Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Nguyễn văn huân tổng hợp và thử độc tính tế bào

Khóa luận nghiên cứu tổng hợp và đánh giá độc tính tế bào của dẫn chất N-hydroxypropenamid chứa khung benzyltriazol hướng ức chế histon deacetylase.

• Tác giả: Nguyễn Văn Huân
• Người hướng dẫn: Đỗ Thị Mai Dung
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nguyễn Văn Huân tổng hợp và thử độc tính tế bào của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung 1-((1-benzyltriazol-4-yl)methyl)-3-(methoxyimino)indolin-2-on hướng ức chế histon deacetylase
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Nguyễn Văn Huân Tổng Hợp và Thử Độc

Nguyễn Văn Huân tổng hợp và thử độc là một khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội vào năm 2018. Đề tài nghiên cứu tập trung vào việc tổng hợp hóa học và thử độc tính tế bào của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung indolin-2-on. Mục tiêu chính là phát triển các chất ức chế histon deacetylase (HDAC) có tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư. Nghiên cứu được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Phan Thị Phương Dung và NCS. Đỗ Thị Mai Dung tại Bộ môn Hóa Dược. Công trình này đại diện cho một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa dược và phát triển thuốc mới tại Việt Nam.

1.1. Mục Tiêu Nghiên Cứu Chính

Mục tiêu chính của khóa luận Nguyễn Văn Huân là tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn chất mang vòng 1,2,3-triazol. Những hợp chất này được thiết kế nhằm ức chế hiệu quả histon deacetylase, một enzyme quan trọng trong điều trị ung thư. Nghiên cứu cũng kiểm tra độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như A549, HCT116 và HepG2, đánh giá tiềm năng kháng ung thư của các hợp chất.

1.2. Phương Pháp Tiếp Cận

Phương pháp nghiên cứu kết hợp hóa học click và tổng hợp hóa học hiện đại để tạo ra các dẫn chất mới. Các hợp chất được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ học như 1H-NMR, 13C-NMR và MS. Thử hoạt tính sinh học được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư in vitro.

II. Histon Deacetylase và Chất Ức Chế HDAC

Histon deacetylase (HDAC) là những enzyme quan trọng điều chỉnh cấu trúc chromatin và biểu hiện gen. Các chất ức chế HDAC có vai trò quan trọng trong điều trị ung thư bằng cách tái kích hoạt các gen bị im lặng và cảm ứng chết apoptosis trong tế bào ung thư. Nghiên cứu của Nguyễn Văn Huân tập trung vào việc phát triển các ức chế HDAC hiệu quả và an toàn. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid được thiết kế với các tính chất dược học tối ưu. Công trình này tuân theo các nguyên tắc thiết kế thuốc hiện đại, kết hợp các nhóm chức năng khác nhau để tăng hiệu lực ức chế enzyme. Việc sử dụng vòng triazol trong cấu trúc giúp cải thiện các tính chất về dược động học và sinh học của các hợp chất.

2.1. Cơ Chế Hoạt Động Của HDAC

HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ histon, làm thắt chặt cấu trúc DNA và ngăn chặn biểu hiện gen. Khi ức chế HDAC, acetylation histon tăng, dẫn đến giãn nới chromatin và bật mở các gene khống chế ung thư. Điều này gây ra apoptosis và dừng phân chia tế bào ung thư, tạo nên hiệu ứng kháng ung thư mạnh mẽ.

2.2. Thiết Kế Dẫn Chất Ức Chế

Các dẫn chất tổng hợp trong nghiên cứu được thiết kế với nhóm liên kết (linker), nhóm nhận diện bề mặt (SRG) mang vòng triazol, và nhóm chelate N-hydroxypropenamid. Cấu trúc này cho phép tương tác tối ưu với khe ức chế HDAC, tăng độ bền và tính chọn lọc của chất ức chế.

III. Tổng Hợp Hóa Học và Vòng Triazol

Tổng hợp hóa học các dẫn chất trong nghiên cứu Nguyễn Văn Huân sử dụng hóa học click, đặc biệt là phản ứng cycloaddition azide-alkyne được xúc tác bằng đồng (CuAAC). Phương pháp này cho phép tổng hợp hiệu quả các hợp chất mang vòng 1,2,3-triazol với độ tinh khiết cao. Vòng triazol không chỉ hoạt động như một nhóm nhận diện bề mặt giúp tương tác với protein mà còn cải thiện các tính chất vật lý hóa học của dẫn chất. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid được điều chế qua nhiều bước tổng hợp có kiểm soát, với mỗi trung gian được xác định cấu trúc kỹ lưỡng. Hiệu suất tổng hợp được tối ưu hóa thông qua các biến đổi điều kiện phản ứng. Cuối cùng, các sản phẩm tối终 được tinh chế bằng sắc ký cột và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lỏng cao cấp (HPLC).

3.1. Hóa Học Click và Cycloaddition

Hóa học click là một phương pháp tổng hợp hữu cơ hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong hóa dược. Phản ứng cycloaddition azide-alkyne xúc tác bằng đồng tạo ra vòng 1,2,3-triazol với hiệu suất cao. Phương pháp này có ưu điểm là chọn lọc cao, cho phép sử dụng nhiều nhóm chức năng khác nhau và điều kiện phản ứng nhẹ.

3.2. Xác Định Cấu Trúc Sản Phẩm

Các hợp chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng 1H-NMR, 13C-NMR, khối phổ (MS) và hồng ngoại (IR). Dữ liệu phổ học xác nhận sự hiện diện của vòng triazol và các nhóm chức năng mong muốn, đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm.

IV. Thử Độc Tính Tế Bào và Hoạt Tính Sinh Học

Thử độc tính tế bào là phần quan trọng của nghiên cứu Nguyễn Văn Huân, đánh giá hiệu lực kháng ung thư của các dẫn chất tổng hợp. Các hợp chất được kiểm tra trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm A549 (ung thư phổi), HCT116 (ung thư ruột kết), HepG2 (ung thư gan) và PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt). Phương pháp thử hoạt tính sinh học sử dụng các kỹ thuật in vitro tiêu chuẩn để đánh giá độc tính và giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%). Các kết quả hoạt tính cho thấy một số dẫn chất có hoạt tính ức chế HDAC mạnh mẽ và độc tính tế bào đáng kể. Thử ức chế enzyme HDAC được tiến hành để xác định cơ chế tác dụng của các hợp chất. Công trình cung cấp những dữ liệu hoạt tính quý giá cho sự phát triển các ức chế HDAC tiếp theo.

4.1. Phương Pháp Thử Hoạt Tính

Thử hoạt tính sinh học sử dụng các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy theo tiêu chuẩn in vitro. Các hợp chất được thêm với nồng độ khác nhau, và độc tính tế bào được đánh giá bằng các phương pháp MTT hoặc xác định viability. Giá trị IC50 được tính toán từ đường cong nồng độ-phản ứng, cho biết hiệu lực ức chế của mỗi dẫn chất.

4.2. Kết Quả Và Ý Nghĩa Lâm Sàng

Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều dẫn chất có hoạt tính ức chế HDAC và kháng ung thư tốt. Những phát hiện này đánh giá tiềm năng của các hợp chất làm ứng cử viên thuốc mới. Công trình mở đường cho nghiên cứu tiền lâm sàng và phát triển các ức chế HDAC thế hệ mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, những nghiên cứu sinh lý học về ung thư đã giúp định hướng tìm ra đích tác dụng của nhiều thuốc điều trị ung thư, bao gồm nhiều đích là enzym đóng vai trò quan trọng trong điều hoà chu trình sinh trưởng, phát triển tế bào như các protein kinase, HDAC, HAT. Trong đó, tổng hợp các chất ức chế enzym HDAC đang là hướng tiếp cận tạo ra các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. SAHA (Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da. Sau đó, lần lượt romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép điều trị một số bệnh ung thư.

Theo định hướng này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất là dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư. Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả khả quan khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động. Nhiều dẫn chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần [1], [26-27]. Kết quả trên cho thấy khi nhóm nhận diện bề mặt của của các acid hydroxamic là dị vòng thơm thì hoạt tính in vitro rất khả quan.

Ngoài ra, một số nghiên cứu [7] cho thấy khi thay cầu nối mạch thẳng của acid hydroxamic bằng cầu nối chứa nhân thơm mang lại hoạt tính kháng tế bào ung thư cao hơn và có xu hướng ức chế chọn lọc trên một số dòng HDAC. Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử độc tính tế bào của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung 1-((1- benzyltriazol-4-yl)methyl)-3-(methoxyimino)indolin-2-on hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp (2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid và 5 dẫn chất. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.

HISTON DEACETYLASE (HDAC) VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1. Tổng quan về histon deacetylase (HDAC) 1. Giới thiệu sơ lược về histon deacetylase (HDAC) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST) đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [3], [11]. Sự điều hoà biểu hiện của gen có sự tham gia của các enzym: kinase, methyltransferase, histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC).

Các enzym này tác động lên phần đuôi histon của nhiễm sắc thể (NST) [17]. Vai trò của HAT và HDAC trong quá trình biểu hiện gen Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ hai enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra [15]. Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã [14] (hình 1.

HDAC được khẳng định không chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà sự biểu hiện quá mức của HDAC còn tác động đến tiến trình ung thư, bao gồm sự hình thành của các khối u ác tính [41]. Trên thực tế trong điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư biểu mô thận, ung thư biểu mô vảy ở đầu và cổ, u trung biểu mô, u tế bào lympho… một số liệu pháp ức chế enzym HDAC đã mang lại hiệu quả cao. Phân loại các HDAC Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm [8-9]: - Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8. - Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10.

- Nhóm III: Sirtuin 1-7. - Nhóm IV: HDAC-11. Nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic.

Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động phụ thuộc vào NAD+ [16]. Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC Việc xác định cấu trúc của phân tử HDAC nói chung và cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC là vô cùng quan trọng trong việc tìm hiểu về cơ chế tác dụng và dựa trên cơ sở đó để thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC. Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và nhiễu xạ tia X, người ta xác định được cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC khác nhau. Nhìn chung, các cấu trúc trung tâm hoạt động của chúng đều tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính là ion Zn2+ và kênh enzym: + Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí.

Ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết cho – nhận với các acid amin và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [35]. Các acid hydroxamic ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên tử oxy của nó (xem hình 1. + Kênh enzym được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His.

Nó có dạng có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất. Cấu trúc của túi vô cùng linh động có thể biến đổi sao cho phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Miệng túi có một vài vòng xoắn protein có vai trò tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC. 3 Đáy túi có một số phân tử nước có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo liên kết hydro khi không có -OH của tyrosin [35].

Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic 1. Phân loại và cấu trúc các chất ức chế HDAC 1. Phân loại các chất ức chế HDAC HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, chu trình biệt hóa, chu trình chết theo chương trình [15]. Do vậy, các chất ức chế HDAC trở thành một mục tiêu tiềm năng của các nhà khoa học trong việc tìm ra các hợp chất kháng ung thư mới.

Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm [8], [31], [40] (xem hình 1. + Các acid carboxylic mạch ngắn. + Các phân tử lai. Mỗi nhóm chất ức chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid hydroxamic bị nhanh thải trừ, tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc nhưng có ưu điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản [9], [18].

Năm 1990, Yoshida và cộng sự đã tìm ra trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC [9]. Cho đến thời điểm này, FDA đã cấp phép lưu hành trên thị trường 3 thuốc kháng tế bào ung thư dựa trên cơ chế ức chế enzym HDAC, bao gồm: vorinostat (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015). Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc hóa học 1. Cấu trúc các chất ức chế HDAC Từ các nghiên cứu về cấu trúc enzym HDAC và dựa trên cấu trúc của SAHA, các chất ức chế HDAC thường được thiết kế gồm 3 phần chính [13] (xem hình 1.4): - Nhóm nhận diện bề mặt (SRG) hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động (Capping group): thường là các vòng thơm hoặc peptid vòng, tham gia vào quá trình nhận diện bề mặt amino acid của enzym.

- Vùng cầu nối sơ nước (Linker): thường là các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có chức năng tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, giúp cơ chất nằm trong kênh và tương tác với các thành phần nằm trên kênh. - Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton. Nhóm kết thúc gắn với kẽm tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC [13]. Cấu trúc của SAHA ứng với cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC 1.

Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC 1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của các chất ức chế HDAC. Nghiên cứu của Di Micco S. và cộng sự [10] đã chỉ ra rằng các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidin - hình 1.5) có khả năng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I.

O O O O N HN OH NH HN O O NH HN O O NH HN O N O Apicidin O Azumamid E Hình 1. Cấu trúc apicidin và azumamid E Cũng theo nghiên cứu trên, các hợp chất cyclopeptid với vai trò là nhóm khoá hoạt động cần một khoảng không gian lớn trong enzym để tạo tương tác. Các HDAC nhóm I có chứa một túi ở bề mặt với đường kính phù hợp để các hợp chất vòng lớn có thể vào và tạo liên kết giữa các chất ức chế HDAC với enzym khá bền vững. Nhưng với các HDAC nhóm II, bề mặt enzym lại chứa các phân tử cồng kềnh, khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn [10].

Trong một nghiên cứu được công bố vào năm 2006 của nhóm tác giả Juvale [19] cho thấy, sự có mặt của nhóm phenyl hay thêm một nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl trong nhóm nhận diện bề mặt sẽ góp phần làm tăng hoạt tính. Tuy nhiên, khi có nhóm thế sát nhóm acid hydroxamic thì gây ảnh hưởng ngược lại. Tương tự nhóm phenyl, các nhóm chức và phần cấu trúc có mật độ electron tập trung cao ở nhóm nhận diện bề mặt đều góp phần làm tăng hoạt tính. Những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kỵ nước thì có hoạt tính yếu [36].