Nghiên cứu ảnh hưởng nuôi cấy đến sinh khối, hoạt chất nấm Cordyceps militaris

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm Cordyceps militaris nhằm tăng hàm lượng sinh khối và các hoạt chất có giá trị dược liệu cao.

• Tác giả: Tạ Thị Thanh Trà
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Quỳnh Hoa
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy trên giá thể đến hàm lượng sinh khối và hoạt chất trong nấm Cordyceps militaris
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Cordyceps militaris và ý nghĩa nuôi cấy

Cordyceps militaris là một loài nấm có giá trị dược liệu cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại. Nấm này chứa nhiều hoạt chất quý giá như cordycepin và adenosin, có tác dụng tăng cường sức khỏe và miễn dịch. Nuôi cấy Cordyceps militaris trên giá thể là phương pháp hiện đại, thay thế việc khai thác tự nhiên, giúp bảo vệ nguồn tài nguyên sinh vật. Quy trình này không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng mà còn tạo ra sản phẩm với hàm lượng sinh khối và hoạt chất ổn định, chất lượng cao. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là chìa khóa để tăng năng suất và nâng cao chất lượng sản phẩm cuối cùng.

1.1. Đặc điểm sinh học và thành phần hóa học

Cordyceps militaris là nấm kí sinh có vòng đời phức tạp, mối quan hệ chặt chẽ với côn trùng chủ. Nấm chứa cordycepin, adenosin, polysaccharide và các axit amino quan trọng. Các hoạt chất này có tác dụng miễn dịch, chống oxy hóa, tăng năng lượng tế bào. Việc nâng cao hàm lượng sinh khối thông qua nuôi cấy là mục tiêu chính để tối đa hóa giá trị dược liệu của sản phẩm.

1.2. Lợi ích của nuôi cấy so với khai thác tự nhiên

Nuôi cấy Cordyceps militaris trên giá thể mang lại nhiều lợi ích vượt trội. Phương pháp này cho phép kiểm soát điều kiện môi trường, từ đó tối ưu hóa sinh khối và hàm lượng hoạt chất. Chi phí sản xuất thấp hơn, năng suất cao hơn so với khai thác tự nhiên. Sản phẩm có chất lượng ổn định, độ an toàn cao và bảo vệ được tài nguyên sinh học thiên nhiên.

II. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sinh khối và hoạt chất

Để đạt được sinh khối cao và hàm lượng hoạt chất tối ưu trong nuôi cấy Cordyceps militaris, cần kiểm soát chặt chẽ nhiều yếu tố quan trọng. Thành phần giá thể bao gồm loại gạo, nồng độ đường, pepton, và các chất khoáng như KH₂PO₄, MgSO₄ có ảnh hưởng trực tiếp. Điều kiện vật lý như thời gian nuôi cấy, thể tích tiêm mẫu cũng đóng vai trò then chốt. Nồng độ các nguồn dinh dưỡng cần cân bằng hợp lý để nấm phát triển tối ưu, tích lũy hoạt chất hiệu quả. Nghiên cứu các yếu tố này giúp xây dựng công thức giá thể tối ưu, tăng năng suất và chất lượng sản phẩm cuối cùng đáng kể.

2.1. Ảnh hưởng của thành phần giá thể đến sinh khối

Loại gạo, nồng độ đường và các nguồn nitơ (pepton, cao nấm men) là nền tảng cho sự phát triển của Cordyceps militaris. Đường cung cấp năng lượng, pepton cung cấp axit amino cần thiết. Nồng độ tối ưu của từng thành phần tăng sinh khối đáng kể. Việc lựa chọn đúng loại gạo làm giá thể ảnh hưởng đến khả năng hấp thu dinh dưỡng và phát triển quả thể.

2.2. Điều kiện nuôi cấy và tích lũy hoạt chất

Thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, ánh sáng tác động mạnh mẽ đến hàm lượng cordycepin và adenosin. Thể tích tiêm mẫu và nồng độ các chất khoáng (KH₂PO₄, MgSO₄) điều chỉnh quá trình chuyển hóa nấm. Tối ưu hóa các điều kiện này theo phương pháp RSM (Response Surface Methodology) giúp tăng hoạt chất một cách đáng kể và ổn định.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy

Để đạt được sinh khối cao nhất và hoạt chất tối ưu trong nuôi cấy Cordyceps militaris, cần áp dụng các phương pháp tối ưu hóa khoa học. Phương pháp OFAT (One-Factor-At-a-Time) cho phép khảo sát từng yếu tố riêng lẻ, xác định điểm tối ưu ban đầu. Tiếp theo, phương pháp RSM (Response Surface Methodology) được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy một cách toàn diện, xem xét tương tác giữa các yếu tố. Định lượng HPLC đối với cordycepin và adenosin cho phép đánh giá chính xác hàm lượng hoạt chất. Kết hợp ba phương pháp này tạo nên quy trình nghiên cứu toàn diện, khoa học, giúp xây dựng công thức giá thể và điều kiện tối ưu, tăng hiệu suất sản xuất đáng kể.

3.1. Phương pháp OFAT khảo sát yếu tố đơn

Phương pháp OFAT là bước đầu tiên trong tối ưu hóa quy trình nuôi cấy. Phương pháp này khảo sát từng yếu tố như nồng độ đường, pepton, khoáng chất một cách độc lập. Ưu điểm là dễ thực hiện, chi phí thấp, kết quả rõ ràng từng yếu tố. Phương pháp giúp xác định khoảng tối ưu ban đầu, từ đó làm cơ sở cho RSM.

3.2. Phương pháp RSM tối ưu hóa toàn diện

Phương pháp RSM (Response Surface Methodology) xem xét tương tác giữa các yếu tố, tạo mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa biến độc lập và sinh khối, hoạt chất. Phương pháp này tìm ra điểm tối ưu toàn diện, nâng cao hiệu quả sản xuất hiệu quả. Kết hợp RSM với HPLC cho phép xác định chính xác hàm lượng cordycepin và adenosin, đảm bảo sản phẩm chất lượng cao nhất.

IV. Ứng dụng thêm dược liệu vào giá thể và kết quả thu được

Thêm dược liệu vào giá thể nuôi cấy Cordyceps militaris là hướng đi mới, có tiềm năng tăng sinh khối và nâng cao hoạt chất. Các dược liệu được lựa chọn có thành phần bổ sung hoặc tăng cường các yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm. Hoạt chất của dược liệu có thể tương tác tích cực với quá trình chuyển hóa của Cordyceps militaris, tạo ra sản phẩm với giá trị sinh học cao hơn. Các nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của dược liệu cho thấy khả năng tăng cordycepin, adenosin và các polysaccharide. Điều này mở ra cơ hội phát triển sản phẩm kết hợp có hiệu quả y học vượt trội, đáp ứng nhu cầu của thị trường chăm sóc sức khỏe hiện đại.

4.1. Lựa chọn dược liệu bổ sung cho giá thể

Dược liệu bổ sung được chọn dựa trên thành phần hóa học và tác dụng sinh học tương thích với Cordyceps militaris. Các dược liệu tăng cường miễn dịch như nhân sâm, linh chi, hoặc dược liệu cung cấp dinh dưỡng như yến mạch, đậu đen có thể tăng sinh khối nấm. Tương tác giữa hoạt chất của dương liệu và nấm tạo synergy effect, nâng cao hàm lượng tổng hoạt chất trong sản phẩm cuối cùng.

4.2. Kết quả và ý nghĩa của sản phẩm tối ưu hóa

Các kết quả nghiên cứu cho thấy thêm dược liệu vào giá thể giúp tăng sinh khối 15-30% và tăng hàm lượng cordycepin, adenosin đáng kể. Sản phẩm tối ưu hóa có hiệu quả sinh học vượt trội, an toàn cho sức khỏe. Điều này tạo giá trị thương mại cao, cạnh tranh mạnh trên thị trường. Sản phẩm có thể ứng dụng trong bổ sung dưỡng chất, hỗ trợ bệnh lý trong y học hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Các loài Cordyceps trong tự nhiên được sử dụng làm dược liệu quý từ lâu đời. Dõng trùng thảo (Cordyceps militaris (L.) là một loài nấm có nguồn gốc tự nhiên nhưng có thể được nuôi cấy nhân tạo, trong thành phần có chứa nhiều hoạt chất sinh học như cordycepin, adenosin, acid cordiceptic, polychaccarid, superoxid dismutase (SOD) và một số chất dinh dưỡng khác [1], [2]. Trong đó, cordycepin và adenosin được coi là hai hoạt chất quan trọng của Cordyceps militaris, thể hiện nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý của loài nấm này. Nhiều nghiên cứu cho thấy C.

militaris sở hữu nhiều đặc tính dược lý khác nhau, bao gồm tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, hạ lipid máu,. Do có giá trị dược lý cao nên nhu cầu sử dụng C. militaris để nâng cao sức khỏe, tăng cường miễn dịch là rất lớn. Nhu cầu ngày càng tăng này đã thúc đẩy những đổi mới trong việc nuôi cấy nhân tạo C.

militaris, được thiết kế để tăng năng suất và sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các yếu tố ngoại cảnh cũng như sự khác nhau giữa các chủng nấm sử dụng trong quá trình nuôi cấy đều tác động đến sự phát triển và hàm lượng các hoạt chất trong quả thể nấm C. Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình nuôi cấy nhân tạo chủng nấm này và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy để thu được năng suất tạo quả thể, hàm lượng cordycepin cao [6-9]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào tối ưu hóa quy trình nuôi cấy đồng thời cả hai hoạt chất cordycepin và adenosin trên giá thể.

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy trên giá thể đến hàm lượng sinh khối và hoạt chất trong nấm Cordyceps militaris (L.” được thực hiện với các mục tiêu như sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy trên giá thể đến hàm lượng sinh khối và hoạt chất trong nấm C. Xác định một số điều kiện để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm C. militaris trên giá thể cho hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosin cao.

Khảo sát ảnh hưởng của một số dược liệu bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm C. Tổng quan về nấm Cordyceps militaris 1. Vị trí phân loài, phân bố Nấm C. militaris thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps, loài Cordyceps militaris.

Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris, sau đó được đổi tên thành Cordyceps militaris [10]. Tên thường gọi: Nấm nhộng trùng thảo, Nấm bắc trùng thảo, Nấm cam sâu bướm, Dõng trùng thảo,. Nấm này có phạm vi phân bố trải rộng khắp trên toàn cầu từ các nước châu Á sang các nước ở châu Âu và cả các nước ở Bắc Mỹ [11]. Đặc điểm Cordyceps militaris là nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, có quả thể màu vàng nhạt hoặc da cam dài 8–10 cm, đầu quả thể có đốm cam sáng.

Quả thể mọc từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang rỗng và màu nhạt. Các nang bào tử dài 300–510 µm, rộng 4 µm; bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3,5–6 x 1–1,5 µm. Trong điều kiện thiếu dinh dưỡng, các bào tử nang này sẽ tách ra và nảy chồi tạo bào tử thứ cấp [11].1: Hình ảnh nấm Cordyceps militaris được thu nhận ngoài tự nhiên (Nguồn: internet) 1. Chu trình sống Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C.

militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng. Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông. Bào tử nấm theo gió dính vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzym như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ 2 ngoài của ký chủ và xâm nhâp vào bên trong cơ thể.

Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoặc thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí [10], [12]. Các quả thể nấm C. militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam [13].

Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trình sống của nấm. Ở các điều kiện môi trường khác nhau, sự hình thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử trên môi trường nuôi cấy lỏng. Thành phần hóa học Do số lượng mẫu Cordyceps militaris ngoài tự nhiên tại Việt Nam rất ít nên nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của loài nấm này vô cùng hạn chế. Một số ít các nghiên cứu khác đã được công bố có nội dung về đánh giá thành phần hóa học của mẫu nấm đã được nuôi trồng nhân tạo.

Tại Việt Nam, năm 2024, các nhà nghiên cứu đã đánh giá hàm lượng một số hoạt chất trong một số chủng nấm C. militaris lai hữu tính từ chủng bố mẹ Nhật Bản và Hàn Quốc. Kết quả thu được hàm lượng adenosin khoảng 900-1900µg/g nấm khô, hàm lượng cordycepin khoảng 50-190µg/g nấm khô, tổng hàm lượng phenolic khoảng 100µg GAE/mL, tổng hàm lượng flavonoid khoảng 1µg QE/mL, hàm lượng glucose khoảng 0,2g/L [14]. Trên thế giới, đã có nhiều công bố về thành phần hóa học của C.

Từ các kết quả nghiên cứu, những hoạt chất quyết định hoạt tính sinh học đáng chú ý của chủng nấm này thuộc nhóm nucleosid và polysaccharid [1], [15], [16]. Trong nhóm nucleosid, có 2 hoạt chất được các nhà khoa học quan tâm là adenosin và cordycepin [1], [15], [16]. - Cordycepin là một dẫn xuất của nucleosid adenosin, được phân lập đầu tiên từ chính Cordyceps militaris [1], [15], [16]. Tên IUPAC là 3′-Deoxyadenosin.

Cordycepin có công thức C10H13N5O3 và có phân tử lượng 251, có điểm nóng chảy tại 230-231oC, độ hấp thu cực đại tại 260 nm. Cordycepin có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol nhưng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform. - Adenosin là nucleosid chính của chi Cordyceps. Adenosin là một nucleosid nội sinh, bao gồm một phân tử đường ribose và một phân tử adenin – một trong bốn nucleotid chung tay xây dựng các khối DNA – vật liệu di truyền [1], [15], [16].

Tên IUPAC là (2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl) oxolan-3,4- 3 diol. Adenosin tan tốt trong propanol, tan trong ethanol tốt hơn methanol và nước; hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm. Cordycepin Adenosin Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cordycepin và adenosin Adenosin và cordycepin có công thức tương tự nhau, adenosin hơn cordycepin một nhóm OH trên vòng ribose. Các nucleosid khác và các chất liên quan của chúng được tìm thấy trong Cordyceps militaris: cytidin, cytosin, guanin, guanosin, uracil, uridin, hypoxanthin, inosin, thymin, thymidin, 2`-deoxyuridin, 2`-deoxya-denosin, N-6-methyladenosin và 6-hydroxyethyl-adenosin,.

Các polysaccharid được tìm thấy trong C. militaris là: galactose (Gal) và mannose (Man). Cấu tạo của các polysaccharid là từ các monosaccharid nên trong quá trình phân tích chủng nấm này cũng có thể phân lập được ra các hoạt chất như: rhamnose, arabinose (Ara), xylose (Xyl), ribose, fucose, acid galacturonic (GalA), acid glucuronic (GlcA) và N-acetyl galactosamin [1], [15], [16]. Ngoài 2 nhóm hoạt chất nổi bật đặc trưng cho loài trên, C.

militaris còn chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học khác như: các acid amin (acid γ-aminobutyric (GABA), ergothionein,.), D- mannitol (tên gọi khác của acid cordycepic), các xanthophyll bao gồm các carotenoid (lutein, zeaxanthin,.), các hợp chất phenolic (bao gồm các acid phenolic và các flavonoid), chất khoáng (magnesi, kali, selen, lưu huỳnh,. Tác dụng dược lý Nấm Cordyceps militaris đã được sử dụng rộng rãi ở khắp mọi nơi như một loại thực phẩm bổ dưỡng. militaris có một loạt các tác dụng dược lý, bao gồm chống 4 viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, tăng cường miễn dịch, hạ đường huyết, hoạt động sinh steroid,… [18]. Tác dụng chống ung thư Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh được tác dụng chống ung thư vú [19], chống ung thư ruột kết [20], ức chế sự phát triển và di căn của các tế bào ung thư bàng quang [21], hạn chế sự hình thành mạch máu mới của các tế bào u ác tính [22], ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư phổi [23], ức chế tế bào ung thư buồng trứng [24], ức chế sự phát triển ung thư gan [25],.

ở người của cao chiết nước hoặc cồn của Cordyceps militaris. Trong công trình khoa học của Park và cộng sự [26], các tác giả đã chứng minh rằng cao chiết nước C. militaris ức chế sự tăng sinh và gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư phổi ở người. Hoạt động chống khối u của C.

militaris có liên quan đến sự gia tăng hoạt động enzym của caspase-3, caspase-8 và caspase-9, và ức chế enzym telomerase. Nghiên cứu báo cáo sự gia tăng nồng độ protein Fas, liên quan đến "thụ thể chết" của các tế bào ung thư. Các hoạt chất như cordycepin, ergosterol, polysaccharid CMPS-II đã được công bố chính là các hoạt chất chính quyết định hoạt tính ức chế tế bào ung thư của chủng nấm này [20], [23]. Tác dụng chống oxy hóa Polysaccharid là thành phần chính tạo nên hoạt tính chống oxy hóa của Cordyceps militaris, trong khi cordycepin chưa được nghiên cứu nhiều về đặc tính này [15].

Ngoài ra, các hợp chất như ergothionein, phenolic, carotenoid và selen trong quả thể C. militaris cũng góp phần vào hoạt tính chống oxy hóa [1], [17], [27]. Một số polysaccharid như P70–1, CBP-1, CM-hs-CPS2, WCBP50, CMP, CMP- 1 và SeCSP-I cho thấy khả năng trung hòa gốc tự do, tạo phức với ion Fe²⁺ và có hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt [28-33]. Đáng chú ý, người ta phát hiện ra rằng việc tăng lượng selen có trong môi trường nuôi cấy C.

militaris dẫn đến sự gia tăng các đặc tính chống oxy hóa của các phân đoạn polysaccharid [34]. Các nghiên cứu cho thấy cao chiết từ C. militaris nuôi cấy có hoạt tính chống oxy hóa và chống peroxy hóa lipid mạnh mẽ và ức chế sự tích tụ este cholesteryl trong đại thực bào thông qua việc ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp. Các enzym superoxid dismutase (SOD), catalase và GPX có tiềm năng chống oxy hóa được phát hiện là hoạt động mạnh hơn trong các thí nghiệm trên chuột được cho ăn C.

militaris có chứa polysaccharid và nồng độ malondialdehyd (MDA) cũng giảm [35], [36]. Người ta 5 cũng thấy mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và đặc tính bảo vệ thần kinh hoặc bảo vệ gan trong các cuộc điều tra bổ sung trên loài gặm nhấm. Tác dụng chống viêm Các nghiên cứu in vitro cho thấy cordycepin và ergosterol từ C.