Luận văn thạc sĩ hus xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở việt nam bằng kỹ thuật realtime pcr

Nghiên cứu phương pháp phát hiện HPV nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung tại Việt Nam bằng kỹ thuật realtime PCR, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Vân Trang
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Xây dựng phƣơng pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus nguy cơ cao gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Human Papillomavirus
• 1.2. Đặc điểm hình thái của HPV
• 1.3. Đặc điểm sinh học phân tử
• 1.4. Chức năng và sản phẩm của các gen HPV
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Sinh phẩm và vật tư tiêu hao
• 2.3. Máy móc và thiết bị
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 2.4.2. Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 2.4.3. Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52
• 2.5. Nội dung thực hiện
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 3.1.1. Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe
• 3.1.2. Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe
• 3.2. Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52
• 3.2.1. Khuếch đại trình tự đích
• 3.2.2. Nhân dòng gen tạo chứng dương
• 3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR
• 3.3. Thẩm định phƣơng pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.1. Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.2. Xác định độ chụm (hệ số tái lập và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.2.1. Xác định hệ số lặp lại của phương pháp
• 3.3.2.2. Xác định hệ số tái lập của phương pháp
• 3.3.3. Xác định độ đặc hiệu của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• 3.3.4. Xác định độ nhạy của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện HPV nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung

Human Papillomavirus (HPV) là một trong những tác nhân chính gây ra ung thư cổ tử cung (UTCTC) ở phụ nữ. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV cao, đặc biệt là các chủng nguy cơ cao như HPV 16 và 18. Việc phát hiện sớm HPV có thể giúp giảm thiểu nguy cơ mắc UTCTC. Kỹ thuật Realtime PCR đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả trong việc phát hiện các chủng HPV này.

1.1. Giới thiệu về HPV và mối liên hệ với ung thư cổ tử cung

HPV là virus lây truyền qua đường tình dục, có nhiều loại khác nhau. Các chủng HPV nguy cơ cao, như HPV 16 và 18, có khả năng gây ra UTCTC. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, UTCTC là loại ung thư phổ biến thứ hai ở phụ nữ. Việc hiểu rõ về HPV và mối liên hệ của nó với UTCTC là rất quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa.

1.2. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng đang gia tăng. Theo các nghiên cứu, khoảng 8% phụ nữ trong độ tuổi sinh sản có thể nhiễm HPV. Điều này đặt ra thách thức lớn cho hệ thống y tế trong việc phát hiện và điều trị sớm các trường hợp nhiễm HPV, nhằm giảm thiểu tỷ lệ mắc UTCTC.

II. Thách thức trong việc phát hiện HPV nguy cơ cao ở Việt Nam

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện HPV, nhưng việc áp dụng chúng trong thực tế vẫn gặp nhiều khó khăn. Chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật phức tạp là những rào cản lớn. Hơn nữa, việc phát hiện sớm các dấu hiệu của UTCTC thường bị bỏ qua do thiếu thông tin và nhận thức trong cộng đồng.

2.1. Chi phí và khả năng tiếp cận các phương pháp xét nghiệm

Chi phí cho các bộ xét nghiệm HPV hiện tại còn cao, khiến nhiều phụ nữ không thể tiếp cận. Điều này dẫn đến việc phát hiện muộn các trường hợp nhiễm HPV, làm tăng nguy cơ phát triển UTCTC. Cần có các giải pháp để giảm chi phí và tăng cường khả năng tiếp cận cho người dân.

2.2. Thiếu thông tin và nhận thức về HPV

Nhiều người dân vẫn chưa hiểu rõ về HPV và mối liên hệ của nó với UTCTC. Việc thiếu thông tin này dẫn đến sự thờ ơ trong việc thực hiện các xét nghiệm sàng lọc. Cần có các chiến dịch truyền thông để nâng cao nhận thức và khuyến khích phụ nữ tham gia sàng lọc.

III. Phương pháp Realtime PCR trong phát hiện HPV nguy cơ cao

Kỹ thuật Realtime PCR là một trong những phương pháp hiện đại và hiệu quả nhất trong việc phát hiện HPV. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng HPV nguy cơ cao, từ đó giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

3.1. Nguyên lý hoạt động của Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng phản ứng chuỗi polymerase để khuếch đại DNA của virus HPV. Kỹ thuật này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại trong thời gian thực, giúp xác định sự hiện diện của HPV một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. Lợi ích của việc sử dụng Realtime PCR

Sử dụng Realtime PCR mang lại nhiều lợi ích, bao gồm độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện HPV. Phương pháp này cũng giúp giảm thời gian chờ đợi kết quả, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc điều trị và quản lý bệnh nhân.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Realtime PCR trong phát hiện HPV

Việc áp dụng Realtime PCR trong phát hiện HPV đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp này có thể phát hiện chính xác các chủng HPV nguy cơ cao, từ đó giúp các bác sĩ đưa ra các biện pháp điều trị kịp thời.

4.1. Kết quả nghiên cứu về hiệu quả của Realtime PCR

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Realtime PCR có thể phát hiện các chủng HPV nguy cơ cao với độ nhạy lên đến 95%. Điều này cho thấy phương pháp này là một công cụ hữu ích trong việc sàng lọc và phát hiện sớm UTCTC.

4.2. Thực tiễn áp dụng Realtime PCR tại các cơ sở y tế

Nhiều cơ sở y tế tại Việt Nam đã bắt đầu áp dụng Realtime PCR trong việc phát hiện HPV. Điều này không chỉ giúp nâng cao chất lượng chẩn đoán mà còn góp phần giảm tỷ lệ mắc UTCTC trong cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của phát hiện HPV ở Việt Nam

Việc phát hiện HPV nguy cơ cao là rất quan trọng trong việc phòng ngừa UTCTC. Kỹ thuật Realtime PCR đã chứng minh được hiệu quả của mình trong việc phát hiện sớm các chủng HPV. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới để nâng cao khả năng phát hiện và điều trị.

5.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm HPV

Phát hiện sớm HPV có thể giúp giảm thiểu nguy cơ mắc UTCTC. Việc nâng cao nhận thức và khuyến khích phụ nữ tham gia sàng lọc là rất cần thiết.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu và phát triển

Cần có các nghiên cứu tiếp theo để cải thiện các phương pháp phát hiện HPV, đồng thời phát triển các chiến lược phòng ngừa hiệu quả hơn nhằm giảm tỷ lệ mắc UTCTC tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư cổ tử cung là một trong những gánh nặng y tế nghiêm trọng hàng đầu đối với sức khỏe phụ nữ trên toàn cầu. Theo các thống kê dịch tễ học quốc tế, mỗi năm thế giới ghi nhận khoảng 529.000 ca mắc mới và hơn 275.000 trường hợp tử vong, trong đó trên 85% số ca tử vong xảy ra tại các quốc gia đang phát triển. Riêng tại khu vực Châu Á, số ca mắc mới mỗi năm lên tới 312.000 trường hợp, chiếm 59% tổng số ca bệnh toàn cầu. Tại Việt Nam, ung thư cổ tử cung đứng thứ hai trong các bệnh ung thư phụ khoa ở phụ nữ trong độ tuổi 15-44, với hơn 5.000 ca mắc mới và trên 2.000 ca tử vong hằng năm. Tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus trong cộng đồng phụ nữ Việt Nam dao động từ 5,3% tại Hà Nội đến 14,0% tại Cần Thơ, trong đó tỷ lệ nhiễm các chủng nguy cơ cao tại hai đô thị lớn là Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh đạt mức bình quân 8,2%.

Thực tế y khoa cho thấy virus Human Papillomavirus là nguyên nhân căn bản dẫn đến 100% các ca ung thư cổ tử cung. Trong đó, hai chủng HPV 16 và HPV 18 chịu trách nhiệm cho khoảng 70% tổng số ca bệnh, còn các chủng nguy cơ cao khác như HPV 31, 33, 35, 45, 52 và 58 chiếm khoảng 20%. Quá trình tiến triển từ khi nhiễm virus ban đầu, qua các giai đoạn tổn thương tiền ung thư đến ung thư xâm lấn thường kéo dài từ 10 đến 25 năm. Đây chính là khoảng thời gian vàng cho công tác tầm soát và phát hiện sớm. Tuy nhiên, các xét nghiệm tế bào học thông thường có độ nhạy hạn chế, trong khi các bộ kit sinh học phân tử thương mại ngoại nhập lại có chi phí quá cao đối với điều kiện kinh tế của đa số người dân. Trước bối cảnh đó, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm đã được thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong giai đoạn 2014-2016 nhằm xây dựng và thẩm định quy trình multiplex Realtime PCR phát hiện đồng thời các chủng HPV 16, 18, 33/52 cùng chứng nội kiểm trên mẫu dịch phết cổ tử cung của phụ nữ Việt Nam, tạo tiền đề cho việc tự chủ kỹ thuật chẩn đoán với chi phí hợp lý.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử của họ Papillomaviridae và cơ chế sinh ung thư biểu mô cổ tử cung do các chủng HPV nguy cơ cao gây ra. Hạt virus HPV có kích thước nhỏ với đường kính 52-55 nm, cấu trúc không màng bọc với vỏ capsid gồm 72 capsomer được cấu tạo từ protein cấu trúc chính L1 (55 kDa, chiếm 80% tổng lượng protein) và protein capsid phụ L2 (70 kDa). Bộ gen của virus là ADN mạch đôi dạng vòng siêu xoắn dài khoảng 8.000 cặp base, chứa 8 khung đọc mở phân chia thành ba vùng chức năng chính: vùng mã hóa sớm (gồm các gen E1, E2, E4, E5, E6, E7), vùng mã hóa muộn (gồm gen L1, L2) và vùng điều hòa dài LCR/URR dài khoảng 800 đến 1.000 bp.

Trong cơ chế sinh ung, hai oncoprotein E6 và E7 đóng vai trò then chốt trong việc biến đổi và bất tử hóa tế bào chủ. Protein E6 liên kết trực tiếp với protein ức chế khối u p53 và kích hoạt quá trình thoái giáng p53 qua con đường ubiquitin nội bào, làm mất khả năng kích hoạt chết theo chu trình (apoptosis) và ngừng chu kỳ tế bào tại pha G1/S. Song song đó, protein E7 gắn kết với protein ức chế khối u pRb với ái lực cao gấp 10 lần ở các chủng nguy cơ cao so với chủng nguy cơ thấp, giải phóng yếu tố phiên mã E2F tự do, thúc đẩy tế bào phân chia liên tục và gây mất ổn định bộ gen. Cơ sở kỹ thuật của nghiên cứu dựa trên nguyên lý Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan có đầu 5' gắn chất phát huỳnh quang và đầu 3' gắn chất hấp phụ, kết hợp gen chứng nội kiểm Hydroxymethylbilane synthase (HMBS) nằm trên nhiễm sắc thể số 11 của người để kiểm soát chất lượng mẫu ADN và loại trừ hoàn toàn hiện tượng âm tính giả do chất ức chế phản ứng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là các mẫu ADN tách chiết từ dịch phết âm đạo của phụ nữ độ tuổi từ 18 đến 45 tại Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, đã được xác định kiểu gen bằng bộ sinh phẩm chuẩn thương mại Cobas 4800 của Roche và giải trình tự gen tại Viện Ung thư Cộng hòa Liên bang Đức. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm nhóm mẫu nhỏ dưới 5 mẫu cho mỗi chủng phục vụ việc thiết kế và tối ưu hóa điều kiện phản ứng, cùng bộ mẫu thẩm định gồm 20 mẫu dương tính và 20 mẫu âm tính đại diện cho nhiều kiểu gen HPV khác nhau. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích dựa trên các mẫu chuẩn đã biết rõ kiểu gen được áp dụng nhằm đảm bảo độ tin cậy và tính khách quan cao nhất cho quy trình đánh giá.

Lý do lựa chọn phương pháp multiplex Realtime PCR là khả năng phát hiện đồng thời nhiều trình tự gen đích trong cùng một ống phản ứng nhờ sử dụng 4 kênh màu huỳnh quang chuyên biệt: kênh HEX cho HPV 16 (vùng gen E6-E7), kênh Cy5 cho HPV 18 (gen L1), kênh FAM cho HPV 33/52 (gen L1) và kênh Cy5.5 cho gen chứng nội kiểm HMBS. Kỹ thuật này giúp rút ngắn 75% thời gian xét nghiệm, tiết kiệm hơn 50% chi phí hóa chất so với các phản ứng PCR đơn lẻ và loại bỏ nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại thường gặp ở phương pháp điện di truyền thống. Chu trình nhiệt được tối ưu hóa gồm giai đoạn hoạt hóa enzyme ở 95°C trong 10 phút, tiếp nối bởi 45 chu kỳ gồm 95°C trong 15 giây và 60°C trong 60 giây trên hệ thống Rotor-Gene Q. Hệ thống chứng dương plasmid tái tổ hợp chứa các đoạn chèn HPV16 E6-E7 (876 bp), HPV18 L1 (1.720 bp) và HPV52 L1 (1.606 bp) được tạo dòng trên vector pGEM-T Easy và pENTR D-TOPO trong tế bào khả biến E. coli TOP10, phục vụ việc đánh giá giới hạn phát hiện từ nồng độ 10 bản sao đến 10 tỷ bản sao trên mỗi microlit.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các phát hiện thực nghiệm quan trọng khẳng định hiệu quả vượt trội của quy trình multiplex Realtime PCR:

Thứ nhất, hệ thống 4 cặp mồi và mẫu dò TaqMan có kích thước khuếch đại ngắn dưới 200 bp đã thể hiện tính đặc hiệu tuyệt đối khi phân tích cả trên phản ứng đơn mồi và đa mồi. Kênh HEX chỉ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang đối với HPV 16, kênh Cy5 đối với HPV 18, kênh FAM đối với HPV 33/52 và kênh Cy5.5 đối với gen HMBS, hoàn toàn không xuất hiện hiện tượng dương tính chéo hay nhiễu tín hiệu giữa các kênh huỳnh quang khi thử nghiệm với 10 kiểu gen HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp khác nhau như HPV 31, 39, 45, 51, 56, 62, 66, 68 và 81.

Thứ hai, nghiên cứu đã tạo dòng và tinh sạch thành công 3 plasmid chứng dương mang đoạn chèn kích thước chuẩn gồm HPV16 E6-E7 (876 bp), HPV18 L1 (1.720 bp) và HPV52 L1 (1.606 bp), đạt độ tinh sạch cao qua đo quang phổ OD và giải trình tự nucleotide. Phản ứng multiplex Realtime PCR tối ưu hóa đạt giới hạn phát hiện dao động từ 10 đến 100 bản sao trên mỗi phản ứng, tương đương khả năng phát hiện lượng virus cực thấp trong bệnh phẩm lâm sàng.

Thứ ba, kết quả thử nghiệm độ chính xác trên 6 mẫu dương tính và 3 mẫu âm tính cho thấy sự thống nhất 100% giữa phương pháp nghiên cứu và bộ sinh phẩm chuẩn quốc tế Cobas 4800 Roche. Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) giữa hai phương pháp có độ tương đồng rất cao, điển hình như mẫu A248 của HPV 16 đạt Ct 27,3 so với 26,2 của bộ kit đối chứng; mẫu A149 của HPV 18 đạt Ct 27,8 so với 24,9.

Thứ tư, thử nghiệm thẩm định độ chụm khẳng định tính ổn định cao của phương pháp. Hệ số lặp lại trong cùng một mẻ chạy và hệ số tái lập giữa 3 kỹ thuật viên độc lập thực hiện ở các thời điểm khác nhau đều đạt độ lệch chuẩn rất thấp, với hệ số biến thiên dưới 3,5%. Đánh giá trên 20 mẫu dương tính và 20 mẫu âm tính xác nhận phương pháp đạt độ nhạy chẩn đoán 100% (20/20 mẫu) và độ đặc hiệu chẩn đoán 100% (20/20 mẫu).

Thảo luận kết quả

Hiệu năng cao của phản ứng multiplex Realtime PCR bắt nguồn từ việc tính toán chính xác nồng độ mồi ở mức 400 nM và mẫu dò ở mức 100 nM, kết hợp hệ đệm QuantiFast chứa nồng độ ion magie và enzyme Taq polymerase cân bằng trong thể tích phản ứng 15 µl. So sánh với các phương pháp lai bắt giữ như Hybrid Capture 2 vốn chỉ cảnh báo chung về nhóm nguy cơ cao mà không phân định được từng chủng, kỹ thuật này cho phép định danh chính xác hai chủng có độc lực cao nhất là HPV 16 và HPV 18, đồng thời phát hiện thêm nhóm HPV 33/52. Điều này có ý nghĩa dịch tễ học thực tiễn vô cùng lớn tại Việt Nam, nơi chủng HPV 52 có tỷ lệ lưu hành đáng kể, đứng hàng đầu trong các tổn thương cổ tử cung bên cạnh HPV 16 và 18.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được biểu diễn trực quan và khoa học thông qua biểu đồ đường cong khuếch đại huỳnh quang 4 màu biểu thị sự gia tăng tín hiệu vượt qua ngưỡng huỳnh quang nền theo số chu kỳ nhiệt, đi kèm bảng ma trận so sánh đối chiếu giá trị Ct giữa các kỹ thuật viên. Hiện tượng giá trị Ct trong phản ứng đa mồi tăng nhẹ từ 0,5 đến 1,5 chu kỳ so với phản ứng đơn mồi được giải thích là do sự cạnh tranh cơ chất dNTP và enzyme giữa 4 hệ mồi trong cùng một vi ống phản ứng. Tuy nhiên, sự biến động nhỏ này không ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện của hệ thống xét nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn y tế, luận văn đưa ra 4 đề xuất hành động cụ thể với chỉ số mục tiêu và lộ trình rõ ràng:

• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm: Đề nghị Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương chủ trì phối hợp cùng các bệnh viện phụ sản tuyến trung ương triển khai thử nghiệm trên cỡ mẫu từ 500 đến 1.000 bệnh phẩm thực địa trong vòng 12 đến 18 tháng tới, nhằm củng cố dữ liệu lâm sàng phục vụ quy trình đăng ký cấp phép lưu hành sinh phẩm y tế.
• Chuẩn hóa và thương mại hóa bộ sinh phẩm chẩn đoán: Các đơn vị nghiên cứu cần liên kết với các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế trong nước để hoàn thiện quy trình đóng gói bộ kit multiplex Realtime PCR dạng hóa chất sẵn sàng sử dụng hoặc dạng đông khô, đặt mục tiêu giảm từ 40% đến 50% giá thành xét nghiệm so với các bộ kit nhập khẩu trong giai đoạn 2 năm tới.
• Tích hợp xét nghiệm vào chương trình tầm soát ung thư quốc gia: Đề xuất Bộ Y tế và Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật tại các tỉnh thành phố đưa kỹ thuật xét nghiệm HPV DNA bằng Realtime PCR vào phác đồ sàng lọc đầu tay định kỳ cho phụ nữ từ 25 đến 65 tuổi, hướng tới mục tiêu bao phủ trên 70% đối tượng nguy cơ cao đến năm 2030.
• Nâng cấp đào tạo kỹ thuật viên và kiểm định chất lượng: Các trường đại học y dược phối hợp với các viện nghiên cứu chuyên ngành tổ chức từ 10 đến 15 khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật sinh học phân tử và quản lý chất lượng phòng xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 15189 cho đội ngũ cán bộ y tế tuyến tỉnh trong giai đoạn 2026-2028.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm sau:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học và Y sinh học: Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thiết kế primer và probe đặc hiệu trên các phần mềm tin sinh học như Mega 5 và Primer 5, phương pháp tạo dòng plasmid chứng dương và quy trình thẩm định kỹ thuật sinh học phân tử theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025.
• Bác sĩ sản phụ khoa và chuyên viên xét nghiệm tại các bệnh viện: Giúp nhân viên y tế nắm vững cơ chế sinh bệnh học phân tử của các chủng HPV nguy cơ cao, nâng cao năng lực biện giải kết quả chu kỳ ngưỡng Ct và tối ưu hóa phác đồ chỉ định kết hợp giữa xét nghiệm HPV DNA và xét nghiệm tế bào học Pap smear.
• Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm chẩn đoán in vitro: Các công ty công nghệ sinh học có thể khai thác các thông số tối ưu về nồng độ hóa chất, chu trình nhiệt và phương pháp kiểm chuẩn nội kiểm để rút ngắn quy trình nghiên cứu, phát triển và thương mại hóa các bộ sinh phẩm chẩn đoán phân tử sản xuất trong nước.
• Nhà quản lý y tế và chuyên gia hoạch định chính sách y tế công cộng: Cung cấp nguồn số liệu dịch tễ học xác thực và mô hình kỹ thuật khả thi để xây dựng chiến lược quốc gia về phòng chống ung thư cổ tử cung, kết hợp giữa tiêm chủng vắc xin và sàng lọc phát hiện sớm với chi phí tối ưu.

Câu hỏi thường gặp

• Kỹ thuật multiplex Realtime PCR trong luận văn phát hiện được những chủng HPV cụ thể nào? Phương pháp phát hiện đồng thời 4 nhóm tác nhân gồm chủng nguy cơ cao HPV 16 (kênh huỳnh quang HEX), HPV 18 (kênh Cy5), nhóm HPV 33/52 (kênh FAM) và gen quản gia HMBS của người làm chứng nội kiểm (kênh Cy5.5). Đây là những chủng có tỷ lệ lưu hành và độc lực gây ung thư cổ tử cung cao nhất tại Việt Nam.

• Tại sao nghiên cứu lại chọn gen HMBS làm chứng nội kiểm trong phản ứng? Gen Hydroxymethylbilane synthase (HMBS) nằm trên nhiễm sắc thể số 11 của người, hiện diện ổn định trong mọi tế bào biểu mô thu thập được. Tín hiệu dương tính của gen HMBS ở kênh Cy5.5 khẳng định quá trình lấy mẫu đạt chuẩn, tách chiết ADN thành công và phản ứng không bị ức chế bởi các hóa chất ngoại lai.

• Hệ thống chứng dương plasmid được tạo ra bằng cách nào và giữ vai trò gì? Các đoạn gen đích gồm HPV16 E6-E7 (876 bp), HPV18 L1 (1.720 bp) và HPV52 L1 (1.606 bp) được nhân bản và chèn vào vector plasmid, sau đó biến nạp vào vi khuẩn E. coli TOP10. Hỗn hợp plasmid này đóng vai trò mẫu chuẩn định lượng, kiểm soát chất lượng phản ứng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật.

• Phương pháp Realtime PCR có ưu thế gì vượt trội so với xét nghiệm Pap smear truyền thống? Xét nghiệm Pap smear chỉ phát hiện khi tế bào đã có biến đổi hình thái với độ nhạy dao động từ 50% đến 70% và phụ thuộc nhiều vào mắt người đọc. Ngược lại, Realtime PCR phát hiện trực tiếp ADN của virus với độ nhạy đạt 100%, giúp cảnh báo nguy cơ trước khi hình thành khối u từ 10 đến 15 năm.

• Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp đã được thẩm định như thế nào? Kỹ thuật được thẩm định trên 20 mẫu dương tính và 20 mẫu âm tính chuẩn đã được xác định kiểu gen bởi hệ thống Cobas 4800 Roche và giải trình tự gen tại Đức. Kết quả thực nghiệm khẳng định phương pháp đạt độ nhạy chẩn đoán 100% và độ đặc hiệu chẩn đoán 100%, hoàn toàn không ghi nhận kết quả dương tính giả hay âm tính giả.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật multiplex Realtime PCR 4 kênh màu phát hiện chính xác các chủng HPV nguy cơ cao gồm HPV 16, 18, 33/52 cùng chứng nội kiểm HMBS trong một phản ứng duy nhất.
• Tạo dòng và tinh sạch thành công hệ thống chứng dương plasmid tái tổ hợp cho 3 đoạn gen đích với độ tinh sạch cao, xác định giới hạn phát hiện đạt từ 10 đến 100 bản sao trên mỗi phản ứng.
• Quy trình đạt độ nhạy chẩn đoán 100%, độ đặc hiệu chẩn đoán 100% và độ lặp lại cao với hệ số biến thiên dưới 3,5% khi đối chiếu với sinh phẩm chuẩn thương mại quốc tế Cobas 4800 Roche.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung mở rộng thử nghiệm lâm sàng trên 500 đến 1.000 mẫu thực địa và hoàn thiện quy trình đóng gói bộ kit thương mại trong vòng 12 đến 24 tháng tới nhằm phục vụ y tế cộng đồng.
• Kết quả nghiên cứu là bước tiến vững chắc trong việc tự chủ công nghệ sinh học phân tử phục vụ tầm soát sớm ung thư cổ tử cung tại Việt Nam, rất mong nhận được sự quan tâm hợp tác và chuyển giao ứng dụng từ các bệnh viện và cơ sở y tế trên toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư trong các loại ung thư mà nữ giới thường mắc phải và xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41]. HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong các nguyên nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinhv.v…[32] Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển[21]. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới – đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.000 phụ nữ) và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40]. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài. Quá trình tiến triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các kit chẩn đoán đã thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8]. Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phƣơng pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR” được thực hiện với mục tiêu sau: 1.

Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR. Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung. Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 CHƢƠNG1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người. Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi là Human papillomavirus(HPV).1Đặc điểm hình thái của HPV HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 52- 55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu).Hạt vi rút của HPV[14] Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14].2Đặc điểm sinh học phân tử 1.1 Cấu trúc hệ gen HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong lớp vỏ capsid protein. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 Hình 1.Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16[14] Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappillomavirus nói chung tương tự nhau ở các loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy nhất.

Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng chức năng[26]: 1. Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tương ứng. Sản phẩm của vùng gen này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên ADN của virus, gây hiện tượng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử. Vùng mã hóa muộn (Late region) gồm 2 gen mã hóa protein cấu trúc lớp vỏ capsid L1 và L2.

Vùng kiểm soát dài LRC (Long Control Region) hay còn gọi là vùng điều hòa URR (Upstream Regulatory Region) chứa ADN không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép ADN và quá trình phiên mã. Đây là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộ gen, tương đương 800 đến 1000bp tùy từng genotype khác nhau. Trình tự vùng này gồm: - Trình tự tăng cường là nơi gắn của các yếu tố phiên mã như AP-1, NF1, TEF1, TEF2, YY1. - Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu phiên mã tổng hợp RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở HPV18).

- Điểm khởi đầu sao chép ORI và một số chuỗi gen câm (Silencing gene). 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 1.2Chức năng và sản phẩm của các gen HPV  Chức năng gen E1 HPV là virus sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép ADN. Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép ADN và plasmid. Protein E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình tái bản (ORI), thực hiện quá trình tháo xoắn ADN (Helicase) và giúp chuổi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép.

Hoạt động tháo xoắn ADN của E1 không cần ATP. Khi xâm nhập vào trong tế bào, E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình sao chép của virus. Protein E2 còn có khả năng gắn với chuỗi ADN đặc hiệu (ở vị trí E2-E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên cả hai chức năng của protein E2 đều do gen E1 điều chỉnh.

 Chức năng gen E2 Ngoài chức năng trong sao chép ADN của virus, protein mã hoá bởi gen E2 còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng như trong quá trình điều hòa giải mã và duy trì ADN virus ở ngoài NST. Chức năng điều hòa giải mã của E2 được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của virus có ái lực với E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quá trình giải mã Trong hệ gen của nhóm HPV nguy cơ cao (HR-HPV), gen E2 mã hoá cho protein có khả năng ức chế quá trình sao chéo bằng các yếu tố thúc đẩy biểu hiện các gen ở vùng mã hóa sớm của virus, do đó khi nhóm HR-HPV cài gen vào trong NST vật chủ sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của gen gây ung thư E6, E7.  Chức năng của protein E1^E4 (quá trình splicing giữa gen E1 và E4) Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm được tạo ra từ mRNA kết nối chuỗi mã hóa 5 axit amin đầu tiên của E1 và ORF của E4 khi mở vòngdịch chuyển gen E1 và E4. Protein này có chức năng giúp cho quá trình trưởng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.

ProteinE1^E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của vi rút gồm: (1) Dạng gen chứa nhiều leucine ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho nhân lên của ADN; (2) Vùng chứa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thanh Tâm – K22 mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; (3) Đầu tận cùng C chứa domain đơn dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1^E4 tạo ra sự polimerize, gắn với DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin[23].  Chức năng của protein mã hoá bởi gen E5 Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nội chất của tế bào, cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ. Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm vào trong tế bào, tạo ra phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngặn chặn sự chết theo chu trình (apotosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra. Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào.

 Chức năng gen E6 Gen E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với Zn điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên trong chuỗi gen HPV và là một trong những protein gây ung thư chính của HPV.