Luận văn: Xác định Acid Sialic trong TPBVSK bằng LC-MS/MS - Nguyễn Thị Hồng Ngọc

Luận văn thạc sĩ Dược học trình bày quy trình xác định hàm lượng acid sialic trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hồng Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thị Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất
• Đề tài: Xác định hàm lượng một số Acid Sialic trong Thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng kỹ thuật Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Dược học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan về Acid Sialic và Ứng Dụng trong TPBVSK

Acid sialic là một nhóm các acid amino đường quan trọng có vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh học của cơ thể. Trong đó, N-acetylneuraminic acid (NANA) và N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) là hai loại acid sialic chính thường được tìm thấy trong các thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) như sữa non, sản phẩm dinh dưỡng và các chế phẩm bổ sung. Các acid sialic này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển thần kinh, tăng cường miễn dịch, và hỗ trợ các chức năng sinh học khác. Việc xác định chính xác hàm lượng acid sialic trong TPBVSK là một yêu cầu quan trọng để đảm bảo chất lượng, an toàn và hiệu quả của các sản phẩm này trên thị trường. Do đó, phương pháp phân tích có độ chính xác cao và khả năng phân biệt các loại acid sialic khác nhau là cần thiết.

1.1. Cấu Trúc và Chức Năng của Acid Sialic

Acid sialic là dẫn xuất của axit sialic với cấu trúc chứa 9 cân carbon, gồm một phần đường (mannosamine) và một phần acid carboxylic. Chức năng chính của acid sialic bao gồm tham gia vào quá trình nhận diện tế bào, điều hòa miễn dịch, và hỗ trợ phát triển não bộ ở trẻ em. Trong các TPBVSK, acid sialic giúp tăng cường sự hấp thu dưỡng chất và cải thiện sức khỏe tổng thể.

1.2. Sự Khác Biệt giữa NANA và NGNA

NANA (N-acetylneuraminic acid) và NGNA (N-glycolyl-D-neuraminic acid) là hai dạng chính của acid sialic được tìm thấy trong tự nhiên. NANA phổ biến hơn trong sản phẩm sữa và các loại thực phẩm động vật, trong khi NGNA cũng xuất hiện nhưng với hàm lượng thấp hơn. Sự khác biệt này ảnh hưởng đến tính chất sinh học và độ hiệu quả của các sản phẩm dinh dưỡng.

II. Phương Pháp LC MS MS trong Phân Tích Acid Sialic

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao, được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng acid sialic trong các mẫu phức tạp. Phương pháp này kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector khối phổ ba tứ cực, cho phép phân tách, xác định và định lượng các thành phần acid sialic một cách chính xác. LC-MS/MS có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống như TLC hay HPLC-FLD, bao gồm khả năng phân biệt các chất đồng phân, độ chọn lọc cao, và khả năng phát hiện các hợp chất ở nồng độ rất thấp. Nguyên tắc hoạt động dựa trên việc phân tách các thành phần trong mẫu thông qua cột sắc ký, sau đó phát hiện qua khối phổ với độ nhạy cao. Phương pháp này đặc biệt thích hợp cho phân tích TPBVSK vì nó cho phép định lượng đồng thời nhiều loại acid sialic trong một lần chạy mẫu.

2.1. Nguyên Tắc Hoạt Động của LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động bằng cách chia phân tích thành ba bước chính: tách phương phap sắc ký lỏng, phun điện tử (ESI) để ion hóa mẫu, và phát hiện qua khối phổ ba tứ cực. Detector theo dõi các ion mẹ và ion con đặc trưng, tạo ra một đặc tuyến chromatogram cải tiến về độ chọn lọc so với các phương pháp khác.

2.2. Ưu Điểm của LC MS MS trong Xác Định Acid Sialic

Phương pháp LC-MS/MS cung cấp độ nhạy cực cao, cho phép phát hiện acid sialic ở nồng độ rất thấp. Nó cũng có khả năng phân biệt chính xác giữa các loại acid sialic khác nhau (NANA, NGNA), không bị ảnh hưởng bởi các chất cạnh tranh trong mẫu phức tạp, và có tính lặp lại cao.

III. Quy Trình Xử Lý Mẫu và Thẩm Định Phương Pháp

Quy trình xử lý mẫu là bước cực kỳ quan trọng để đạt được kết quả phân tích chính xác. Đối với phân tích acid sialic trong TPBVSK bằng LC-MS/MS, mẫu cần trải qua quá trình thủy phân để giải phóng acid sialic từ các dạng liên kết phức tạp. Điều kiện thủy phân bao gồm nhiệt độ, thời gian, và nồng độ chất thủy phân (thường là acid formic hoặc axit HCl) là những yếu tố quyết định. Sau khi thủy phân, mẫu cần được làm sạch và chuẩn bị cho phân tích LC-MS/MS. Thẩm định phương pháp là bước tiếp theo, bao gồm kiểm tra tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, và độ chính xác. Các yêu cầu này đảm bảo rằng phương pháp đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và có thể được sử dụng để kiểm nghiệm các TPBVSK trên thị trường.

3.1. Các Điều Kiện Xử Lý Mẫu Tối Ưu

Quy trình xử lý mẫu tối ưu bao gồm lựa chọn nồng độ acid formic phù hợp (thường từ 0,1% đến 1%), nhiệt độ thủy phân từ 60-80°C, và thời gian thủy phân từ 1-2 giờ tùy thuộc vào bản chất mẫu. Các tham số này được khảo sát chi tiết để đảm bảo hiệu suất thủy phân cao nhất mà không gây phân hủy acid sialic.

3.2. Các Tiêu Chí Thẩm Định Phương Pháp

Thẩm định LC-MS/MS yêu cầu xác minh tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính (thường từ 0,5-100 μg/mL), LOD ≤ 0,2 μg/mL, LOQ ≤ 0,5 μg/mL, độ lặp lại RSD < 15%, và độ chính xác từ 85-115%. Những yêu cầu này đảm bảo phương pháp đáng tin cậy và có thể ứng dụng thực tế.

IV. Ứng Dụng Phân Tích và Kết Quả Thực Tế

Phương pháp LC-MS/MS đã được áp dụng thành công để xác định hàm lượng acid sialic trong nhiều loại TPBVSK khác nhau như sữa non, sản phẩm dinh dưỡng cho trẻ em, và các chế phẩm bổ sung khác. Các mẫu được phân tích bao gồm các sản phẩm có chứa các thành phần tự nhiên và các sản phẩm được bổ sung thêm acid sialic. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng NANA thường cao hơn NGNA trong hầu hết các mẫu, điều này phù hợp với những ghi nhận trước đó về thành phần acid sialic trong các sản phẩm sữa. Phương pháp này không chỉ cung cấp các thông tin về hàm lượng acid sialic mà còn giúp xác minh công bố trên nhãn sản phẩm, đảm bảo an toàn và hiệu quả của các TPBVSK đối với người tiêu dùng. Ứng dụng LC-MS/MS trong kiểm nghiệm TPBVSK đã nâng cao chất lượng kiểm soát chất lượng và đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế.

4.1. Các Loại TPBVSK Được Phân Tích

Phương pháp được áp dụng cho nhiều loại TPBVSK bao gồm sữa non, sữa bột, sản phẩm dinh dưỡng tổng hợp, và các chế phẩm bổ sung. Mỗi loại sản phẩm có đặc điểm riêng, từ đó phương pháp phải được điều chỉnh phù hợp để đạt được kết quả tốt nhất.

4.2. Ý Nghĩa Thực Tiễn của Phân Tích Acid Sialic

Xác định hàm lượng acid sialic giúp đánh giá chất lượng dinh dưỡng của TPBVSK, xác minh thông tin trên nhãn sản phẩm, và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Kết quả phân tích cũng cung cấp dữ liệu khoa học để hỗ trợ quản lý chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất có tác dụng hỗ trợ. Khái niệm TPBVSK được người Nhật sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng. Chính vì ưu điểm như vậy, TPBVSK hiện đang được quảng cáo một cách rầm rộ trên các phương tiện thông tin đại chúng với những công dụng hứa hẹn mạng lại sự cải thiện về sức khỏe. Tuy nhiên, trong quảng cáo, các nhà sản xuất chỉ đưa ra các công dụng, nhưng hầu như không đề cập đến chất lượng tương ứng của sản phẩm.

TPBVSK hiện nay được sản xuất và sử dụng rộng rãi trên thị trường, chủ yếu định hướng đến nhóm đối tượng đang trong chế độ dinh dưỡng đặc biệt với nhiều hoạt chất được bổ sung để tăng cường tác dụng hỗ trợ. Một trong những nhóm chất được bổ sung trong TPBVSK là acid sialic. Acid sialic là nhóm khoảng 60 các monosaccaride có khung cơ bản là acid neuraminic acid - một đường acid có 9 carbon. Trong tự nhiên, nhóm này thường được tìm thấy nhiều ở động vật có xương sống, một vài loài không xương sống và một số loài vi sinh vật (bao gồm cả virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh), gần như không phát hiện ở giới thực vật và sinh vật nhân sơ.

Acid sialic được biết đến như một nhóm đường liên kết tại các vị trí đầu và cuối của các oligosaccharide trên bề mặt của tế bào (gangliosides, glycolipid, glycoprotein) và các glycan liên hợp [29], [23], [6]. Với chức năng gắn kết các glycan, acid sialic từ lâu đã được công nhận một số vai trò quan trọng trong sinh học như ngăn ngừa sự phân rã protein, duy trì và nâng cao độ nhận biết, nhân lên, miễn dịch giữa các tế bào, đặc biệt là các tế bào thần kinh. Vì những lợi ích mang lại, acid sialic đang trở nên được công nhận là thành phần quan trọng của một số loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe, chủ yếu tập trung vào đối tượng trẻ sơ sinh, thanh thiếu niên trong độ tuổi phát triển và những người đang trong chế độ dinh dưỡng đặc biệt. 1 Các nhà khoa học phân chia Acid sialic thành 2 nhóm chính là 5-acetamido-2- keto-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactonononic acid (N-acetylneuraminic acid, NANA) và 2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galactonononic acid (2-keto-3-deoxynononic acid, KDN).

Sự khác nhau cơ bản giữa nhóm này là nhóm thế ở vị trí C-5. Gần như các acid sialic còn lại là dẫn xuất của 2 acid sialic này. Nhóm NANA phân bố phổ biến hơn KDN trong hầu hết các loại tế bào ở động vật có xương sống. Trong phân nhóm của NANA, hiện nay có 2 acid sialic được quan tâm nhiều nhất là NANA và dẫn xuất hydroxyl của NANA là N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) Các nhà sản xuất đã và đang quảng cáo và ghi nhãn chính thức acid sialic trên các sản phẩm của họ.

Đồng thời các nhà khoa học trên thế giới đã phát triển nhiều phương pháp khác nhau để định danh và định lượng các acid sialic trong những nền mẫu khác nhau. Các phương pháp được sử dụng đa dạng có thể đề cập đến như: UV- VIS, HPLC-FLD, HPEAC-PAD, LC-MS/MS,… Tuy nhiên, trên thế giới cũng như tại Việt Nam hiện chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng các acid sialic nói chung và trong nền mẫu TPBVSK nói riêng. Từ tiềm năng phát triển của thị trường, những lợi ích - nguy cơ mà nhóm acid sialic có thể mang đến, đồng thời góp phần kiểm soát chất lượng của các sản phẩm có chứa acid sialic trên thị trường, nâng cao hiệu quả cho người sử dụng, đề tài: “Xác định hàm lượng một số acid sialic trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)”, đã được lựa chọn với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng N-Acetyl-D-neuraminic acid (NANA) và N-glycolyl-D-neuraminic acid (NGNA) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng NANA và NGNA trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe (sữa bột, sữa lỏng và nước yến) trên thị trường.1 Tổng quan về acid sialic Acid sialic là một nhóm gồm khoảng 60 hoạt chất có bản chất đường, là dẫn xuất của neuraminic acid. Các dẫn xuất đã được biết đến như dẫn xuất phosphate hóa, dẫn xuất sulfate hóa hoặc bổ sung thêm nhiều nhóm thế lactyl và acetyl. Acid sialic hiện diện tại cơ và dịch thể của tất cả các động vật có xương sống (bao gồm dịch não tủy, nước bọt, dịch vị, huyết thanh, nước mắt, nước tiểu và sữa), trứng cá và thậm chí trên màng cầu khuẩn gây viêm màng não. Mật độ acid sialic cao nhất được tìm thấy ở hệ thần kinh trung ương, chủ yếu là màng tế bào thần kinh, ước tính cao hơn 20 lần so với mật độ ở màng tế bào thường.

Các acid sialic thường được bổ sung vào TPBVSK sử dụng cho đối tượng trẻ sơ sinh, thanh thiếu niên trong độ tuổi phát triển và những người đang trong chế độ dinh dưỡng đặc biệt. Nguồn gốc - Chức năng Acid sialic được phát hiện ngẫu nhiên vào những năm 30 của thế kỷ XX bởi nhà hóa sinh học người Thụy Điển Gunnar Blix, khi ông đang nghiên cứu về các mucin và hexosamine trong nước bọt bò. Khi làm sạch, cô đặc và soi mẫu dưới kính hiển vi, ông nhận thấy có rất nhiều các phần tử hình sao nhọn. Blix đã nhận ra một điểm chú ý trong nghiên cứu của mình: các phân tử hình sao nhọn tập trung chủ yếu ở vị trí gắn liên kết đầu mạch hoặc cuối mạch của các chuỗi oligosaccaride.

Qua một số nghiên cứu tiếp theo, đi sâu vào phân tích cấu trúc và tính chất hóa học cơ bản, năm 1952, Blix đã đặt tên cho nhóm phân tử này là “Acid sialic” - dựa trên mẫu đầu tiên mà ông tìm thấy chúng. Trong tiếng Latin, tuyến nước bọt được gọi là Sialon /σίαλον / [28], [28]. Phát hiện của Blix đã mở ra nhiều nghiên cứu sau này về Acid sialic trong tự nhiên. Vào những năm 80, nhà hóa sinh học người Đức Roland Schauer đã thực hiện dự án lớn, bao gồm nhiều nghiên cứu phân lập và phân tích cấu trúc Acid sialic từ các loài động vật khác nhau trong tự nhiên.

Dự án này của ông đã thu được kết quả khả quan: phân lập và định danh khoảng 30 acid sialic. Đến những năm 2000, con số này 3 là 40. Hiện tại, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, con số này đã lên đến hơn 60 [36]. Do tồn tại chủ yếu trên bề mặt ở tất cả các tế bào, các acid sialic có vai trò trung gian trong nhiều quá trình sinh lý cũng như bệnh lý của cơ thể.

Đầu tiên, do có điện tích âm, kích thước phân tử cồng kềnh và thân nước nên acid sialic có liên quan đến sự liên kết và vận chuyển các phân tử tích điện dương cũng như trong tương tác (hút và đẩy) của các tế bào và phân tử. Thứ hai, các acid sialic là một trong nhiều thành phần cấu tạo nên glycoprotein, ảnh hưởng đến độ nhớt trên bề mặt niêm mạc và bảo vệ tế bào nội mô. Acid sialic được tìm thấy nhiều trong các chất dẻo thần kinh, màng lọc cầu thận và tham gia ngăn chặn sự tương tác không mong muốn của các tế bào trong lưu thông máu. Mật độ của các acid sialic trong màng bào cầu thận ảnh hưởng việc duy trì chức năng lọc bình thường của các cơ quan, và mở rộng các chuỗi polyacid sialic có thể ảnh hưởng đến chất dẫn truyền thần kinh.

Lớp màng tế bào tế mặt nội mô mạch máu cũng chứa mật độ cao các acid sialic. Ở mức độ sinh lý tế bào, acid sialic có thể điều chỉnh chu kỳ bán rã của một số protein trong lưu thông, đặc biệt là trong các điều kiện bệnh lý như nhiễm trùng. Thứ ba, các acid sialic N- và O-acylated đã được tìm thấy là yếu tố quyết định kháng nguyên của các động vật có vú và vi sinh vật khác nhau. Acid sialic cũng được xem như một yếu đố đặc trưng góp phần vào việc xác định kháng nguyên H trong phân loại nhóm máu.

Khả năng tích lũy acid sialic có thể được coi là yếu tố quyết định trong việc xác định mức độ biệt hóa của các kháng nguyên. Thứ tư, các acid sialic đóng vai trò như thụ thể liên kết với các tác nhân gây bệnh và độc tố trong cơ thể (virus cúm, virus SV40, các loài Mycoplasma), việc các tế bào bị nhiễm bởi các vi sinh vật này phụ thuộc hoàn toàn vào sự hiện diện của acid sialic trên màng tế bào. Gần đây đã có một số nghiên cứu ban đầu về tác dụng ngăn chặn các thụ thể nhận biết bởi các phối tử tương ứng của acid sialic nhờ khả năng cạnh tranh vị trí gắn [37] và nhận biết các vị trí gắn kháng nguyên (chuỗi polypeptide hoặc carbohydrate) của các thành phần của hệ thống miễn dịch, góp phần đưa các yếu tố 4 ngoại lai đến với đại thực bào. Đây là một trong những công dụng quan trọng nhất của các acid sialic mà đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều Trên hệ thần kinh, acid sialic được xác định có nồng độ rất cao trong chất xám [42].

Người ta cũng xác định rằng acid sialic đóng vai trò trung tâm trong chức năng và sự phát triển của não. Tính đến thời điểm 2015, vẫn chưa có nghiên cứu lâm sàng ở người được thực hiện để điều tra tác dụng của acid sialic trên hệ thần kinh, nhưng lại có các bằng chứng khác liên quan đến việc bổ sung acid sialic qua chế độ dinh dưỡng: (1) bằng chứng gián tiếp liên quan đến hiệu suất nhận thức, (2) nghiên cứu trên động vật điều tra khả năng nhận thức khi bổ sung acid sialic và (3) nghiên cứu sinh học điều tra sự tích tụ acid sialic tại não khi sử dụng bổ sung qua chế độ ăn [45]. Mọi cơ thể động vật sống đều có thể sản sinh acid sialic, nhưng không có nghĩa là lượng sialic sinh ra đủ để đáp ứng những nhu cầu tất yếu của cơ thể. Lượng tiêu thụ acid sialic nhiều hay ít phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đối tượng đặc biệt (trẻ em, phụ nữ mang thai và cho con bú, người già) và trạng thái bệnh lý.

Do vậy, sử dụng bổ sung acid sialic thông qua chế độ dinh dưỡng có thể góp phần duy trì lượng acid sialic ổn định cho các chức năng nội sinh quan trọng hoạt động bình thường [29], [23], [6], [45], [41].