một khoảng cách p và biểu đồ tần số cho phép xác định các giá trị ngưỡng để phân biệt các genotype với nhau (Rogers và Harpending, 1992; Biagini và ctv, 1999).
Có 2 cách để phân chia các genotype của PCV2: (1) dựa trên sự phân tích toàn bộ bộ gen PCV2 với giá trị ngưỡng p = 0,02 (Grau-Roma và ctv 2008); (2) dựa trên mức độ biến đổi di truyền của ORF2 thì giá trị ngưỡng p = 0,035 (Segalés và ctv, 2008). Gần đây, Franzo và Segalés (2018) đề xuất cách phân loại genotype PCV2 dựa trên 3 tiêu chí, đó là khoảng cách di truyền (p-diastance) tối đa giữa các genotype (intra-genotype) là 13% (dựa trên trình tự ORF2), giá trị bootstrap ở các nút (node) > 70% và có ít nhất 15 trình tự chuỗi có sẵn. Các phân lập PCV2 được chia thành 8 genotype chính là PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d (trước đây còn gọi là mutant PCV2b, viết tắt là mPCV2b), PCV2e (Xiao và ctv, 2015; Davies và ctv, 2016), PCV2f (Bao và ctv, 2017), PCV2g và luan an 5 PCV2h (Franzo và Segalés, 2018). Dựa vào kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại, Xiao và ctv (2015) phân PCV2d thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d- 2.
Ngoài ra, còn có sự hiện diện của nhóm PCV2 tái tổ hợp (recombinant cluster) còn được gọi là các chủng trung gian (intermediate strains) trong thực địa (Cai và ctv, 2012; Xiao và ctv, 2015; Franzo và ctv, 2016). Nhóm tác giả Franzo và ctv (2016) đã phân tích 898 trình tự chuỗi nucleotide ở 32 quốc gia từ năm 1980 đến 2014 (dữ liệu thu thập từ GenBank). Kết quả cho thấy có đến 33% (304/898) trình tự chuỗi nucleotide được nhận dạng là tái tổ hợp. Hầu hết các quốc gia ở khắp các châu lục đều có sự lưu hành của nhóm tái tổ hợp, trong đó có Việt Nam.
Đáng lưu ý, theo cách phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2 trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp (recombinant cluster) nay được xếp vào genotype PCV2g và PCV2f. Kết quả phân tích của Franzo và Segalés (2018) cho thấy có đến 45/75 chủng PCV2 của Việt Nam đăng ký trên GenBank (đến thời điểm ngày 5 tháng 7 năm 2018) được xếp vào PCV2h mà trước đây các chủng này được xếp vào nhóm tái tổ hợp. Vì thế, trong phần trình bày này các chủng trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nhưng nay theo cách phân loại mới được xếp vào PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h). Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2 PCV có kích thước rất nhỏ, đường kính khoảng 17 ± 1,3 nm, không có vỏ bọc (Tischer và ctv, 1982).
Virion hình cầu, đối xứng 20 mặt, với 60 phân tử protein capsid (Crowther và ctv, 2003), chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước khoảng 1,76 - 1,77 kb (Meehan và ctv, 1997; 1998). PCV rất ổn định ở điều kiện khác nhau của môi trường, đề kháng rất cao với nhiệt độ và pH: ổn định ở pH = 3, nhiệt độ 560C và 700C trong 15 phút. Các thí nghiệm in vitro cho thấy, PCV2 đề kháng với nhiệt độ khô, khả năng gây nhiễm của PCV2 giảm tương ứng 0,75log và 1,25log sau khi xử lý nhiệt độ khô ở 800C trong vòng 72 giờ và 1200C trong vòng 30 phút (Welch và ctv, 2006). PCV2 bị bất hoạt ở nhiệt độ ướt 800C trong 15 phút (O'Dea và ctv, 2008).
Ở pH = 2, trong vòng 30 phút, hiệu giá PCV2 giảm từ 5,5 log xuống còn 2,7 log (Kim và ctv, 2009c). Tính gây nhiễm của PCV2 giảm đáng kể ở pH = 11 và hầu như biến mất ở pH = 12 (Lyoo, 2009). Hiệu giá vi-rút cũng giảm bởi một số chất sát trùng gốc kiềm (ví dụ như luan an 6 NaOH), các tác nhân oxy hóa (ví dụ như sodium hypochlorite) hoặc amonium bậc 4 (Royer và ctv, 2001; Martin và ctv, 2008). PCV2 đề kháng với chloroform, các chế phẩm chứa cồn, iodine, formaldehyde và phức hợp chlohexidine.
Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2 PCV2 là vi-rút phát triển chậm, một chu kỳ nhân lên của PCV2 trên tế bào PK15 mất khoảng 30 - 36 giờ (Cheung và Bolin, 2002; Meerts và ctv, 2005a). PCV2 nhân lên trong tế bào dòng thận heo PK15 và cũng nhân lên trong một số loại tế bào tế bào sơ cấp như tế bào đơn nhân tim thai (fetal cardinomonocyte - FCM), đại thực bào phế nang heo (porcine alveolar marcophage - PAM), tế bào đơn nhân máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC), tế bào tua (dendritic cell - DC) nhưng hiệu giá vi-rút đạt được rất thấp (Gilpin và ctv, 2003; Vincent và ctv, 2003; Meerts và ctv, 2005a; Chang và ctv, 2006; Yu và ctv, 2007b). Kết quả nghiên cứu của Allan và ctv (1994) về một số đặc tính sinh học của PCV cho thấy, PCV cũng có thể nhân lên trên các tế bào có nguồn gốc từ heo và tế bào Vero, các tế bào sơ cấp từ bò và cừu cũng nhạy cảm với PCV nhưng không thể tiếp đời PCV trên các tế bào này.
Cấu trúc bộ gen PCV2 PCV2 chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước từ 1. Bộ gen PCV2 được sắp xếp thành 11 khung đọc mở giả định (open reading frames - ORF). Trong đó, ORF1, luan an 7 ORF5, ORF7 và ORF10 nằm trên chuỗi dương cùng chiều kim đồng hồ, ngược lại các ORF2, 3, 4, 6, 8, 9 và 11 nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ (Hamel và ctv, 1998). Ở vùng trung gian lớn giữa ORF1 và ORF2 chứa gốc sao chép (Origin of DNA replication - Ori), có một cấu trúc cuống - vòng (stem - loop), giúp PCV2 nhân lên theo cơ chế vòng tròn lăn.
Đến nay, chỉ xác định được 4 khung đọc mở mã hóa protein đó là ORF1, 2, 3 và 4 (Hình 1.2), riêng protein được mã hóa từ ORF5 cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu thêm để xác định vai trò cụ thể của protein này (Lv và ctv, 2015). Cấu trúc bộ gen PCV2. ORF1 (màu đỏ) mã hóa protein Rep và Rep’. ORF2 (màu xanh dương) mã hóa protein Cap.
ORF3 (màu xanh lá cây) mã hóa protein ORF3. ORF4 (màu vàng) mã hóa protein ORF4. Gốc sao chép (Ori) nằm ở vùng trung gian giữa các điểm bắt đầu của 2 khung đọc ORF1 và ORF2. H1, H2, H3 và H4 là các hexanucleotide (Faurez và ctv, 2009) ORF1 còn được gọi là gen Rep, dài 945 nucleotide, nằm trên chuỗi dương và theo chiều kim đồng hồ, là vùng rất bảo tồn của giống Circovirus, mã hóa protein không luan an 8 cấu trúc là enzyme Rep (helicase) chứa 314 aa và Rep’ (nickase) chứa 178 aa.
Đây là hai protein rất cần thiết cho sự nhân lên của ADN-PCV trong tế bào ký chủ (Mankerts và Hillenbrand, 2001; Cheung, 2003). Protein Rep đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với PCV2. Do bởi Rep là protein cần thiết cho sự nhân lên của PCV2, các đáp ứng miễn dịch chống lại protein này có lẽ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chế ngự sự nhân lên của PCV2 và ngăn chặn tiến trình chuyển từ trạng thái nhiễm PCV2 sang PMWS trên heo (Fort và ctv, 2010). ORF2 còn gọi là gen Cap, nằm trên chuỗi bổ sung và theo chiều ngược chiều kim đồng hồ, dài từ 702 đến 708 nucleotide, mã hóa protein cấu trúc duy nhất Cap (capsid) chứa 233-235 aa (Mankertz và ctv, 2000; Nawagitgul và ctv, 2000; Guo và ctv, 2010), là protein sinh miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào đối với PCV2 (Mahé và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003; Fort và ctv, 2010), có chức năng rất quan trọng trong việc giúp vi-rút bám và xâm nhập vào tế bào ký chủ (Khayat và ctv, 2011).
Sự biến đổi di truyền xảy ra ở protein Cap có thể có ảnh hưởng rất lớn đến độc lực của PCV2 in vivo cũng như khả năng nhân lên của vi-rút in vitro (Fenaux và ctv, 2004b). Vì thế, hầu hết các nghiên cứu về PCV2 như chẩn đoán, phân tích di truyền, miễn dịch và vắc-xin đều tập trung vào ORF2 và protein Cap. ORF3 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp với ORF1, nó nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ, dài 315 nucleotide mã hóa protein chứa 104 aa (Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998; Morozov và ctv, 1998). Protein ORF3 của PCV2 có liên quan đến sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào nuôi cấy in vitro và tác động lên sự sinh bệnh của vi-rút in vivo (Liu và ctv, 2006).
ORF4 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp và cùng chiều với ORF3, dài 180 nucleotide, mã hóa chuỗi protein chứa 59 aa, protein này không cần thiết cho sự nhân lên của PCV2, nhưng đóng vai trò trong việc ngăn chặn hoạt động caspase và điều hòa lym- phô T CD4+ and CD8+ trong suốt quá trình nhiễm PCV2 (He và ctv, 2013). Các bệnh do circovirus trên heo 1. Tên gọi Hội chứng còi trên heo sau cai sữa (post weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) được mô tả đầu tiên vào năm 1991 ở Canada như là một bệnh lẻ tẻ. luan an 9 Biểu hiện đặc trưng của hội chứng này là giảm tăng trọng một cách nhanh chóng, suy hô hấp và da tái nhợt ở heo sau cai sữa (Clark, 1996; Harding, 1996).
Sau đó, có nhiều bằng chứng chứng minh, ngoài PMWS, PCV2 còn liên quan đến một số bệnh khác trên heo như bệnh rối loạn sinh sản (West và ctv, 1999), hội chứng viêm da và bệnh lý thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome - PDNS) (Rosell và ctv, 2000), bệnh hô hấp phức hợp trên heo (porcine respiratory disease complex – PRDC) (Thacker và Thacker, 2000), bệnh viêm phổi hoại tử và tăng sinh (proliferative and necrotising pneumonia – PNP) (Allan và Ellis, 2000), bệnh viêm ruột (Jensen và ctv, 2006).