CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin Để giảm thiểu những nguy cơ một cách tối đa cho bệnh nhân, các nhà khoa học đã nghiên cứu và có những kết quả bước đầu về những phương pháp điều trị ung thư mới, tuy nhiên những phương pháp này cũng còn nhiều hạn chế. Như liệu pháp miễn dịch ung thư là một phương pháp điều trị sáng tạo đầy hứa hẹn cho nhiều dạng ung thư, đặc biệt là u ác tính.
Mặc dù liệu pháp miễn dịch đã được chứng minh là có hiệu quả, tỷ lệ đáp ứng của bệnh nhân khác nhau và chỉ một nhóm nhỏ bệnh nhân trong một nhóm lớn đáp ứng tốt với điều trị [40]. Hay như một số cuộc điều tra đã được thiết kế để nghiên cứu tác dụng chống ung thư tiềm năng của chiết xuất vi tảo, trong đó họ chủ yếu kết luận khả năng gây chết tế bào ung thư apoptotic thông qua các con đường độc lập hoặc phụ thuộc caspase [9]. Hay Nanomedicine, một công nghệ thay thế đầy hứa hẹn cho phép tích tụ có chọn lọc các chất hóa trị liệu được quản lý một cách có hệ thống trong các mô khối u thông qua tác dụng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR) do khối u bị rò rỉ mạch máu và dẫn lưu bạch huyết kém. Tuy nhiên hiệu quả điều trị bị ảnh hưởng bởi thời gian lưu thông của các thuốc nano này trong máu, tương tác giữa các hạt nano và protein sau khi sử dụng và sự tương tác phức tạp tại môi trường vi mô khối u quanh mạch (TME) do sự hiện diện của nhiều các quá trình sinh học [21].
Việc sử dụng một số peptit tổng hợp được thiết kế để tối ưu hóa các đặc tính kháng sinh và chống khối u cũng như cải thiện khả năng điều trị, chúng có ưu điểm độc đáo của peptit, chẳng hạn như trọng lượng phân tử thấp, khả năng nhắm mục tiêu cụ thể vào tế bào khối u và độc tính thấp trong các mô bình thường. Tuy nhiên, các peptit trị liệu có một số nhược điểm đáng kể liên quan đến tính ổn định và thời gian bán hủy ngắn của chúng [34], [47], [45]. Azurin, một protein oxy hóa khử chống ung thư mạnh được tiết ra bởi các loài P. aeruginosa đã được báo cáo là có hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung thư vú.
Azurin là một protein oxy hóa khử trọng lượng phân tử thấp, là một trong những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu được sử dụng trong điều trị khối u, điều này download by : skknchat@gmail.com 4 đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp mới để tăng cường sản xuất protein này. Trong một nghiên cứu năm 2010, P. aeruginosa đã được phân lập từ phổi của bệnh nhân xơ nang ở Ai Cập và được xác định bằng rRNA 16S. Gen azurin được khuếch đại bằng chương trình PCR thích hợp.
Gen được nhân bản thành vectơ dễ dàng pGEM-T và được giải trình tự. Sau đó được nhân dòng vào vectơ biểu hiện quá mức pET-28a (+) bằng cách sử dụng vi khuẩn E. coli BL21 làm vi khuẩn biểu hiện. Protein tái tổ hợp được tinh chế bằng cách tinh chế một bước sử dụng nhựa Ni++.
Kết quả cho thấy azurin ức chế mạnh sự tăng sinh của cả dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết và dòng tế bào ung thư vú. Đồng thời, azurin không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào đến tế bào hắc tố bình thường của con người [38], [35]. Một nghiên cứu khác, tại Bệnh viện Đại học Mansoura đã phân lập 95 chủng P. aeruginosa từ bệnh nhân nội trú và bệnh nhân ngoại trú đã tham dự các phòng khám tại Bệnh viện Đại học Mansoura.
Kết quả nghiên cứu cho thấy azurin từ các phân lập địa phương khác nhau của P. aeruginosa đã phát huy tác dụng gây độc tế bào có thể nhìn thấy trên dòng tế bào MCF-7 của ung thư vú [50]. Năm 2011, thì một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các protein azurin từ các loài Pseudomonas khác nhau được phân tích để phân tích cấu trúc sinh lý sơ cấp, thứ cấp và mối quan hệ phát sinh loài của chúng. Nghiên cứu này chỉ ra rằng thành phần axit amin, trọng lượng phân tử khác nhau giữa protein azurin.
Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng protein azurin của các loài Pseudomonas khác nhau có tổ tiên chung, có quan hệ họ hàng chặt chẽ với nhau và các trình tự được bảo tồn cao [28]. Trong một nghiên cứu khác cũng vào năm 2011, một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các phương pháp tùy chỉnh để tập trung vào việc tổng hợp azurin từ các chủng P. aeruginosa khác nhau với sự đồng nhất rõ ràng. Họ đã sàng lọc sự phát triển của các chủng P.
aeruginosa khác nhau (1934, 741, 2453 và 1942) để tổng hợp azurin và tăng cường sản xuất azurin. Và cho thấy các đặc tính của azurin bằng cách sử dụng giải hấp thụ/ion hóa laser được hỗ trợ bởi ma trận, natri dodecyl sulfat điện di trên gel polyacrylamide và quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier. Kết quả cho thấy 2453 là chủng tiết ra nhiều azurin nhất và cho thấy sự chết rụng download by : skknchat@gmail.com 5 đáng kể ở các tế bào ung thư biểu mô vú như T-47D và ZR-75-1. Nghiên cứu này chứng minh các phương pháp tùy chỉnh để tổng hợp azurin từ các chủng P.
aeruginosa khác nhau với tính đồng nhất rõ ràng và tác động tự chết của chúng trên các tế bào ung thư biểu mô vú với các cơ chế phân tử có thể có và các loại oxy phản ứng [38]. Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Ý, đã báo cáo về hoạt động chống khối u của p28 (một đoạn peptid của azurin) phát sinh từ sự ổn định sau dịch mã của chất ức chế khối u p53 thường được điều chỉnh giảm bởi sự liên kết của một số ligase ubiquitin. Điều này đòi hỏi p28 phải liên kết đặc biệt với p53 để ức chế các ligase cụ thể bắt đầu phân hủy qua trung gian proteosome. Trong nghiên cứu này, quang phổ lực nguyên tử, một phương pháp tiếp cận công nghệ nano, được sử dụng để khảo sát tương tác của p28 với p53 có chiều dài đầy đủ và các miền cô lập của nó ở cấp độ phân tử đơn lẻ.
Phân tích các lực không liên kết và hằng số tốc độ phân ly cho thấy rằng p28 tạo thành một phức bền vững với vùng liên kết DNA của p53, ức chế sự liên kết của các ligase ubiquitin khác với Mdm2 để giảm sự phân hủy protein của p53 [39]. Nghiên cứu khác tại Bồ Đào Nha đã báo cáo rằng, azurin nhắm mục tiêu P- cadherin biểu hiện quá mức của bệnh ung thư vú, chống lại tác dụng xâm lấn của nó. P-cadherin biểu hiện quá mức xảy ra ở khoảng 30% của ung thư biểu mô tuyến vú đại diện cho một trong những loại ung thư vú nguy hiểm nhất [11]. Năm 2015, tại Đại học Calicut Ấn Độ đã thực hiện phân lập gen azurin sản xuất các chủng P.
aeruginosa bản địa và xác nhận sự hiện diện của nó bằng kỹ thuật phân tử. Trong số 10 mẫu được chọn cho nghiên cứu này, 8 mẫu cho thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể trong PCR gradient, khuếch đại một đoạn DNA 545 bp đơn đặc trưng của gen azurin. Tổng số protein tế bào chiết xuất được phân tích bằng điện di trên gel SDS- Polyacrylamide, có nhiều dải băng bao gồm một dải tương ứng với trọng lượng phân tử 14 KD trong tất cả 8 mẫu được chọn từ PCR [42]. Gần đây nhất vào năm 2018, Sarwar và Fahim tại Đại học BRAC đã tiến hành với 25 chủng phân lập trong môi trường (đất) mục đích là phân lập azurin sản xuất Pseudomonas spp bản download by : skknchat@gmail.com 6 địa cùng với việc xác nhận sự hiện diện của azurin bằng kỹ thuật phân tử.
Họ sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể (AZU-F và AZU-R) trong PCR gradient. Kết quả là trong số 25 chủng phân lập, 10 chủng cho thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách khuếch đại một đoạn DNA 545 bp duy nhất trong PCR. Việc phát hiện ra các chủng vi sinh vật sản xuất azurin có năng suất cao có thể dẫn chúng ta đến việc phát triển các loại thuốc chống ung thư [41]. Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam Nghiên cứu đầu tiên là của nhóm nghiên cứu vật lý lý thuyết, Đại học Tôn Đức Thắng thành phố Hồ Chí Minh đã đưa ra giả thuyết rằng vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đồng loại cư trú lâu dài trong cơ thể người có thể tạo ra protein giống azurin như một vũ khí chống lại sự xâm nhập của bệnh ung thư.
Trong nghiên cứu trước đây của họ, các vi khuẩn giả định đã được sàng lọc từ các bộ gen hoàn chỉnh của 66 loài vi khuẩn ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người và sau đó được đặc trưng bằng cách coi chúng như các thuật toán chú thích chức năng với azurin làm đối chứng. Họ đã dự đoán định tính 14 loại vi khuẩn giả định sở hữu các đặc tính chức năng rất giống với azurin. Trong công việc này, họ thực hiện một số phân tích định lượng và dựa trên cấu trúc bao gồm tính toán tỷ lệ phần trăm kỵ nước, mô hình cấu trúc, và nghiên cứu gắn kết phân tử về vi khuẩn quan tâm chống lại protein p53, một mục tiêu ung thư. Cuối cùng, họ đã xác định được 8 vi khuẩn giả định liên kết p53 theo cách tương tự như p28-azurin và azurin, trong đó 3 peptit (p1seq16, p2seq20 và p3seq24) được chỉ ra từ nghiên cứu trước đây của họ và 5 peptit mới (p1seq09, p2seq05, p2seq08, p3seq02 và p3seq17) được phát hiện lần đầu tiên [36].
Sau đó vào tháng 12 năm 2019, tác giả Nguyễn Duy cùng một nhóm nhà khoa học khác đã thực hiện một nghiên cứu khác với mục đích cải thiện quy trình sàng lọc và đánh giá tính đa dạng di truyền của gen azurin ở P. aeruginosa và gen giống azurin trong hệ vi sinh vật đường ruột của một quần thể cụ thể ở Việt Nam và quần thể toàn cầu. Kết quả là, nghiên cứu này đã tối ưu hóa thành công nhiệt độ ủ để khuếch đại DNA nhằm sàng lọc các gen azurin và áp dụng cho các gen giống azurin từ hệ vi sinh vật đường ruột của con người; là nghiên cứu đầu tiên phân loại gen azurin thành 5 kiểu gen khác download by : skknchat@gmail.com 7 nhau ở quy mô toàn cầu và xác nhận hoạt động chống ung thư tiềm năng của 3 protein tổng hợp giống azurin (Cnazu1, Dlazu11 và Ruazu12).