Luận văn: Quy trình phân tích THC-COOH trong máu bằng LC-MS/MS

Phân tích THC-COOH trong máu bằng LC-MS/MS: Tìm hiểu phương pháp định lượng chính xác, độ nhạy cao. Ứng dụng trong pháp y, kiểm tra chất kích thích.

Chuyên ngành

Hóa học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Luận văn thạc sĩ

2021

83
2
0

Phí lưu trữ

30 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

MỞ ĐẦU

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Cần sa, các chế phẩm của cần sa và tác hại của chúng

1.1.1. Giới thiệu về cần sa

1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa

1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa

1.2. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự

1.2.1. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa

1.2.2. THC và sự chuyển hóa THC trong máu

1.3. Tổng quan về các phương pháp tách chiết THC-COOH trong máu

1.3.1. Phương pháp kết tủa protein

1.3.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng

1.3.3. Phương pháp chiết pha rắn

1.4. Tổng quan về một số phương pháp phân tích THC-COOH trong máu

1.4.1. Sắc kí khí khối phổ (GC-MS)

1.4.2. Sắc kí lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS)

1.4.3. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH

2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

2.1.3. Mẫu nghiên cứu

2.1.4. Nội dung nghiên cứu

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị

2.2.2. Phương pháp thực nghiệm

2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
2.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu
2.2.2.3. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS
2.2.2.4. Khảo sát dung môi chiết
2.2.2.5. Khảo sát môi trường (pH) chiết
2.2.2.6. Khảo sát độ thu hồi của phương pháp
2.2.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
2.2.2.8. Thẩm định phương pháp
2.2.2.8.1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
2.2.2.8.2. Độ chọn lọc của phương pháp
2.2.2.8.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
2.2.2.8.4. Độ đúng và độ chính xác
2.2.2.8.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
2.2.2.9. Phân tích mẫu thực tế

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên LC-MS/MS

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết

3.2.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết

3.2.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH)

3.3. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp

3.4. Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu

3.5. Thẩm định phương pháp và ứng dụng phân tích THC-COOH trong mẫu máu bằng LC-MS/MS

3.5.1. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng THC-COOH trong máu

3.5.2. Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

3.5.3. Xây dựng đường chuẩn và định lượng

3.5.4. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

3.6. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị LC-MS/MS

3.7. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế

3.8. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích, phương pháp phân tích LC-MS/MS và đóng góp mới của đề tài

3.8.1. Đánh giá đối tượng mẫu phân tích và phương pháp phân tích LC-MS/MS

3.8.2. Đóng góp mới của đề tài

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan phương pháp phân tích THC COOH bằng LC MS MS

Việc xác định sự hiện diện của cần sa trong cơ thể người đóng vai trò then chốt trong công tác giám định pháp y và y tế. Hoạt chất chính gây tác động tâm thần trong cần sa là Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Sau khi vào cơ thể, THC được chuyển hóa nhanh chóng thành các chất khác nhau, trong đó 11-nor-9-Carboxy-THC (THC-COOH) là chất chuyển hóa không hoạt động chính và tồn tại lâu nhất. Do đó, định lượng THC-COOH trong các mẫu sinh học như máu, huyết tương là bằng chứng xác thực cho việc sử dụng cần sa. Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS) đã nổi lên như một công cụ tiêu chuẩn vàng để phân tích các chất ma túy và độc chất. Kỹ thuật này mang lại độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác vượt trội so với các phương pháp truyền thống như sắc ký khí khối phổ (GC-MS). Một ưu điểm lớn của phương pháp LC-MS là khả năng phân tích trực tiếp các hợp chất phân cực như THC-COOH mà không cần qua giai đoạn dẫn xuất hóa, giúp tiết kiệm thời gian và giảm thiểu sai số trong quy trình xét nghiệm. Luận văn của Đỗ Thị Hiếu (2021) đã tập trung vào việc "Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol trong máu bằng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép LC-MS/MS", cung cấp một cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng phương pháp này tại các phòng thí nghiệm giám định tại Việt Nam. Bài viết này sẽ phân tích chi tiết quy trình được xây dựng, từ khâu xử lý mẫu đến các kết quả thẩm định, nhằm cung cấp một cái nhìn toàn diện và chuyên sâu về kỹ thuật phân tích tiên tiến này.

1.1. Tầm quan trọng của chất chuyển hóa của THC trong xét nghiệm

Khi phân tích việc sử dụng cần sa, việc xác định chất chuyển hóa của THC quan trọng hơn là xác định chính THC. Lý do là THC có thời gian bán hủy trong máu rất ngắn, nồng độ giảm nhanh chỉ sau vài giờ. Ngược lại, THC-COOH được tạo ra trong gan qua quá trình oxy hóa, tồn tại trong máu và huyết tương trong nhiều ngày, thậm chí vài tuần đối với người sử dụng thường xuyên. Điều này biến THC-COOH trở thành dấu ấn sinh học cần sa lý tưởng để xác nhận việc sử dụng trong quá khứ, thay vì chỉ xác định tình trạng nhiễm độc cấp tính. Theo tài liệu, "thời gian để phát hiện được cần sa phụ thuộc rất lớn vào tần suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên... nồng độ THC-COOH trong máu có thể đạt hàng trăm ng/ml" (Đỗ Thị Hiếu, 2021). Do đó, việc tập trung phân tích THC-COOH cho phép các nhà giám định pháp y và bác sĩ có được một cửa sổ phát hiện rộng hơn, cung cấp bằng chứng đáng tin cậy cho các mục đích pháp lý và lâm sàng.

1.2. Ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ so với phương pháp cũ

Trước đây, sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp phổ biến để phân tích cannabinoid. Tuy nhiên, phương pháp này có một nhược điểm lớn: các hợp chất như THC-COOH không đủ bay hơi để phân tích trực tiếp. Do đó, quy trình yêu cầu một bước dẫn xuất hóa phức tạp để biến đổi phân tử thành dạng dễ bay hơi hơn. Bước này không chỉ tốn thời gian mà còn có thể làm giảm độ thu hồi và tăng khả năng sai số. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS) đã khắc phục hoàn toàn hạn chế này. Như được nhấn mạnh trong nghiên cứu: "Sử dụng sắc ký lỏng khối phổ kép ta bỏ qua bước dẫn xuất, vừa kinh tế và hiệu quả" (Đỗ Thị Hiếu, 2021). LC-MS/MS cho phép phân tích trực tiếp THC-COOH trong dung dịch, tăng độ nhạy (đạt tới giới hạn phát hiện (LOD) rất thấp), tăng độ chọn lọc nhờ kỹ thuật giám sát đa phản ứng (MRM), và giảm thiểu nhiễu từ nền mẫu, làm cho nó trở thành lựa chọn tối ưu cho phân tích độc chất hiện đại.

II. Thách thức chính khi phân tích THC COOH từ mẫu máu

Mặc dù phương pháp phân tích THC-COOH trong máu bằng LC-MS/MS có nhiều ưu điểm, quá trình này vẫn đối mặt với những thách thức đáng kể, chủ yếu xuất phát từ sự phức tạp của nền mẫu sinh học. Máu, và đặc biệt là huyết tương, là một ma trận phức tạp chứa hàng ngàn hợp chất khác nhau như protein, lipid, muối và các chất chuyển hóa nội sinh. Các thành phần này có thể gây ra hiện tượng "ảnh hưởng nền mẫu" (matrix effect), một trong những trở ngại lớn nhất trong xét nghiệm ma túy trong máu. Hiện tượng này xảy ra khi các hợp chất trong nền mẫu cùng được rửa giải với chất phân tích, gây ức chế hoặc tăng cường quá trình ion hóa trong nguồn khối phổ, dẫn đến kết quả định lượng không chính xác. Việc loại bỏ hoàn toàn các thành phần gây nhiễu này là một yêu cầu bắt buộc để đảm bảo độ tin cậy của phép phân tích. Do đó, khâu xử lý mẫu máu đóng vai trò quyết định đến sự thành công của toàn bộ quy trình. Một quy trình xử lý mẫu không hiệu quả không chỉ làm sai lệch kết quả mà còn có thể làm hỏng các bộ phận đắt tiền của hệ thống LC-MS/MS, chẳng hạn như cột sắc ký. Thêm vào đó, nồng độ THC-COOH trong máu có thể rất thấp (chỉ vài ng/mL), đòi hỏi phương pháp phải đạt được giới hạn định lượng (LOQ) đủ thấp để phát hiện. Điều này yêu cầu quy trình tách chiết không chỉ phải sạch mà còn phải có hiệu suất thu hồi cao, đảm bảo lượng chất phân tích đủ lớn để vượt qua ngưỡng phát hiện của thiết bị.

2.1. Vấn đề ảnh hưởng nền mẫu trong xét nghiệm huyết tương

Ảnh hưởng nền mẫu là một thách thức cố hữu khi xét nghiệm cần sa trong huyết tương. Protein, đặc biệt là albumin, và phospholipid là những tác nhân chính gây nhiễu. Chúng có thể liên kết với chất phân tích, làm giảm hiệu suất chiết. Nghiêm trọng hơn, trong nguồn ion hóa ESI của máy khối phổ, chúng có thể cạnh tranh với THC-COOH trong quá trình tạo ion, dẫn đến hiện tượng ức chế ion (ion suppression). Điều này làm giảm tín hiệu của chất phân tích, dẫn đến kết quả thấp giả hoặc thậm chí không phát hiện được chất dù nó có mặt trong mẫu. Nghiên cứu của Đỗ Thị Hiếu (2021) đã dành một phần quan trọng để "Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu" nhằm đảm bảo rằng quy trình xử lý đã loại bỏ hiệu quả các thành phần này. Việc sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị (isotopically labeled internal standard) như THC-COOH-d3 là một giải pháp hiệu quả để bù trừ cho ảnh hưởng nền mẫu, vì chất nội chuẩn này có tính chất hóa lý tương tự chất phân tích và sẽ chịu ảnh hưởng tương tự trong quá trình phân tích.

2.2. Yêu cầu về độ nhạy Đạt giới hạn phát hiện LOD thấp

Trong giám định pháp y, việc phát hiện THC-COOH ở nồng độ rất thấp là cực kỳ quan trọng, ví dụ như để xác định việc sử dụng cần sa sau một thời gian dài hoặc trong các vụ án liên quan đến lái xe dưới ảnh hưởng của chất kích thích. Các cơ quan quản lý thường đặt ra các ngưỡng nồng độ (cut-off) cụ thể cho việc báo cáo kết quả dương tính. Do đó, phương pháp phân tích phải có giới hạn phát hiện (LOD)giới hạn định lượng (LOQ) thấp hơn các ngưỡng này. Để đạt được độ nhạy cần thiết, quy trình xử lý mẫu phải tối ưu hóa hiệu suất thu hồi. Mất mát chất phân tích trong các bước chiết, rửa, hay cô cạn đều có thể khiến nồng độ cuối cùng rơi xuống dưới LOQ. Nghiên cứu đã thực hiện "Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)" một cách cẩn thận để chứng minh rằng phương pháp được xây dựng có đủ độ nhạy để ứng dụng trong thực tế, đáp ứng các yêu cầu khắt khe của ngành.

III. Hướng dẫn quy trình xử lý mẫu máu để định lượng THC COOH

Để vượt qua các thách thức về nền mẫu và đạt được độ nhạy cần thiết, một quy trình xét nghiệm tối ưu cho việc xử lý mẫu máu là yếu tố tiên quyết. Nghiên cứu của Đỗ Thị Hiếu (2021) đã xây dựng một quy trình hiệu quả dựa trên sự kết hợp giữa hai kỹ thuật cơ bản: kết tủa protein và chiết lỏng-lỏng (LLE). Lựa chọn này được đưa ra nhằm "phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm Kỹ thuật hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước", ưu tiên tính đơn giản, hiệu quả và chi phí hợp lý so với các kỹ thuật phức tạp hơn như phương pháp chiết pha rắn (SPE). Quy trình bắt đầu bằng việc lấy 1 ml mẫu máu (hoặc huyết tương), sau đó thêm chất nội chuẩn (THC-COOH-d3) để kiểm soát sự biến thiên trong quá trình xử lý. Bước tiếp theo là kết tủa protein. Axit trichloroacetic (TCA) được sử dụng không chỉ để loại bỏ phần lớn protein gây nhiễu mà còn để điều chỉnh pH của dung dịch về môi trường axit, tạo điều kiện tối ưu cho bước chiết lỏng-lỏng sau đó. Sau khi ly tâm để loại bỏ tủa protein, phần dịch trong ở trên được thu lại và tiến hành chiết với một hỗn hợp dung môi hữu cơ đã được khảo sát kỹ lưỡng. Dịch chiết hữu cơ chứa THC-COOH sau đó được cô cạn đến khô, hòa cặn lại trong một thể tích nhỏ dung môi pha động và sẵn sàng để tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Quy trình này đảm bảo loại bỏ phần lớn các chất cản trở, làm giàu chất phân tích và mang lại hiệu suất thu hồi cao, là nền tảng cho một phép định lượng THC-COOH chính xác.

3.1. Bước 1 Kết tủa protein và tối ưu hóa môi trường chiết pH

Bước đầu tiên và quan trọng nhất trong xử lý mẫu máu là loại bỏ protein. Nghiên cứu đã sử dụng dung dịch axit TCA. Việc này đạt được hai mục đích: "vừa kết tủa protein vừa tạo môi trường pH chiết" (Đỗ Thị Hiếu, 2021). Môi trường pH ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết. Vì THC-COOH là một axit carboxylic, nó sẽ tồn tại ở dạng không ion hóa (trung hòa về điện) trong môi trường axit. Dạng này dễ dàng hòa tan vào pha hữu cơ không phân cực hơn. Nghiên cứu đã tiến hành "Khảo sát môi trường chiết (pH)" trong khoảng từ 1 đến 5. Kết quả cho thấy tại pH = 4, độ thu hồi chất phân tích đạt cao nhất (81,1%). Điều này cho thấy việc kiểm soát chặt chẽ pH là yếu tố then chốt để tối ưu hóa quá trình tách chiết THC-COOH từ nền mẫu huyết tương phức tạp.

3.2. Bước 2 Tối ưu dung môi cho phương pháp chiết lỏng lỏng

Sau khi điều chỉnh pH, bước tiếp theo là chiết THC-COOH vào một pha hữu cơ không trộn lẫn với nước. Việc lựa chọn dung môi chiết đóng vai trò quyết định. Nghiên cứu đã khảo sát các tỷ lệ khác nhau của hỗn hợp dung môi hexane và ethyl acetate. Hexane là dung môi không phân cực, trong khi ethyl acetate có độ phân cực thấp hơn. Sự kết hợp này nhằm tối ưu hóa khả năng hòa tan THC-COOH. Kết quả từ bảng "Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các tỉ lệ dung môi khác nhau" cho thấy tỷ lệ hexane/ethyl acetate 9:1 (v/v) cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, đạt 82,8%. Sự lựa chọn này không chỉ dựa trên hiệu quả chiết mà còn vì đây là những dung môi "dễ mua, ít tốn kém, thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích ma túy... ít độc hại hơn so với các dung môi khác" (Đỗ Thị Hiếu, 2021). Điều này làm tăng tính ứng dụng thực tiễn của quy trình.

IV. Cách thiết lập điều kiện phân tích THC COOH trên LC MS MS

Sau khi mẫu đã được chuẩn bị cẩn thận, bước tiếp theo là phân tích THC-COOH trong máu bằng LC-MS/MS. Việc thiết lập các thông số vận hành của thiết bị một cách chính xác là yếu tố quyết định để đạt được độ phân giải, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Hệ thống được sử dụng trong nghiên cứu là LC-MS/MS Bruker EVOQ Qube, một thiết bị hiện đại có khả năng định lượng đáng tin cậy. Quá trình phân tích bao gồm hai phần chính: tách sắc ký lỏng (LC) và phát hiện bằng khối phổ kép (MS/MS). Phần LC có nhiệm vụ tách THC-COOH và chất nội chuẩn THC-COOH-d3 ra khỏi các thành phần còn lại trong dịch chiết. Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng một cột sắc ký pha đảo C18 và một chương trình rửa giải gradient, trong đó thành phần pha động thay đổi theo thời gian để tối ưu hóa việc tách. Sau khi được tách, các chất phân tích đi vào nguồn ion hóa của máy khối phổ, nơi chúng được chuyển thành các ion ở pha khí. Tại đây, chế độ giám sát đa phản ứng (MRM) được sử dụng để phát hiện. Chế độ này mang lại độ chọn lọc cực cao bằng cách chỉ theo dõi các cặp ion mẹ-ion con đặc trưng cho từng chất, giúp loại bỏ hoàn toàn tín hiệu nhiễu và đảm bảo việc định lượng THC-COOH là chính xác tuyệt đối. Việc tối ưu hóa từng thông số, từ thành phần pha động đến thế năng va chạm trong khối phổ, đều được thực hiện để xây dựng một phương pháp LC-MS mạnh mẽ và đáng tin cậy.

4.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký Pha động và cột phân tích

Để tách hiệu quả THC-COOH, nghiên cứu đã lựa chọn cột C18 (100 mm x 2.1 mm), một loại cột pha đảo phổ biến. Chương trình pha động gradient được sử dụng với hai kênh: Kênh A là dung dịch đệm amoni acetat và Kênh B là hỗn hợp dung môi hữu cơ acetonitrile (ACN) và methanol (MeOH). Nồng độ dung dịch đệm amoni acetat có ảnh hưởng lớn đến hình dạng peak và hiệu quả ion hóa. Nghiên cứu đã khảo sát ba nồng độ khác nhau: 2 mM, 5 mM, và 10 mM. Kết quả cho thấy "hệ dung môi 2 (5 mM) cho peak đặc trưng nét và ổn định" (Đỗ Thị Hiếu, 2021). Nồng độ thấp hơn (2 mM) cho peak không rõ ràng, trong khi nồng độ cao hơn (10 mM) gây ra sự không ổn định và có nguy cơ kết tủa muối làm hỏng hệ thống. Do đó, nồng độ 5 mM amoni acetat được chọn làm điều kiện tối ưu cho sắc ký lỏng khối phổ.

4.2. Xây dựng phương pháp MRM và chọn cặp ion phân mảnh đặc trưng

Độ chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS nằm ở kỹ thuật MRM. Trong chế độ ion hóa ESI âm, phân tử THC-COOH nhận một proton để tạo thành ion mẹ [M-H]- có tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) là 343. Ion này sau đó được chọn lọc và phá vỡ trong buồng va chạm để tạo ra các ion con đặc trưng (ion phân mảnh). Nghiên cứu đã xác định các cặp chuyển đổi MRM tối ưu. Đối với THC-COOH, ion mẹ m/z 343 được theo dõi khi chuyển thành các ion con m/z 299 và m/z 245.1. Trong đó, cặp 343 -> 245.1 được chọn làm cặp định lượng để tránh nhiễu tiềm tàng từ THC chưa chuyển hóa. Tương tự, đối với chất nội chuẩn phân tích đồng vị THC-COOH-d3, cặp ion định lượng là 346 -> 302.2. Việc lựa chọn các cặp ion đặc trưng này đảm bảo rằng tín hiệu đo được chỉ thuộc về chất cần phân tích, mang lại độ tin cậy cao cho cả việc sàng lọc và khẳng định.

V. Kết quả thẩm định quy trình phân tích THC COOH trong máu

Một quy trình phân tích chỉ được coi là đáng tin cậy và có thể áp dụng trong thực tiễn, đặc biệt là trong lĩnh vực giám định pháp y, sau khi đã trải qua quá trình thẩm định nghiêm ngặt. Thẩm định phương pháp là quá trình chứng minh bằng thực nghiệm rằng phương pháp đó phù hợp với mục đích sử dụng. Nghiên cứu của Đỗ Thị Hiếu (2021) đã tiến hành thẩm định toàn diện quy trình xét nghiệm theo các hướng dẫn quốc tế, đánh giá các tiêu chí quan trọng như độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, và giới hạn phát hiện. Kết quả thẩm định đã chứng minh rằng phương pháp phân tích THC-COOH trong máu bằng LC-MS/MS được xây dựng là mạnh mẽ, chính xác và đáng tin cậy. Độ chọn lọc được xác nhận khi không có tín hiệu nhiễu nào xuất hiện tại thời gian lưu của chất phân tích trong các mẫu trắng. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp đều nằm trong giới hạn chấp nhận được, cho thấy kết quả định lượng là nhất quán và sát với giá trị thực. Các thông số này khẳng định rằng quy trình không chỉ hoạt động tốt trong điều kiện lý tưởng của phòng thí nghiệm mà còn có khả năng ứng dụng để phân tích các mẫu thực tế với độ tin cậy cao, đáp ứng yêu cầu khắt khe của công tác giám định nồng độ cồn và ma túy.

5.1. Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính tối ưu

Để thực hiện hiệu chuẩn định lượng, một dãy dung dịch chuẩn THC-COOH trên nền mẫu huyết tương trắng đã được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 400 ng/ml). Đường chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ số diện tích peak (chất phân tích/nội chuẩn) vào nồng độ. Kết quả cho thấy phương pháp có khoảng tuyến tính rộng, với hệ số tương quan R² luôn lớn hơn 0,99. Một hệ số R² cao cho thấy mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa tín hiệu và nồng độ, là điều kiện tiên quyết cho một phép định lượng chính xác. Khoảng tuyến tính rộng này cho phép phương pháp có thể định lượng chính xác nồng độ THC-COOH trong cả mẫu của người sử dụng không thường xuyên (nồng độ thấp) và người sử dụng thường xuyên (nồng độ cao).

5.2. Đánh giá độ đúng độ chính xác và hiệu suất thu hồi

Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi, thể hiện phần trăm chất phân tích được tìm lại sau toàn bộ quá trình xử lý mẫu. Kết quả cho thấy độ thu hồi của THC-COOH dao động trong khoảng 78,2% đến 82,4% ở các mức nồng độ khác nhau, đây là một kết quả rất tốt. Độ chính xác, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%), đánh giá mức độ lặp lại của các kết quả. Cả độ chính xác trong cùng một ngày và giữa các ngày khác nhau đều cho thấy giá trị RSD thấp (dưới 15%), đáp ứng các tiêu chuẩn thẩm định phương pháp phân tích sinh học. Các kết quả này chứng tỏ quy trình có độ lặp lại cao và đáng tin cậy, một yêu cầu bắt buộc đối với các xét nghiệm carboxy-THC dùng cho mục đích pháp lý.

5.3. Xác định LOD LOQ và ứng dụng phân tích mẫu máu thực tế

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là những thông số quan trọng thể hiện độ nhạy của phương pháp. Chúng được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Phương pháp đã được xác định có LOD và LOQ đủ thấp để phát hiện THC-COOH ở nồng độ có ý nghĩa trong giám định. Sau khi thẩm định thành công, quy trình đã được "Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế". Các mẫu máu thu thập từ những đối tượng nghi sử dụng cần sa đã được phân tích. Kết quả đã phát hiện và định lượng được THC-COOH ở các nồng độ khác nhau, khẳng định tính khả thi và giá trị thực tiễn của phương pháp trong công tác đấu tranh phòng chống tội phạm liên quan đến ma túy.

27/09/2025

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó. Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Đó là nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người, cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu, gian lận, tham nhũng. Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat.

Cần sa ban đầu được sử dụng cho mục đích gây hưng phấn và mục đích y học. Đến năm 1930 bị coi là bất hợp pháp, kể từ những năm 1960 việc sử dụng nó đã tăng lên đáng kể. Hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần sa đang ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều. Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng, chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài.

Từ cần sa người ta đã phân lập được khoảng 61 chất khác nhau, với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần sa [1, 2]. Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50% lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong toàn cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp theo.

Sau khi hút cần sa, được chuyển nhanh vào hệ tuần hoàn rùi qua phổi sang máu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH và các sản phẩm liên hợp với một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3, 4, 5]. Đây chính là các đối tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa. 2 Việc phân tích THC-COOH trong máu có thể thực hiện bằng phân tích miễn dịch, sắc ký khí khối phổ (GC-MS), hay bằng sắc ký lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS). Tuy nhiên, phương pháp GC-MS yêu cầu chuẩn bị mẫu tốn nhiều thời gian với việc thực hiện giai đoạn dẫn xuất mẫu, độ thu hồi của phương pháp giảm.

Việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS khắc phục được những khuyết điểm đó và mang lại những ưu điểm là tăng độ nhạy, độ chọn lọc và độ phân giải. Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép để xác định THC-COOH [1, 6]. Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này chúng tôi tập trung “Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11-nor-9- cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol trong máu bằng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép LC-MS/MS” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.

Cần sa, các chế phẩm của cần sa và tác hại của chúng 1. Giới thiệu về cần sa Cây cần sa (canabis sativa) có nguồn gốc từ Ấn Độ và Ba Tư, sau đó được trồng phổ biến ở các nước ôn đới và nhiệt đới từ hàng trăm năm nay nhằm mục đích lấy sợi hoặc sử dụng trong các lễ hội mang tính tâm linh. Tính tới nay, các chế phẩm/sản phẩm cần sa là loại ma túy bị lạm dụng nhiếu nhất trên thị trường ma túy lậu. Việc trồng cây cần sa hầu như diễn ra khắp mọi nơi, và hầu như ở tất cả các nước trên thế giới.

Nhựa cần sa được sản xuất tại khoảng 65 nước trên thế giới, chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi và Tây-Nam Á, đặc biệt là Afghanistan và Pakistan. Châu Phi là quê hương của nước sản xuất nhựa cần sa hàng đầu thế giới là Ma-rốc, nổi tiếng về trồng cần sa. Hầu hết nhựa cần sa bắt được ở Châu Âu đều có nguồn gốc buôn lậu từ Ma-rốc. Nhựa cần sa từ Ma-rốc có đặc điểm đặc trưng giống với đặc điểm của nhựa cần sa từ các nước khác thí dụ như các nước thuộc vùng đông và nam Địa Trung Hải.

Afghanistan là nước lớn thứ hai thế giới về sản xuất nhựa cần sa. Nhựa cần sa từ Afghanistan có đặc điểm giống với nhựa từ các vùng khác của tiểu lục địa Ấn Độ. Li-Băng đã từng có thời là một trong những nước cung cấp nhựa cần sa hàng đầu thế giới, và nếu như không có những nỗ lực triệt phá liên tục của cơ quan chức năng và chính quyền địa phương, có thể nó vẫn đứng đầu thế giới về cung cấp nhựa cần sa. Về cây cần sa, Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006, sau đến Châu Phi (khoảng 22%).

Hầu hết cây cần sa đều được sản xuất cho các thị trường nội địa và xuất khẩu sang nước láng giềng, còn ít bị buôn lậu trên thế giới [2]. Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng lên hệ thần kinh chủ yếu ở lá, quả và hoa (đặc biệt là phần ngọn cây). Các bộ phận này được thu hoạch riêng, phơi khô, ép thành bánh hoặc bó lại để sử dụng bằng cách hút, đôi khi dùng qua đường uống. Các sản phẩm thực vật này có tên chung là marijuana, chúng có thể khác nhau về hình thức trình bày cũng như thành phần, hàm lượng hoạt chất.

Hàm lượng hoạt chất giảm khi hạt hình thành, bởi vậy ở một số nơi 4 người ta tỉa bỏ những cây đực để ngăn cản quá trình thụ phấn tạo hạt, các sản phẩm thu được có tên là Sinsemila [2]. Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà, có thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn chiếu sáng nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và khó khăn trong công tác điều tra phòng chống tội phạm. Cây cần sa được trồng ngày càng nhiều trong nhà tại các nước phát triển về mặt kỹ thuật. Từ những năm 1970, các nước trồng cần sa ở Bắc Mỹ và Châu Âu đã nghiên cứu để tạo ra các giống cần sa có hàm lượng hoạt chất cao hơn, và thị trường về cần sa có hàm lượng THC cao, trồng trong nhà sử dụng kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn đang ngày một phát triển tại nhiều nước tiêu thụ cần sa chính.

Vào cuối thế kỷ trước, kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn được áp dụng rất nhiều tại Mỹ, Canada và Hà Lan – ba nước đi tiên phong về công nghệ nhân giống và trồng cây cần sa – báo hiệu rằng thị phần của cần sa đang ngày một gia tăng ở nhiều nước. Cần sa trồng trong nhà Cần sa được nhiều người cho là “ma túy cửa ngõ”, dẫn đến việc sử dụng lạm dụng bất hợp pháp và được sử dụng ở rất nhiều nơi. Trong những năm qua, việc sử dụng cần sa đã tăng lên đều đặn, cả về mặt y tế và mặt giải trí, 5 đặc biệt là ở thanh thiếu niên và sử dụng phổ biến hơn ở nam giới hơn phụ nữ. Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để hút nhằm tạo cảm giác hưng phấn.

Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá thành rất đắt so với thuốc lá. Cần sa còn có thể được hút bằng ống nước (bong), một thiết bị điện tử cầm tay (vape pen), có thể được kết hợp vào trà và ấu ăn. Hình ảnh về cây cần sa và cần sa thường dùng trong thực tế 1. Các chế phẩm từ cần sa Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu.

Các sản phẩm hợp pháp cần sa gồm có hạt cần sa, dầu từ hạt cần sa và tinh dầu cần sa. Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và cách chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích buôn lậu và sử dụng bất hợp pháp, các chế phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là: Cây cần sa, nhựa cần sa và dầu cần sa do hàm lượng THC cao. Nhựa cần sa là sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng THC đạt 2-10%. Trên thế giới, việc sản xuất nhựa cần sa được tập trung vào hai khu vực chính là khu vực đông và nam Địa Trung Hải, khu vực Nam và Tây Nam Á.

Hai khu vực này sử dụng rất nhiều phương pháp để sản xuất nhựa cần sa. Tuy nhiên, nói chung là mỗi khu vực đều sử dụng những kỹ thuật giống nhau. Sàng và rây là một khâu quan trọng của quá trình sản xuất nhựa cần sa trong cả hai khu vực nay [2]. Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với dụng cụ chiết tương tự như chiết soxhlet.

Các dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, clorofom, hexanee, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30%. Tác hại của việc sử dụng cần sa Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người sử dụng, thường tạo ra những khoái cảm, hưng phấn, nói nhiều. Nếu như người nghiện heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người nghiện cần sa có thể trở nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn. Khi sử dụng cần sa, các cơ quan cảm giác như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác bị kích thích mạnh dẫn đến ảo giác, trí nhớ lẫn lộn, không phân biệt được quá khứ, hiện tại.

Người nghiện có thể quên đi mọi lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình trôi nổi, bồng bềnh, không quan tâm đến việc gì, không có mục đích rõ ràng. Từ đó dẫn đến những trang thái bất thường về hành vi, không làm chủ được các hoạt động của bản thân. Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn thần kinh, tình dục, giảm khả năng sinh sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn nhiễm sắc thể. Cần sa có thể gây ra bất tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ