Khóa luận tốt nghiệp: Nguyễn văn tiệp nghiên cứu lên men tổng hợp kháng

Khóa luận nghiên cứu quy trình lên men tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 191 16, ứng dụng trong sản xuất dược phẩm hiện đại.

• Tác giả: Nguyễn Văn Tiệp
• Người hướng dẫn: PGS. Cao Văn Thu
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Nguyễn Văn Tiệp Nghiên Cứu Lên Men Tổng Hợp Kháng Sinh Nhờ Streptomyces 191.16 Khóa Luận Tốt Nghiệp Dược Sĩ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 191

Lên men tổng hợp kháng sinh là quá trình sinh học quan trọng trong nghiên cứu của Nguyễn Văn Tiệp tại Trường Đại học Dược Hà Nội. Đây là phương pháp sử dụng Streptomyces 191.16, một loài xạ khuẩn có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh hiệu quả. Quá trình này liên quan đến việc nuôi cấy vi sinh vật trong các điều kiện tối ưu để tối đa hóa sản lượng kháng sinh. Xạ khuẩn Streptomyces là những vi khuẩn hình sợi, phổ biến trong đất và đặc biệt là trong môi trường biển, có khả năng tổng hợp nhiều loại kháng sinh có giá trị y tế cao. Khóa luận của Nguyễn Văn Tiệp đã tập trung vào việc tìm hiểu chi tiết về cơ chế lên men sinh tổng hợp để nâng cao hiệu quả sản xuất kháng sinh từ chủng vi khuẩn này.

1.1. Đặc điểm của Streptomyces 191.16 và ứng dụng trong y học

Streptomyces 191.16 là một chủng xạ khuẩn biển có đặc điểm hình thái và sinh lý độc đáo. Chủng này được phân lập và có khả năng sản xuất kháng sinh kháng khuẩn mạnh mẽ. Đặc điểm nổi bật của Streptomyces parvus (loài liên quan) bao gồm khả năng chống ung thư và hoạt tính kháng khuẩn rộng. Ứng dụng trong lâm sàng rất tiềm năng, đặc biệt trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn kháng thuốc và một số bệnh ung thư.

1.2. Vai trò của lên men trong tổng hợp kháng sinh

Lên men bề mặt và lên men chìm là hai phương pháp chính trong quá trình tổng hợp kháng sinh. Phương pháp lên men chìm được Nguyễn Văn Tiệp sử dụng để tối ưu hóa sản lượng kháng sinh từ Streptomyces 191.16. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi cấy đều ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất sản xuất kháng sinh, yêu cầu kiểm soát chính xác trong quá trình lên men.

II. Phương pháp nghiên cứu và cải tạo giống trong khóa luận của Nguyễn Văn Tiệp

Khóa luận của Nguyễn Văn Tiệp tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học sử dụng các phương pháp cải tạo giống hiện đại để nâng cao khả năng sản xuất kháng sinh của Streptomyces 191.16. Quá trình cải tạo và chọn giống bao gồm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến UV và đột biến hóa học. Các phương pháp này nhằm tạo ra các biến chủng có khả năng sản xuất kháng sinh cao hơn so với chủng ban đầu. Việc bảo quản giống vi sinh vật theo phương pháp ống thạch nghiêng đảm bảo tính ổn định và khả năng sản sinh của chủng. Bên cạnh đó, khóa luận cũng sử dụng giải trình tự gen 16S rADN để xác định chính xác loài vi sinh vật và phân loại theo chuẩn ISP.

2.1. Sàng lọc và đột biến cải tạo giống Streptomyces 191.16

Quá trình sàng lọc ngẫu nhiên là bước đầu tiên trong cải tạo giống để tìm các biến chủng có hiệu suất cao. Đột biến UV và đột biến hóa học được áp dụng để tạo ra các biến thể mới với khả năng sản xuất kháng sinh tăng cường. Các chủng đột biến được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán để xác định hoạt tính kháng sinh. Kết quả cho thấy các biến chủng đột biến có thể vượt trội hơn chủng gốc.

2.2. Nuôi cấy và bảo quản giống trong quá trình nghiên cứu

Bảo quản giống sử dụng phương pháp ống thạch nghiêng là phương pháp hiệu quả, đơn giản và tiết kiệm chi phí. Việc xác định đặc điểm hình thái chủng Streptomyces 191 theo chuẩn phân loại ISP giúp đảm bảo tính chính xác. Bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nộ đã cung cấp các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình thực hiện khóa luận này.

III. Quy trình lên men tổng hợp và tinh chế kháng sinh

Quy trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh trong khóa luận của Nguyễn Văn Tiệp bao gồm nhiều bước quan trọng từ chuẩn bị đến tinh chế sản phẩm cuối cùng. Lên men chìm được thực hiện trong các điều kiện kiểm soát để tối ưu hóa sản lượng kháng sinh. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và thành phần môi trường được khảo sát chi tiết để xác định điều kiện tốt nhất. Sau khi hoàn thành lên men, dịch lên men được xử lý để tách kháng sinh bằng các phương pháp sắc ký. Tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giúp phân lập các hợp chất kháng sinh tinh khiết từ hỗn hợp phức tạp.

3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính kháng sinh

Nhiệt độ và pH là những yếu tố quyết định ảnh hưởng đến độ bền hoạt tính kháng sinh trong quá trình lên men tổng hợp. Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tiệp chỉ ra rằng các chủng xạ khuẩn phát triển tối ưu trong khoảng nhiệt độ và pH nhất định. Việc đánh giá ảnh hưởng của những yếu tố này giúp xác định điều kiện nuôi cấy lý tưởng để đạt sản lượng kháng sinh cao nhất.

3.2. Chiết xuất và tinh chế kháng sinh tinh khiết

Chọn dung môi hữu cơ thích hợp là bước quan trọng trong quá trình chiết xuất kháng sinh từ dịch lên men. Sắc ký cột được thực hiện nhiều lần để đạt kháng sinh tinh khiết cao độ. Kết quả tinh chế kháng sinh cho thấy khả năng cô lập được các hợp chất kháng sinh có hoạt tính sinh học cao từ chủng Streptomyces 191.16.

IV. Xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính của kháng sinh tinh khiết

Xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được từ Streptomyces 191.16 là phần kết quả quan trọng của khóa luận. Nguyễn Văn Tiệp sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại để xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh KS2. Phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) và phổ hồng ngoại (IR) được áp dụng để phân tích cấu trúc chi tiết. Các kết quả phân tích giúp xác định nhóm chức năng, liên kết phân tử và cấu trúc ba chiều của kháng sinh. Hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm tinh khiết được đánh giá và so sánh với các kháng sinh phân lập từ các chủng Streptomyces khác để đánh giá giá trị y tế.

4.1. Các kỹ thuật phổ học trong xác định cấu trúc kháng sinh

Phổ khối lượng (MS) xác định khối lượng phân tử chính xác của kháng sinh tinh khiết. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cung cấp thông tin về các nhân hydro và carbon trong phân tử, bao gồm COSY, DEPT, HSQC, và HMBC. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) cho phép xác định các nhóm chức năng chứa đôi liên kết. Phổ hồng ngoại (IR) giúp nhận dạng các liên kết hóa học đặc trưng như C=O, C=C, N-H.

4.2. Hoạt tính kháng khuẩn và ứng dụng lâm sàng tiềm năng

Hoạt tính kháng sinh của kháng sinh KS2 được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán và so sánh với các kháng sinh phân lập từ các chủng Streptomyces khác. Kết quả cho thấy kháng sinh từ Streptomyces 191.16 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ. Đặc biệt, Streptomyces parvus và các biến chủng liên quan cho thấy tiềm năng chống ung thư. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho phát triển thuốc mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Xạ khuẩn sản xuất một số lượng lớn các sản phẩm tự nhiên với các hoạt tính sinh học khác nhau, đặc biệt là kháng sinh. Trong đó, chi Streptomyces là một đại diện nổi bật bởi số lượng lớn nhất của các loài và giống, khác nhau rất nhiều về hình thái, sinh lý học và khả năng sinh kháng sinh đặc biệt của chúng. So với các chủng từ mặt đất, Streptomyces có nguồn gốc từ biển phần lớn chưa được khám phá và là nguồn quan trọng để khám phá kháng sinh mới [20]. Trong bối cảnh hiện nay, việc sử dụng kháng sinh không theo chỉ định dẫn đến ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc.

Việt Nam và nhiều nước trên thế giới đang phải đối mặt với những bệnh nhiễm khuẩn mới và bệnh do tác nhân kháng thuốc gây ra.Vì vậy, việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là các loại được sản xuất từ các chủng xạ khuẩn biển. Từ vài thập kỷ trở lại đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư,…có ý nghĩa ứng dụng trong y học. Có những hợp chất có cơ chế hoạt động độc đáo, có cấu trúc mới lạ so với các sinh vật trên cạn [18,21]. Xuất phát từ những thực tế trên, từ một chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ven biển trên đảo Cát Bà, Việt Nam, tôi đã thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 191.16” với các mục tiêu sau: ♦ Xác định đặc điểm hình thái, phân loại xạ khuẩn nghiên cứu.

♦ Nghiên cứu cải tạo chủng xạ khuẩn ban đầu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. ♦ Xác định môi trường lên men thích hợp, dung môi chiết xuất tốt nhất và tinh chế kháng sinh. ♦ Xác định sơ bộ đặc điểm cấu trúc của chất kháng sinh tổng hợp được. 1 CHƢƠNG 1: TÔNG QUAN 1.

Đại cƣơng về xạ khuẩn Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) , phát triển thành dạng sợi phân nhánh, có tỷ lệ G + C >55%, phân bố rộng rãi trong thiên nhiên (trong đất, nước và các cơ chất hữu cơ), trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng.

Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc đặc thù, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có nếp gấp tạo các đường tròn đồng tâm hay các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng. Xạ khuẩn sinh sản nhờ bào tử: họ Streptomycetaceae phát triển hệ chuỗi bào tử, xạ khuẩn họ Actinoplanaceae có thể tạo ra các bào tử có khả năng di động, xạ khuẩn thuộc họ Actinomycetaceae có hệ sợi phát triển một thời gian thì phân cắt thành các bào tử hình cầu hoặc ellipsoid.

Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Xạ khuẩn chi Streptomyces thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, Gram (+), không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0.

Thành tế bào chứa L- DAP, không chứa acid mycolic. Tỷ lệ mol G + C trong ADN là 69-78%. Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử.

Các 2 khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ. Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau có khả năng khuếch tán ra môi trường. Trong môi trường đặc hiệu, có loài có thể tạo ra sắc tố melanoid màu sẫm đen. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh.

Phân loại Streptomyces Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự 16S rADN, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Để phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae, khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế (International Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) được sử dụng rộng rãi. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon. Ngày nay, với việc áp dụng kĩ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại đã và đang được áp dụng.

Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy. Tổng quan nghiên cứu kháng sinh từ xạ khuẩn biển 1. Xu hướng nghiên cứu xạ khuẩn biển Xạ khuẩn, đặc biệt từ các nguồn trên cạn, đã là trọng tâm của nghiên cứu chuyên sâu cho nhiều năm qua vì chúng sản xuất các hợp chất sinh học đa dạng và quan trọng. Tuy nhiên, phần lớn xạ khuẩn phân bố ở biển là chưa được khám phá.

Xạ khuẩn biển có thể phân lập từ bùn, đất, nước, trầm tích, rong biển…[20,21] Nghiên cứu các hợp chất được tổng hợp từ xạ khuẩn biển đã thu được những kết quả đáng kể. Theo nghiên cứu tổng quan Marine natural products thực hiện năm 2017, các năm từ 2010 đến 2012, trung bình mỗi năm có 115 chất mới được phát hiện từ xạ khuẩn biển, con số này với năm 2013 và 2016 là 161 và 179 chất. Chi Streptomyces là vẫn là một đại diện tiêu biểu, cung cấp những chất mới có hoạt tính sinh học mạnh có thể phát triển thành thuốc trong tương lai [21]. Các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư.

Từ năm 2005-2009, có tổng số 35 chất chuyển hóa chống ung thư được phân lập từ xạ khuẩn biển ở những 3 nơi khác nhau. Những chất này đã được chứng minh có thể tổng hợp ra những chất khác có hoạt tính chống ung thư dựa vào chất ban đầu. Trong số các xạ khuẩn biển phân lập được hợp chất chống ung thư, chi Streptomyces đóng góp tới 57% [20]. Nghiên cứu sản phẩm tự nhiên liên quan đến các xạ khuẩn biển kì vọng sẽ đạt được thành công cao trong việc khám phá các sản phẩm hữu ích.

Các xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển hứa hẹn cho việc cung cấp thuốc chống ung thư hiệu quả, rẻ hơn và an toàn hơn. Kháng sinh tạo ra bởi Streptomyces từ biển [9,20,21] Hiện tại, nhiều kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces có nguồn gốc từ biển đã xác định được cấu trúc và hoạt tính kháng sinh cụ thể, các kháng sinh này được chia thành các nhóm dựa vào cấu trúc: - Nhóm chất kháng sinh polyketide - Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide - Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide - Nhóm kháng sinh isoprenoid - Các chất kháng sinh khác Trong số các tác nhân chống ung thư thu được từ nguồn xạ khuẩn biển. Các Polyketide chiếm tỉ lệ lớn so với các nhóm khác. Một số kháng sinh cụ thể của các nhóm, phân lập được từ xạ khuẩn biển thuộc chi Streptomyces được trình bày trong bảng 1.

Một số kháng sinh tạo bởi Streptomyces từ biển Nhóm Chất kháng sinh Xạ khuẩn Hoạt tính Streptomyces sp. Nonactin Kháng tế bào ung thư KORDI3238 Streptomyces sp. Kháng nấm, kháng tế Daryamide CNQ 085 bào ung thư Polyketide Streptomyces sp. Actinofuranone A (B) Kháng tế bào ung thư CNQ766 Kháng khuẩn, kháng Streptomyces sp.

Trioxacarcin ung thư, kháng trùng B8652 sốt rét. Piperazimycin Kháng tế bào ung thư Non ribosomal CNQ 593 peptide S. arenicola Arenamide Kháng tế bào ung thư CNT088 Salinosporamide A Phức hợp S. tropica Kháng tế bào ung thư (NPI0052) polyketide và Non ribosomal S.

nodosus Kháng tế bào ung thư, Lajollamycin peptide NPS007994 kháng khuẩn S. sioyaensis Altemicidin Kháng tế bào ung thư SA1758 Streptomyces sp. Isoprenoid TMuurolol Kháng tế bào ung thư M491 Streptomyces sp. Glaciapyrrole Kháng khuẩn NPS8187 Streptomyces sp.

Caboxamycin Kháng tế bào ung thư NTK937 Các chất S.luteoverticillatum kháng sinh Butenolide Kháng tế bào ung thư khác 11014 Frigocyclinone S. griseus Kháng khuẩn 1. Bảo quản và cải tạo giống 1. Bảo quản giống xạ khuẩn Việc giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể duy trì những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính.

Một số phương pháp giữ giống: ♦ Bảo quản trên môi trường thạch: các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 20C, định kì kiểm tra cấy truyền. ♦ Giữ giống trong cát hoặc trong đất sét vô trùng: Cát và đất sét là những cơ chất tốt mang các tế bào VSV, chủ yếu là nhóm VSV có bào tử. Cát và đất sau khi được xử lý sạch, sàng lọc qua rây, xử lý pH trung tính, sấy khô và khử trùng. Sau đó trộn bào tử vào cơ chất cát hoặc đất sét trong các ống nghiệm.

Nút bông có phết một lớp parafin nóng chảy để ống giống không bị ẩm trở lại. ♦ Giữ giống bằng phương pháp đông lạnh: phương pháp dựa trên sự ức chế phát triển của VSV khi được đưa vào điều kiện lạnh sâu ở -250C đến -700C. Với phương pháp này giống sẽ bảo quản được lâu. 5 ♦ Giữ giống bằng phương pháp đông khô: phần nước ở trong tế bào và môi trường có chất bảo vệ được thăng hoa ở nhiệt độ thấp để đảm bảo an toàn hơn cho sự sống của tế bào giống.

Hỗn hợp tế bào giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong các ampul được hàn kín bảo vệ ở 3-50C hoặc nhiệt độ phòng. Phương pháp cải tạo giống Vi sinh vật tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính rất thấp. Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao cần phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau.