Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh sâu răng là một trong những bệnh lý mạn tính phổ biến trên toàn cầu, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe răng miệng và thể chất chung của con người. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp bệnh sâu răng vào nhóm hiểm họa sức khỏe thứ ba của nhân loại, chỉ sau bệnh lý tim mạch và ung thư. Tại Hội nghị Sức khỏe Răng miệng Thế giới lần thứ 60 (tháng 5/2007), các quốc gia thành viên WHO đã thông qua nghị quyết đưa công tác xúc tiến và dự phòng bệnh sâu răng vào quy hoạch phòng ngừa, điều trị tổng hợp các bệnh mạn tính. Mảng bám răng (dental plaque) thực chất là một màng sinh học (biofilm) phức tạp do nhiều loài vi sinh vật cư trú tạo thành, kết dính chặt chẽ với bề mặt men răng thông qua mạng lưới chất nền polymer ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances - EPS) không tan trong nước.

Mối liên hệ giữa các loài thuộc chi Lactobacillus với tiến trình sâu răng đã được ghi nhận trong y văn hơn một thế kỷ qua. Nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh mật độ Lactobacillus spp. gia tăng rõ rệt sau giai đoạn đầu của tổn thương sâu răng. Các khảo sát quốc tế cho thấy Lactobacillus spp. chiếm tới 62% trong mảng bám răng (Sigurjons và cộng sự), tỷ lệ phân lập được ở trẻ 3–4 tuổi bị sâu răng đạt 54% so với chỉ 7% ở trẻ không mắc bệnh (Beighton và cộng sự), thậm chí mật độ vi khuẩn này ở trẻ sâu răng cao gấp 100 lần nhóm không sâu răng (Matee và cộng sự). Trong đó, loài Lactobacillus fermentum chiếm ưu thế vượt trội ở cả người lớn và trẻ em mắc bệnh. Trước thực trạng này, xu hướng ứng dụng vi khuẩn probiotic (chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic - LAB) nhằm bảo vệ sức khỏe răng miệng đang nhận được sự quan tâm lớn. Các vi khuẩn probiotic có thể ức chế mầm bệnh qua các cơ chế: tiết bacteriocin, sản sinh acid hữu cơ/H2O2, cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính và ngăn cản quá trình hình thành biofilm.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là phân lập các chủng vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các chủng Lactobacillus spp. phân lập từ mảng bám răng.

Đề tài đặt ra 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhóm đối tượng được lựa chọn.
  2. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic hiện diện trong khoang miệng.
  3. Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được.
  4. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh (nhóm BG - Biofilm Group) nghi ngờ là tác nhân gây sâu răng; tiến hành định danh phân tử các chủng này thuộc chi Lactobacillus.
  5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic thuộc nhóm không/ít tạo màng sinh học (NBG - Non-Biofilm Group) lên các chủng Lactobacillus spp. gây sâu răng mục tiêu và vi nấm Candida albicans.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 60 mẫu bệnh phẩm răng miệng (nước bọt và mảng bám răng) thu thập từ 30 cá nhân thuộc 11 hộ gia đình; các chủng vi khuẩn lactic bản địa phân lập từ khoang miệng và chủng nấm men chỉ thị Candida albicans.
  • Phạm vi không gian: Đề tài được thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới và Phòng thí nghiệm Lầu 7, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH).
  • Phạm vi thời gian: Đồ án được hoàn thành và bảo vệ vào năm 2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

Đề tài dựa trên các cơ sở lý thuyết vi sinh học và sinh hóa răng miệng:

  • Cơ chế bệnh sinh sâu răng: Phụ thuộc vào sự tương tác đồng thời của 4 yếu tố chính gồm cấu trúc mô men/ngà răng (chứa 96% khoáng Hydroxyapatite - $\text{Ca}_{10}(\text{PO}_4)_6(\text{OH})_2$), sự hiện diện của vi khuẩn sinh acid (Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.), nguồn cơ chất carbohydrate (đặc biệt là sucrose bị enzyme dextransucrase chuyển hóa thành dextran kết dính) và thời gian phơi nhiễm acid khiến pH tụt xuống dưới ngưỡng tới hạn (pH < 5,5), dẫn tới khử khoáng men răng.
  • Lý thuyết màng sinh học (Biofilm) và chất nền ngoại bào EPS: EPS chiếm 50–90% tổng lượng chất hữu cơ của biofilm, tạo thành mạng lưới vật lý bảo vệ vi khuẩn khỏi tác nhân diệt khuẩn, hỗ trợ trao đổi tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào (Quorum sensing) và tăng cường khả năng đề kháng kháng sinh lên gấp 1000 lần so với dạng tế bào phù du (planktonic).
  • Khái niệm Probiotic theo định nghĩa FAO/WHO (2001): Các vi sinh vật sống khi bổ sung với số lượng đầy đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ thông qua tác động cạnh tranh sinh học và điều hòa miễn dịch tại chỗ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm (in vitro) kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử:

Nhóm phương pháp Kỹ thuật và quy trình thực hiện cụ thể
Thu thập và xử lý mẫu Thu mẫu nước bọt không kích thích và mẫu mảng bám răng từ 30 đối tượng; ghi nhận chỉ số sâu răng (DT, FT, MT, DMFT).
Phân lập vi sinh vật Cấy trải và cấy gạt mẫu trên môi trường chọn lọc Lactobacillus Selection medium (LBS agar) và deMan, Rogosa and Sharpe (MRS); ủ yếm khí ở 37°C trong 48 giờ.
Nhận diện hình thái và sinh hóa Nhuộm Gram, soi kính hiển vi quang học (vật kính 100x), kiểm tra khả năng di động, khả năng sinh bào tử, phản ứng enzyme catalase và thử nghiệm lên men các nguồn carbohydrate khác nhau.
Định lượng màng sinh học Nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa vi lượng 96 giếng trong môi trường chuyên biệt Lactobacillus biofilm medium (LBM); rửa bỏ tế bào phù du, cố định màng sinh học, nhuộm bằng dung dịch Crystal Violet và đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm ($\text{OD}_{570}$) để phân loại nhóm BG và NBG.
Sinh học phân tử & Định danh Tách chiết DNA tổng số; khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'); điện di kiểm tra trên gel agarose; gửi mẫu giải trình tự tại Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Dược phẩm Nam Khoa; so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST và thiết lập cây phát sinh loài.
Khảo sát đối kháng Biofilm Phương pháp đồng nuôi cấy (co-culture) giữa dịch vi khuẩn NBG và các chủng BG (Lactobacillus fermentum 1B, 12R2, 30B2) cùng Candida albicans trên đĩa 96 giếng; đánh giá mức độ giảm tạo màng thông qua phép đo $\text{OD}_{570}$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về giải phẫu học men răng, vi sinh vật học khoang miệng, cơ chế tạo biofilm và tiềm năng ứng dụng của probiotic. Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc đa tầng của men răng từ cấp độ cột tinh thể Hydroxyapatite (kích thước cao 160 nm, rộng 15–20 nm, xếp thành hệ tinh thể lục giác) đến các bó trụ Rod (đường kính 4–8 µm) và vùng Interrod, tạo nên cấu trúc hình lỗ khóa (keyhole). Quá trình ăn mòn acid làm rỗng tâm trụ Hydroxyapatite, gây mất khoáng men răng. Tác giả điểm luận vai trò của các chi vi khuẩn kỵ khí (Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, Bifidobacterium...) và nấm (Candida spp.) trong khoang miệng.

Bên cạnh đó, chương này tổng kết cơ chế hình thành biofilm qua 4 giai đoạn (bám dính ban đầu, tạo vi khuẩn lạc, trưởng thành và tiết EPS, phân tán phù du), sự tác động của hệ thống Quorum sensing (lasR-lasI, rhlR-rhlI), cùng vai trò của các chủng probiotic như Lactobacillus rhamnosus GG, L. reuteri ATCC 55730, L. casei, Bifidobacterium animalis ssp. lactis trong các thử nghiệm lâm sàng giảm thiểu mật độ vi khuẩn sâu răng nhóm Mutans Streptococci (MS).

Chương 2: Phương pháp và vật liệu nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu, môi trường, hóa chất và quy trình kỹ thuật thực nghiệm:

  • Môi trường nuôi cấy: Môi trường chọn lọc LBS (chứa peptone, yeast extract, dextrose, polysorbate 80, ammonium citrate, potassium phosphate...), môi trường MRS broth/agar và môi trường tạo màng LBM.
  • Hệ thống thiết bị: Tủ ấm vi sinh, tủ ủ yếm khí, máy đọc đĩa Microplate Reader đo $\text{OD}_{570}$, máy PCR, hệ thống điện di ngang gel agarose, hệ thống chụp ảnh gel UV.
  • Quy trình thực nghiệm: Chi tiết hóa phương pháp lấy mẫu khoang miệng từ 30 đối tượng; các bước phân lập, làm thuần chủng; quy trình nhuộm Crystal Violet định lượng biofilm; quy trình ly trích DNA bằng phương pháp sốc nhiệt/hóa chất và tủa cồn; chu trình nhiệt PCR khuếch đại gen 16S rRNA với cặp mồi 27F/1492R; phương pháp thử nghiệm khả năng đồng hóa đường (carbohydrate fermentation test); và thiết kế bố trí các nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế biofilm.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình phân lập, sàng lọc và định danh:

  • Tình trạng răng miệng đối tượng thu mẫu: Khảo sát 30 đối tượng thuộc 11 hộ gia đình, ghi nhận sự phân bố đa dạng về số lượng răng sâu (DT), răng đã trám (FT) và răng mất (MT).
  • Phân lập vi khuẩn Lactic: Từ 60 mẫu nước bọt và mảng bám, phân lập thành công 30 chủng vi khuẩn lactic mang đặc tính Gram dương, không sinh bào tử, không di động và phản ứng catalase âm tính.
  • Sàng lọc khả năng tạo màng sinh học: Phép đo quang phổ $\text{OD}_{570}$ trên đĩa 96 giếng cho phép phân loại 30 chủng thành 2 nhóm: nhóm tạo biofilm yếu/không tạo màng (NBG) và nhóm tạo biofilm mạnh (BG). Trong đó, chọn lọc được 3 chủng có mật độ quang biofilm cao vượt trội là 1B, 12R2 và 30B2.
  • Kết quả sinh học phân tử và định danh: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen 16S rRNA của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 cho một vệt sáng đơn, rõ nét trên gel điện di ở kích thước xấp xỉ 1500 bp. Kết quả giải trình tự và so sánh BLAST trên ngân hàng gen NCBI kết hợp hồ sơ lên men carbohydrate xác định cả 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài Lactobacillus fermentum với độ tương đồng DNA cao.
  • Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học: Kết quả đồng nuôi cấy các chủng NBG với 3 chủng L. fermentum (1B, 12R2, 30B2) và chủng Candida albicans chỉ ra rằng có 11 chủng vi khuẩn lactic nhóm NBG thể hiện khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của ít nhất một trong bốn chủng vi sinh vật mục tiêu.

Chương 4: Kết luận

Chương 4 đúc kết toàn bộ các kết quả đạt được của đồ án tốt nghiệp, khẳng định tính khả thi của việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic nội sinh trong khoang miệng nhằm định hướng phát triển các chế phẩm sinh học đối kháng biofilm gây sâu răng.


Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

  • Thu thập thành công 60 mẫu bệnh phẩm từ 30 đối tượng (11 hộ gia đình), hoàn thành đánh giá thực trạng răng miệng lâm sàng.
  • Phân lập và tuyển chọn được 30 chủng vi khuẩn lactic mang đầy đủ đặc tính sinh lý - sinh hóa điển hình của LAB.
  • Sàng lọc định lượng khả năng sinh biofilm trên đĩa 96 giếng bằng phương pháp đo độ hấp thụ Crystal Violet $\text{OD}_{570}$, xác định được 3 chủng vi khuẩn tạo biofilm mạnh nhất ký hiệu là 1B, 12R2 và 30B2.
  • Khuếch đại thành công đoạn gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R và giải trình tự nucleotide; định danh chính xác cả 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều là Lactobacillus fermentum.
  • Xác định được 11 chủng vi khuẩn lactic nhóm NBG có hoạt tính kháng tạo màng sinh học đối với 3 chủng L. fermentum sinh màng mạnh và nấm men Candida albicans.
Thông số / Chỉ tiêu thực nghiệm Kết quả định lượng trong văn bản
Số hộ gia đình tham gia lấy mẫu 11 hộ gia đình
Tổng số đối tượng khảo sát răng miệng 30 cá nhân
Tổng số mẫu bệnh phẩm thu nhận 60 mẫu (nước bọt và mảng bám răng)
Số chủng vi khuẩn lactic (LAB) phân lập được 30 chủng
Số chủng LAB có khả năng tạo biofilm mạnh (nhóm BG) 03 chủng (1B, 12R2, 30B2)
Kết quả định danh phân tử 3 chủng nhóm BG Lactobacillus fermentum
Số chủng LAB nhóm NBG có khả năng ức chế biofilm 11 chủng (ức chế ít nhất 1/4 vi sinh vật mục tiêu)
Đối tượng vi sinh vật mục tiêu thử nghiệm ức chế L. fermentum 1B, 12R2, 30B2 và Candida albicans

Giải pháp và khuyến nghị của tác giả

  • Ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic khoang miệng nhóm NBG có hoạt tính đối kháng biofilm làm nguồn probiotic tiềm năng trong các chế phẩm chăm sóc răng miệng (nước súc miệng, kem đánh răng sinh học, kẹo ngậm men vi sinh).
  • Sử dụng phương pháp sàng lọc vi lượng trên đĩa 96 giếng kết hợp nhuộm Crystal Violet như một quy trình chuẩn hóa, nhanh chóng để đánh giá năng lực tạo màng và kháng màng sinh học của vi sinh vật nha khoa.

Đóng góp học thuật và thực tiễn

  • Cung cấp dẫn liệu vi sinh học và sinh học phân tử về các chủng Lactobacillus fermentum bản địa có khả năng tạo biofilm mạnh trong khoang miệng người Việt Nam.
  • Bước đầu chứng minh khả năng ức chế màng sinh học chéo giữa các chủng vi khuẩn lactic nội sinh đối với các tác nhân vi khuẩn (L. fermentum) và nấm men (Candida albicans) gây tổn thương mô răng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Quy mô khảo sát tình trạng răng miệng và thu mẫu còn giới hạn (30 đối tượng từ 11 hộ gia đình tại một khu vực địa lý).
  • Các thử nghiệm ức chế màng sinh học mới dừng lại ở mô hình đồng nuôi cấy in vitro trên bề mặt nhựa polystyrene (đĩa 96 giếng), chưa mô phỏng toàn diện điều kiện dòng chảy nước bọt và bề mặt Hydroxyapatite tự nhiên của men răng.
  • Chưa phân tích sâu về bản chất hóa học của các hợp chất kháng khuẩn/bacteriocin do các chủng NBG tiết ra.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng cỡ mẫu phân lập trên nhiều nhóm đối tượng ở các độ tuổi và tình trạng bệnh lý răng miệng khác nhau.
  • Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và phân tích cơ chế phân tử của các chất chuyển hóa (bacteriocin, biosurfactant, H2O2, acid hữu cơ) chịu trách nhiệm ức chế biofilm.
  • Khảo sát khả năng bám dính và ức chế biofilm trên mô hình thực nghiệm bề mặt răng nhân tạo (Hydroxyapatite disc) và thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên động vật.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng: Tham khảo quy trình phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường chọn lọc LBS, kỹ thuật tách chiết DNA vi khuẩn Gram dương, phản ứng PCR 16S rRNA với cặp mồi 27F/1492R và phương pháp định lượng biofilm bằng Crystal Violet trên đĩa 96 giếng.
  • Cán bộ nghiên cứu và sinh viên ngành Răng - Hàm - Mặt, Dược học: Tiếp cận các dữ liệu thực nghiệm về vai trò sinh bệnh học của Lactobacillus fermentum trong mảng bám răng và tiềm năng ứng dụng probiotic trong dự phòng sâu răng.
  • Nội dung đáng giá nhất để trích dẫn: Quy trình sàng lọc định lượng biofilm ($\text{OD}_{570}$) và bảng tổng hợp các nghiên cứu probiotic bảo vệ răng miệng trên thế giới tại Chương 1 và Chương 2.

Câu hỏi thường gặp

1. Đồ án sử dụng cặp mồi nào để khuếch đại đoạn gen định danh vi khuẩn?

Tác giả sử dụng cặp mồi phổ biến khuếch đại vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn gồm mồi xuôi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và mồi ngược 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), tạo ra sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp.

2. Tiêu chí nào được dùng để phân chia nhóm vi khuẩn lactic thành nhóm BG và NBG?

Tiêu chí phân chia dựa vào mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng đĩa nuôi cấy 96 giếng trong môi trường LBM sau 24 giờ ủ, được định lượng thông qua phương pháp nhuộm Crystal Violet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 570 nm ($\text{OD}{570}$). Các chủng có giá trị $\text{OD}{570}$ cao vượt trội được xếp vào nhóm tạo màng mạnh (BG - Biofilm Group), các chủng còn lại thuộc nhóm không hoặc ít tạo màng (NBG - Non-Biofilm Group).

3. Ba chủng vi khuẩn tạo màng sinh học mạnh nhất (1B, 12R2, 30B2) được định danh là loài gì?

Dựa trên hình thái tế bào que ngắn/chuỗi, đặc tính sinh hóa, khả năng lên men các nguồn carbohydrate và kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI, cả 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 đều được định danh chính xác là loài Lactobacillus fermentum.

4. Có bao nhiêu chủng vi khuẩn lactic thể hiện hoạt tính ức chế màng sinh học trong thử nghiệm đối kháng?

Từ tập hợp các chủng phân lập, nghiên cứu đã chọn lọc được 11 chủng vi khuẩn lactic thuộc nhóm NBG có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của ít nhất một trong bốn chủng vi sinh vật mục tiêu (Lactobacillus fermentum 1B, 12R2, 30B2 và nấm men Candida albicans).


Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Tuấn Anh đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu đặt ra thông qua việc phân lập thành công 30 chủng vi khuẩn lactic từ 60 mẫu bệnh phẩm khoang miệng của 30 đối tượng. Nghiên cứu đã sàng lọc, định danh phân tử 3 chủng vi khuẩn tạo màng sinh học mạnh (Lactobacillus fermentum 1B, 12R2, 30B2) và phát hiện 11 chủng vi khuẩn lactic nhóm NBG có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của các tác nhân gây sâu răng và nấm men mục tiêu. Đây là công trình thực nghiệm vi sinh - sinh học phân tử có phương pháp luận chặt chẽ, đóng góp dữ liệu khoa học thiết thực cho định hướng phát triển các giải pháp probiotic dự phòng bệnh sâu răng tại Việt Nam.