MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cho đến nay, kiến thức thu được từ lịch sử y học cổ truyền đã cho chúng ta thấy về tầm quan trọng của cây thuốc và chúng hữu ích như thế nào trong việc bảo vệ sức khỏe con người khỏi các chứng rối loạn khác nhau. Sâm từ lâu đã được biết đến như một thần dược, được sử dụng để tăng cường sinh lực, bồi bổ sức khỏe, phòng chống bệnh tật, kéo dài tuổi thọ,… Tuy nhiên trên thị trường hiện nay, giá của sâm rất đắt đỏ do nhiều yếu tố khác nhau như thời gian sinh trưởng dài, hiếm gặp trong tự nhiên, cháy rừng, hạn hán và nhu cầu sử dụng quá cao. Trong các loài nhân sâm có mặt trên thị trường hiện nay, phổ biến nhất là giống nhân sâm Hàn Quốc (Panax ginseng C.
Nhờ bộ nhiễm sắc thể tứ bội sẵn có, củ sâm P. gingseng thường có khối lượng vượt trội cũng như mang các tính trạng chống chịu tốt hơn hẳn so với các loài nhân sâm khác như sâm Nhật Bản, sâm Trung Quốc (Yu-Jin Kim, 2016). Đây chính là yếu tố giúp loài nhân sâm này trở nên phổ biến bậc nhất trên thế giới. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là loài sâm đặc hữu của Việt Nam.
Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm, các nhà khoa học đã nhận thấy sâm Ngọc Linh không chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Sâm mà còn có những tác dụng dược lý điển hình như chống stress, trầm cảm, giảm lo âu, kích thích hệ miễn dịch, kháng các độc tố gây hại tế bào, tác dụng lên sự chống oxy hóa in vitro và in vivo…(Konoshima và cs. Sâm Ngọc Linh là một trong những loài sâm có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12 - 15%) và lượng saponin triterpen nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Dụng và Grushv, 1985). Vì những lý do này, sâm Ngọc Linh càng được chú trọng sản xuất để đáp ứng các nhu cầu về sức khỏe. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cải tiến và chọn tạo dòng sâm Ngọc Linh không nhiều, kể cả trong và ngoài nước.
Trước tình hình khan hiếm cũng như sự phân bố đặc hiệu của sâm Ngọc Linh, việc chọn tạo giống mới có hàm lượng dược liệu và năng suất cao, nâng cao khả năng thích nghi và chống chịu của loài này đang là vấn đề rất được quan tâm. Một trong những cách để đạt được những mục tiêu ưu việt này là tạo ra thể đa bội của sâm có thể có nhiều tác dụng dược lý hơn thể lưỡng bội. Vì vậy việc tạo ra, tuyển chọn và nhân giống được dòng sâm Ngọc Linh mới mang bộ NST đa bội cho sinh khối rễ, hàm lượng dược liệu cao và khả năng chống chịu stress môi trường tốt là điều rất cần thiết cho xu hướng ưa chuộng dược liệu từ thiên nhiên hiện nay. Mặc dù những nghiên cứu trên đặc tính hình thái, sinh lý và bộ gen của sâm Ngọc Linh đều đã được thực hiện, tuy nhiên việc nghiên cứu về mức độ đa bội thể của sâm vẫn 1 còn bỏ ngỏ.
Việc thiếu dữ liệu này đã gây trở ngại lớn cho các nghiên cứu sâu hơn về các chương trình chọn tạo giống mới. Nhận thấy được tính chất quan trọng trong việc thiếu dữ liệu của sâm Ngọc Linh nói chung chi Panax nói riêng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân biệt dòng đa bội và tái sinh thể đa bội sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. Các kết quả của đề tài sẽ phần nào hữu ích cho việc cung cấp thêm thông tin về đa bội thể của sâm Ngọc Linh, phục vụ chương trình chọn tạo dòng đa bội cho năng suất và chất lượng cao. Mục tiêu đề tài Tuyển chọn được dòng sâm Ngọc Linh đa bội, đánh giá được mức đa bội thể của sâm Ngọc Linh qua các đặc điểm hình thái và tế bào học.
Bước đầu tạo vật liệu nuôi cấy in vitro các dòng sâm Ngọc Linh đa bội. Ý nghĩa của đề tài 3. Ý nghĩa khoa học Các kết quả được trình bày ở đây sẽ đóng góp đáng kể vào các nghiên cứu về đa bội thể ở sâm Ngọc Linh nói chung và các loài dược liệu quý ở Việt Nam nói riêng. Nghiên cứu về tế bào là cần thiết để hiểu lịch sử di truyền tế bào của sâm Ngọc Linh và các loài khác trong chi Panax.
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung những tư liệu khoa học về đặc điểm sinh học của sâm Ngọc Linh, góp phần làm phong phú thêm kho tư liệu về sâm ở Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài cung cấp thêm tư liệu cho chương trình chọn tạo dòng đa bội sâm, phục vụ công tác bảo tồn giống và sản xuất với năng suất dược liệu cao. Bước đầu tạo vật liệu nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh đa bội. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Đánh giá mức đa bội qua các đặc điểm hình thái, khí khổng và lục lạp của sâm Ngọc Linh đã xử lý bằng colchicine.
- Nội dung 2: Xác định số lượng NST của các dòng sâm Ngọc Linh đa bội. - Nội dung 3: Cảm ứng tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu sâm đa bội đã được tuyển chọn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về Sâm Ngọc Linh 1.1 Nguồn gốc và đặc điểm phân loại sâm Ngọc Linh Cây sâm Ngọc Linh là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, thân thảo sống đan xen trong quần thể thực vật đa dạng vùng rừng núi hiểm trở, lạnh và mây mù gần như quanh năm, không có dân cư.
Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban Dân Y khu 5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn đã phát hiện được một loài Panax mọc thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Đăk Lây, huyện Đăk Tô, tỉnh Kon Tum và đặt tên là “sâm Đốt trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulatus L., họ nhân sâm (Araliaceae) (Đào Kim Long, 1973). Năm 1974, qua báo cáo của dược sĩ Nguyễn Thới Nhâm về kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cây sâm K5 so với cây sâm Triều Tiên và sâm Tam thất. Khu ủy khu 5 đã cho bảo vệ chặt chẽ vùng sâm này và cũng từ đấy sâm K5 được sử dụng để chữa bệnh có hiệu quả cho các thương bệnh binh, cán bộ và nhân dân (Vũ Thị Hiền và cs. Phân loại khoa học: Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Apiales Họ (familia): Araliaceae Chi (genus): Panax Loài (species): P.
Vietnamensis Ha et Grushv Trải qua hơn 30 năm, sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis và đã xác định thân rễ và rễ củ sâm Việt Nam chứa 52 saponin triterpen trong đó có 26 saponin với tổng số hàm lượng là 10,82% (Dung và cs, 1985). So với 3 loài sâm quý nhất thế giới thì sâm Triều Tiên chỉ có 25 saponin với tổng số hàm lượng là 3,52%, sâm Mỹ chỉ có 14 saponin với hàm lượng 3,83%, sâm Trung Quốc có 23 saponin với tổng số hàm lượng là 4,87%. Saponin triterpen là thành phần hóa học quan trọng nhất của sâm, tạo nên các tác dụng chủ yếu của sâm. Ngoài ra, nó có 7 hợp chất polyacetylen có tính kháng khuẩn và kháng ung thư, 17 acid béo đặc biệt là acid béo không no như: oleic (13,26%), linoleic (40,04%) và linolenic (2,61%), 18 acid amin trong đó có đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ 3 thể và các acid amin chống lão hóa tế bào có tỷ lệ rất cao và còn có 20 nguyên tố đa vi lượng (Vũ Thị Hiền và cs.
Đặc điểm phân bố Đến nay, vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum ở miền trung của Việt Nam, tại 14º15’ vĩ độ Bắc, là nơi duy nhất được phát hiện có sâm Ngọc Linh. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía Nam của bản đồ phân bố chi nhân sâm trên thế giới (Dương Tấn Nhựt, 2016). Sâm Ngọc Linh có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum); Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai ở Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107º5’-108º7’ kinh tuyến Đông và từ 15º0’-15º1’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598m.
Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500-2200m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000m, thuộc địa bàn của hai huyện Đắk Tô (Kon Tum) và Nam Trà My (Quảng Nam) (Dương Tấn Nhựt, 2016); nhưng giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh đã có nhiều thay đổi. Loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp (Dương Tấn Nhựt, 2016). Hiện tại, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào danh mục sách đỏ của Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) năm 2003 và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm). Đến nay, sâm Ngọc Linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng 10 hecta (Đỗ Hữu Bích, 2003; Hà Thị Dụng và cs.
Đặc điểm hình thái Sâm Ngọc Linh là loài cây thân thảo sống lâu năm, thân rễ có sẹo và các đốt do thân khí sinh rụng hàng năm để lại, cao khoảng 40-100cm. Loài sâm này bắt đầu xuất hiện ở độ cao 1.500m trở lên so với mực nước biển.000m, cây mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối, có độ ẩm trên 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, dưới tán rừng hỗn giao giữa lá rộng và lá kim. Thân rễ: thân rễ nạc, đường kính 1-3,5cm, chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay vàng đất, có nhiều đốt, mang những vết sẹo do thân lụi hàng năm để lại, mỗi vết tương đương với 1 năm tuổi. Thân rễ mang nhiều rễ con và những vết nhăn dọc, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt.
4 Rễ củ: rễ củ nằm cuối thân rễ, dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang.