Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, hiện tượng sa mạc hóa và cháy rừng ngày càng tăng rõ rệt. Một trong những nguyên nhân cháy rừng đó là do biến đổi khí hậu như rét đậm, rét hại làm gia tăng nhanh cành khô, lá rụng nằm trên mặt đất dưới tán rừng lớn, mặt khácdo khô hạn kéo dài dẫn đến gia tăng nhanh vật liệu cháy. Sử dụng vi sinh vật phân giải xenlulo có sẵn trong đất có khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giảm nguy cơ cháy rừng và tăng độ phì cho đất.Vi sinh vật phân giải xenlulo có nhiều loại khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, các loại nấm lớn và vi nấm. Trên trái đất đa phần các vi nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác.
Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và trong chu trình chuyển hóa, trao đổi vật chất. Nấm, vi nấm được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất, nhiều loài vi nấm phân hủy xenlulo mạnh như: Aspergilluschaetomium, Aspergillusfumigatus, Aspergillusflavus, Curvularia, Fusarium, Memoniella, Phomo, Thielavia và Trichoderma… chúng có tác dụng phân giải các chất hữu cơ dưới lớp thảm mục làm tăng các chất hữu cơ, mùn khoáng trong đất có tác động tích cực đến thảm thực vật rừng. Ngoài ra một số loài nấm có khả năng hạn chế một số loại bệnh trên cây trồng, kích thích sinh trưởng cho cây tiêu biểu Trichoderma reesei, Trichoderma viride. Nấm và vi khuẩn là những sinh vật phân hủy chính có vai trọng đối với hệ sinh thái cạn trên toàn thế giới.
Dựa theo tỉ lệ giữa số nấm và số loài thực vật ở trong cùng một môi trường người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài.000 đã được nhà khoa học phát hiện và n 2 miêu tả, tuy nhiên kích cỡ thực sự của tính đa dạng của giới nấm vẫn còn nhiều bí ẩn. Mỗi chất hữu cơ đều bị một nhóm vi sinh vật tương ứng phân huỷ một phần hay toàn bộ, các sản phẩm phân huỷ này lại được các loài khác phân huỷ tiếp, cứ như thế đến tận các chất vô cơ. Như vậy, vật chất luôn luôn được tuần hoàn bởi hai loại quá trình đối lập nhau: sự tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô cơ, và phân huỷ chất hữu cơ thành chất vô cơ. Các quá trình phân huỷ này chủ yếu do vi sinh vật thực hiện (nấm chiếm 50%) ở bất kỳ đâu có sự hiện diện của chúng: trong đất, trong nước, trong cơ thể các sinh vật khác.
Có rất nhiều loại vi nấm khác nhau, mức độ và khả năng phân hủy xenlulo cũng khác nhau, mỗi loại vi nấm đều có lợi ích và tác hại riêng của mình, vi nấm rất phong phú nên việc nghiên cứu các loại vi nấm này là rất quan trọng, việc tìm ra các vi nấm này sẽ giúp quá trình phân hủy xenlulo trong tự nhiên diễn ra nhanh hơn góp phần phân hủy các chất thảm mục, tạo chất dinh dưỡng cho cây rừng cũng như làm giảm thiểu một phần khả năng cháy rừng. Để nhận biết, phân lập và tuyển chọn được các loại vi nấm phân hủy xenlulo cao dưới tán rừng thông nhằm phục vụ công tác nghiên cứu phát triển những lợi ích của các loại vi nấm này tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc”. Trên cơ sở phân tích các mẫu, số liệu thu được tiến hành nhận biết và tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo dưới tán rừng Thông.
n 3 - Khảo sát một số đặc tính sinh học để phục vụ nuôi cấy vi nấm có hiệu lực cao tạo ra các chế phẩm sinh học phân hủy nhanh xenlulo dưới rừng thông 1. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Là cơ sở khoa học để tạo chế phẩm sinh học từ một số chủng vi nấm nhằm phân hủy nhanh xenlulo dưới tán rừng Thông. Ý nghĩa trong học tập, thực tiễn - Góp phần xây dựng cơ sở khoa học tạo ra các chế phẩm sinh học từ các chủng vi sinh vật phân hủy nhanh xenlulo làm giảm nguy cơ cháy rừng cho các diện tích rừng thông ở Đại Lải nói riêng và Việt Nam nói chung.
- Giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và tăng các kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường. - Giúp chúng ta hiểu thêm được tầm quan trọng của vi nấm nói riêng cũng như vi sinh vật nói chung. - Trang bị cho sinh viên những kiến thức thực tế, những kinh nghiệm và ý thức làm việc trước khi ra trường, là cơ sở để sinh viên thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.
Cơ sở khoa học Vi nấm phân giải xenlulo để sản xuất chế phẩm ứng dụng có hiệu quả cao đối với một số loại cây trồng trong lĩnh vực nông lâm nghiệp, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt, hiệu quả về mặt kinh tế và bảo vệ được môi trường sinh thái và tăng hàm lượng dinh dưỡng (N, P, K). Sử dụng chế phẩm sinh học phân hủy Xenlulo, giúp quá trình phân giải xenlulo diễn ra nhanh hơn. Do vậy đề tài thực hiệnrất cần thiết có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. Tổng quan về Emzym celluase Xenlulo là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-Dglucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật.
Vì vậy, xenlulo là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Xenlulo có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy. Xenlulo là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose.
Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình khả và cộng sự, 2007) [ 9] Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân xenlulo tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo nghiên cứu của một số tác giả, xenlulo bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β- (1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC–ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo và n 5 định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin.
Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tinh thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên.1 Phân loại cellulase Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân xenlulo thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tạo thành các phân tử đường β- glucose. Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.91) - 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.4) - -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus… Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.4) thủy phân liên kết ß- 1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc xenlulo theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin.
Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân n 6 giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên.
Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải xenlulo dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C 1, xenlulo bị thủy phân thành xenlulo hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, xenlulo hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C x tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Cơ chế tác dụng của xenlulo tới cellulose. n 7 Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy xenlulo trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Ứng dụng của emzym cellulose Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp. Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn.