Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l có khả năng đối kháng nấm phomopsis sp um254 gây bệnh thối quả xoài khóa luận tốt nghiệp

Nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây trinh nữ hoàng cung có khả năng kháng nấm Phomopsis sp gây thối quả xoài.

• Tác giả: Trần Thị Hồng Điệp
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thanh Huyền
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) có khả năng đối kháng nấm Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối quả xoài
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về xạ khuẩn
• 1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh. Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh thực vật. Cách thức xâm nhập của xạ khuẩn nội sinh
• 1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn nội sinh
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới
• 1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam
• 1.1.5. Giới thiệu về cây Trinh nữ hoàng cung
• 1.1.5.1. Cây Trinh nữ hoàng cung
• 1.1.5.2. Vai trò của cây Trinh nữ hoàng cung
• 1.1.6. Tổng quan về nấm Phomopsis sp.
• 1.1.6.1. Giới thiệu chung về nấm Phomopsis sp.
• 1.1.6.2. Triệu chứng bệnh
• 1.1.6.3. Một số bệnh phổ biến do Phomopsis sp. gây ra ở các cây trồng Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất thí nghiệm
• 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
• 2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu
• 2.2.3. Phương pháp phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh
• 2.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh
• 2.2.5. Đánh giá đặc điểm hình thái của xạ khuẩn đối kháng
• 2.2.6. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn đối kháng
• 2.2.7. Định danh chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm năng dựa trên giải trình tự gen 16S rRNA
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung
• 3.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn nội sinh với nấm Phomopsis sp.
• 3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
• 3.3.1. Đặc điểm hình thái
• 3.3.2. Đặc điểm sinh hóa của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn
• 3.3.3. Khả năng sinh trưởng trên các điều kiện nuôi cấy khác nhau
• 3.3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng (IAA) của các chủng xạ khuẩn nội sinh
• 3.3.5. Khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm Anthracycline của HN04 và HN05
• 3.3.6. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 3.3.7. Định danh chủng xạ khuẩn HN05 dựa trên giải trình tự gen 16S rRNA
• 3.3.8. Tách chiết và xác định nồng độ DNA tổng số
• 3.3.9. Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA
• 3.3.10. Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và nghiên cứu các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) nhằm tìm kiếm khả năng đối kháng với nấm Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối quả xoài. Xạ khuẩn nội sinh là nhóm vi sinh vật sống trong mô thực vật, có khả năng sản xuất các hợp chất kháng nấm và kích thích sinh trưởng. Nghiên cứu này nhằm mục đích khai thác tiềm năng của các chủng xạ khuẩn này trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng, đặc biệt là bệnh thối quả xoài.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung và đánh giá khả năng đối kháng với nấm Phomopsis sp. UM254. Ngoài ra, nghiên cứu cũng tập trung vào việc xác định các đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn này, bao gồm khả năng sinh trưởng, sản xuất enzyme ngoại bào, và chất kích thích sinh trưởng như IAA.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các biện pháp sinh học thay thế cho các hóa chất bảo vệ thực vật. Việc sử dụng xạ khuẩn nội sinh không chỉ giúp kiểm soát bệnh hại mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mẫu rễ, thân, lá của cây Trinh nữ hoàng cung. Các chủng xạ khuẩn được đánh giá khả năng đối kháng với nấm Phomopsis sp. UM254 thông qua phương pháp đồng nuôi cấy. Các đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn được nghiên cứu bao gồm hình thái khuẩn lạc, khả năng sử dụng nguồn carbon và nitơ, khả năng sinh enzyme ngoại bào, và chất kích thích sinh trưởng IAA.

2.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh

Các mẫu rễ, thân, lá của cây Trinh nữ hoàng cung được thu thập và xử lý bề mặt để loại bỏ vi sinh vật ngoại sinh. Sau đó, các mẫu được nghiền nhỏ và nuôi cấy trên môi trường Gause I để phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh.

2.2. Đánh giá khả năng đối kháng

Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn được đánh giá thông qua phương pháp đồng nuôi cấy với nấm Phomopsis sp. UM254. Các chủng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm được tuyển chọn để nghiên cứu sâu hơn.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã phân lập được sáu chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung, trong đó hai chủng HN04 và HN05 thể hiện khả năng đối kháng mạnh mẽ với nấm Phomopsis sp. UM254. Các chủng này được nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học, bao gồm hình thái khuẩn lạc, khả năng sử dụng nguồn carbon và nitơ, khả năng sinh enzyme ngoại bào, và chất kích thích sinh trưởng IAA. Chủng HN05 được định danh dựa trên trình tự gen 16S rRNA và xác định thuộc chi Streptomyces.

3.1. Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Các chủng HN04 và HN05 có hình thái khuẩn lạc đặc trưng với hệ sợi phát triển mạnh và khả năng sinh bào tử. Các chủng này cũng thể hiện khả năng sử dụng đa dạng nguồn carbon và nitơ, đồng thời có khả năng sinh enzyme ngoại bào và chất kích thích sinh trưởng IAA.

3.2. Định danh chủng xạ khuẩn

Chủng HN05 được định danh dựa trên trình tự gen 16S rRNA và xác định thuộc chi Streptomyces, có họ hàng gần với loài Streptomyces ardesiacus. Kết quả này khẳng định tiềm năng của chủng xạ khuẩn này trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và nghiên cứu các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung có khả năng đối kháng với nấm Phomopsis sp. UM254. Các chủng HN04 và HN05 thể hiện tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh thối quả xoài. Nghiên cứu cũng đề xuất hướng phát triển các chế phẩm sinh học từ các chủng xạ khuẩn này để ứng dụng trong nông nghiệp.

4.1. Kết luận

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung trong việc kiểm soát bệnh thối quả xoài. Các chủng HN04 và HN05 có khả năng đối kháng mạnh mẽ với nấm Phomopsis sp. UM254 và có nhiều đặc điểm sinh học có lợi.

4.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đối kháng của các chủng xạ khuẩn này và phát triển các chế phẩm sinh học để ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp với diện tích đất nông nghiệp chiếm khoảng 80,4% tổng diện tích đất của Việt Nam (Hoàng Xuân Lâm, 2020) với các loại cây trồng đa dạng như cây lương thực, cây ăn quả, cây công nghiệp và các loại cây khác… Bệnh hại cây trồng là một vấn đề nan giải của người nông dân bởi nó ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng của sản phẩm nông nghiệp. Bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 80% bệnh hại ở cây trồng với các dạng triệu chứng cơ bản là thối rữa, hoại tử và héo rũ. Một số loại nấm gây bệnh còn có thể sản sinh ra nhiều loại độc tố có hại cho người và động vật, dẫn đến các vấn đề về an toàn thực phẩm (Zain, 2011). Trong số đó, nấm Phomopsis sp.

Là một loại nấm có tiềm năng gây bệnh trên rất nhiều đối tượng thực vật đặc biệt là trên quả xoài ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả sau thu hoạch. Để phòng trừ các loại nấm bệnh thì việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa chất để diệt nấm bệnh ngày càng phổ biến. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các sản phẩm hóa chất sẽ gây hại không chỉ cho cây trồng mà còn làm ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây hại cho các loài thiên địch và sức khỏe con người. Do đó, việc ứng dụng các tác nhân kiểm soát sinh học ức chế nấm bệnh là một hướng giải quyết tiềm năng.

Tác nhân kiểm soát sinh học là vi sinh vật ngăn chặn mầm bệnh thực vật (Pal & Gardener, 2006), có hiệu quả cao trong việc kiểm soát mầm bệnh và an toàn với môi trường hơn so với sử dụng biện pháp hóa học. Một trong những vi sinh vật tiềm năng được quan tâm đến nhiều đó là xạ khuẩn. Trong những năm gần đây, xạ khuẩn được đặc biệt quan tâm bởi khả năng sinh tổng hợp được nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Cây dược liệu ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng, các bài thuốc cổ truyền từ xa xưa để lại đã cho thấy tầm quan trọng của cây dược liệu trong điều trị bệnh.

Trong đó, Trinh nữ hoàng cung là loại cây dược liệu có nhiều công dụng như ức chế phát triển của khối u, kháng nấm, kháng viêm,…Có những 1 giả thuyết về các chất trong cây dược liệu với những hoạt tính sinh học bắt nguồn từ vi sinh vật nội sinh. Ngoài ra còn có các giả thuyết cho rằng có sự trao đổi gene giữa thực vật và các vi sinh vật nội sinh thực vật, trong đó có những gene liên quan đến việc tổng hợp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Như vậy, một kho tàng các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật nội sinh nói chung và Streptomyces nội sinh nói riêng đang chờ được khám phá và khai thác. Có khả năng lớn là các chủng vi sinh vật nội sinh trong cây Trinh nữ hoàng cung cũng có thể sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quý cùng lúc kháng nấm và kháng ung thư.

Không chỉ có tác dụng sản sinh các chất kháng nấm, các chủng xạ khuẩn nội sinh còn có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách sản xuất các chất kích thích sinh trưởng và bảo vệ cây khỏi sự tác động của một số tác nhân lạ. Với hiện trạng lạm dụng chất kích thích sinh trưởng hóa học như hiện nay đã gây ra rất nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, xạ khuẩn nội sinh đang là đối tượng tiềm năng trong tương lai để giải quyết vấn đề tăng trưởng thực vật. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) có khả năng đối kháng nấm Phomopsis sp.

UM254 gây bệnh thối quả xoài”. * Mục đích nghiên cứu - Phân lập được chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây có khả năng đối kháng nấm Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối trên xoài. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn đối kháng * Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh đối kháng nấm Phomopsis sp.

gây bệnh thối trên xoài; - Nghiên cứu khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ; 2 - Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào; - Nghiên cứu khả năng sinh trưởng trên các điều kiện môi trường; - Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA; - Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline; - Định danh chủng xạ khuẩn đối kháng bằng phương pháp sinh học phân tử. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về xạ khuẩn 1. Giới thiệu chung Xạ khuẩn (Tên khoa học: Actinobacteria, tên tiếng Anh: Actinomycetes) là vi khuẩn Gram dương thuộc bộ Actinomycetales trong lớp Actinobacteria, bao gồm các chi vi khuẩn dạng sợi như Amycolatopsis sp.

và các vi khuẩn đơn bào bao gồm Corynebacterium sp. và Mycobacterium sp. (Barka et al. Xạ khuẩn thường có tỷ lệ GC trong DNA cao hơn 55%.

Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử. Một số xạ khuẩn còn hình thành túi bào tử như Streptosporangium sp. và bào tử di động như Actinoplane sp.

(Nguyễn Lân Dũng & cs. Tên xạ khuẩn bắt nguồn tử tiếng Hy Lạp cổ đại ἀκτίς có nghĩa là hình tia phóng xạ (aktís hay actino) và μύκης có nghĩa là dạng sợi nấm (mukēs hay myces) (Nguyễn Lân Dũng & cs. Xạ khuẩn được coi như là dạng chuyển tiếp giữa nấm và vi khuẩn. Khi quan sát về hình thái bên ngoài có thể thấy, nhiều xạ khuẩn tạo ra hệ sợi giống như nấm và có khả năng sinh bào tử.

Tuy nhiên xạ khuẩn lại là sinh vật đơn bào và có thành phần peptidoglycan ở thành tế bào giống với vi khuẩn. Hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn (Quiñones-Aguilar et al., 2016) Hầu hết xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí và sống hoại sinh, phần lớn bào tử xạ khuẩn tồn tại dưới dạng bán định hình (semidormant spores), đặc biệt trong các điều kiện hạn chế về dinh dưỡng. Xạ khuẩn có khả năng thích nghi với nhiều loại môi trường sinh thái như: môi trường đất, nước ngọt, nước mặn, và không khí, …, tuy nhiên, xạ khuẩn được tìm thấy nhiều nhất ở trong đất, đặc biệt là đất kiềm và đất giàu chất hữu cơ. Xạ khuẩn có thể được tìm thấy trên mặt đất và ở độ sâu cách mặt đất hơn 2m, tùy thuộc vào môi trường sống và các điều kiện khí hậu mà 1g đất có thể có từ 106 đến 109 tế bào.

Các nghiên cứu cho thấy, phần lớn xạ khuẩn thuộc chi Streptomycetes (chiếm hơn 95% các chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất) (Barka et al. Sơ đồ biểu diễn vòng đời của xạ khuẩn (Barka et al., 2015) 5 Xạ khuẩn là loài ưa nhiệt, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25 đến 30oC. Xạ khuẩn thường phát triển ở độ ẩm thấp, pH trung tính. Cụ thể là, ở pH từ 6 đến 9 các chủng xạ khuẩn phát triển mạnh nhất.

Bên cạnh đó, cũng có nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ cao (50 – 60oC) hay đất chua có độ pH 3.5 (Barka et al. Như vậy, có thể thấy rằng, xạ khuẩn là sinh vật có môi trường sống rất đa dạng và phong phú. Phân loại xạ khuẩn Có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển để phân loại các xạ khuẩn như khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Krassilnhilov (Nga), khóa phân loại của Gause, … Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) thành lớp phụ (hoặc bộ) Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn (like Organisms). Lớp phụ Actinomycetales được chia thành các họ: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae, Streptomycetaceae, Micromonosporaceae,… Khóa phân loại Streptomyces thuộc Hệ thống phân loại xạ khuẩn quốc tế (International Streptomyces Project) do Shirling và Gottlieb đề xuất (1970) đã được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae.

Trong khóa phân loại này, các chủng xạ khuẩn được phân loại dựa trên một số đặc điểm sau: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử (chụp ảnh kính hiển vi điện tử), khả năng tiêu thụ đường arabinose, xylose, inositol, mannitol, fructose, rhamnose, saccarose, raffinose,…. Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật phân tử để phân loại xạ khuẩn đã và đang được áp dụng rộng rãi. Hiện tại, một loài mới không thể được khẳng định nếu không có phân tích di truyền dựa trên giải trình tự gen 16S rRNA và lai DNA-DNA, thậm chí việc giải trình tự gen là bắt buộc khi muốn định danh bất kỳ chủng vi sinh vật nào. Mỗi loài đều có trinh tự bảo thủ riêng.

Ví dụ, trình tự 16S rRNA còn được dùng để phân biệt vi khuẩn thực (bacteria) và vi khuẩn cổ (archae) hoặc để nhận dạng loài vi khuẩn chưa biết. Các tiêu 6 chí về phân tích di truyền, đặc điểm hình thái và thành phần hóa học đều được sử dụng để phân loại. Hơn nữa, việc giải trình tự các gen 16S rRNA đã định danh được 39 họ và 130 chi xạ khuẩn. Tất cả các nhóm trước đây có thứ hạng phân loại được cho là “bộ” đã được phân loại là các ngành dựa trên các tiêu chí về sinh học phân tử và hóa học này.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc: Hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đa dạng. Kích thước và hình dạng của chúng thay đổi tùy thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất…). Trên môi trường rắn, xạ khuẩn hình thành khuẩn lạc khô. Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường khô, rắn chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu.

Khuẩn lạc có màu sắc khác nhau: trắng, xám, nâu, hồng, vàng, da cam, tím, … Đường kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5- 2mm, có một số trường hợp, khuẩn lạc có thể đạt tới 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Li et al.