ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [29]. Có nhiều hƣớng điều trị đã đƣợc sử dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp ngoại khoa,., tuy nhiên kết quả vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều này thôi thúc các nhà khoa học luôn luôn cố gắng tìm ra các phƣơng pháp và các loại thuốc mới, có cả nguồn gốc hóa dƣợc và dƣợc liệu, để chống lại căn bệnh này. Tại Việt Nam, các thuốc điều trị ung thƣ cũng đang rất đƣợc quan tâm và phát triển, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu.
Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả quyết định nghiên cứu phân đoạn giàu cleisindosid D và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ.
Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phân đoạn có tác dụng hóa trị liệu ung thƣ này, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các hợp chất có mặt trong cao cồn trên. Chính vì vậy, tôi tiến hành đề tài: “ Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan trong nguyên li ệu thiết lập chất chuẩn cleisindosid D đƣợc phân lập từ quả của cây Chà chôi ” với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleisindosid D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Vị trí phân loại Cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đƣợc phân loại nhƣ sau: [24] Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Chi Cách hoa (Cleistanthus) Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu Dầu (Ba mảnh vỏ, Đại Kích) – Euphorbiaceae, là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài, đƣợc chia thành 5 phân họ bao gồm 3 phân họ một lá mầm (Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae) và 2 phân họ hai lá mầm (gồm Oldfieldioideae và Phyllanthoideae) [20]. Phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt [2][3]. Cây rất đa dạng, gồm cây bụi, cây gỗ, cây cỏ hay dây leo; thƣờng có mủ trắng hoặc trong; gốc lá có thể có 2 tuyến mật (ngoài hoa); có lá kèm hay không; hoa đơn tính; bầu dƣới 3 ô; quả nang mở bằng 3 mảnh vỏ; hạt thƣờng có mồng [2]. Chi Cách hoa (Cleistanthus) Cleistanthus, tên Tiếng Việt là Cách hoa hoặc Cọc rào (cleisto: đóng, không mở và anthos: hoa kết hợp thành).
Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, 2 nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4 – 6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên.
Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng – 3 góc. [5][6] Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia.
Ở nƣớc ta, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc và một số loài đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong dân gian với nhiều mục đích khác nhau. Loài Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. 1: Tiêu bản khô và hình ảnh hoa, quả của loài Cleistanthus tonkinensis Jabl. Đặc điểm thực vật Loài Cleistanthus tonkinensis Jabl.
có tên Tiếng Việt là Chà chôi (hoặc Cọc rào), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: - Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen. - Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. - Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. - Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.
3 Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh. Thành phần hóa học Đến nay, đã có 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan đƣợc phân lập từ quả của cây Chà chôi trong đó có hợp chất cleisindosid D. Hoạt tính sinh học Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hòa Pháp) đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật Việt Nam, trong đó có cây Chà Chôi, về hoạt tính kháng ung thƣ trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô lên tới 88,40 - 95,17%.
Các nghiên cứu về chi Cleistanthus Đã có một số nghiên cứu về các hoạt chất nhóm lignan đƣợc chiết xuất ra từ một số cây thuộc chi Cleistanthus, đặc biệt là các dẫn xuất của podophyllotoxin đƣợc chiết xuất từ cây Cleistanthus boinivianus. Các chất đƣợc phân lập đã đƣợc xác định cấu trúc, sau đó đƣợc thử nghiệm lâm sàng và cho thấy kết quả khả quan trên tế bào ung thƣ buồng trứng A2780, trong đó chất 3α-O-(β-D-glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin, là một trong những chất mới đƣợc phân lập, cho khả năng ức chế tế bào A2780 mạnh nhất với trị số IC50 khoảng 33,0 ± 3,6. [18] Ngoài ra, các hoạt chất Cleistanthins A và B đƣợc chiết xuất từ cây Cleistanthus collinus cũng đã đƣợc đem thử nghiệm và cho thấy tác dụng làm giảm huyết áp, và tác dụng này phụ thuộc vào liều dùng. Cả 2 hoạt chất này đều làm giảm tác dụng của epinephrin, norepinephrin và thụ thể α-1 của dopamin.
Cùng với đó, Cleistanthins B cũng làm giảm tác dụng của acetylcholin lên huyết áp trung bình [21]. Pratheepa cùng các cộng sự đã công bố tìm kiếm đƣợc hoạt chất mới là 4 dioctyl phthalat có mặt trong dịch chiết aceton của cây Cleistanthus collinus. Hoạt chất này liên kết với protein 53, là một loại protein ngăn ngừa ung thƣ, nên nó cũng đƣợc coi nhƣ là 1 chất ngăn ngừa ung thƣ. [22] Từ đó, các nhà khoa học tiến hành chiết xuất và tìm kiếm sự có mặt của các hoạt chất này trong các loài thuộc chi Cleistanthus.
Tuy nhiên, theo các nhà khoa học, ngoài cây C. boinivianus, chỉ 5 trong hơn 140 loài xuất hiện nhóm các hoạt chất này, gồm có: C. [18] Tại Việt Nam, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động từ năm 2009. Dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô và dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô đạt từ 88,40 - 95,17%.
Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó có hoạt chất cleisindosid D có cấu trúc hóa học tƣơng tự etoposid và teniposid, là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Hợp chất cleisindosid D Danh pháp IUPAC: (9R)-5-(benzol[d][1,3]dioxol-5-yl)-10-methoxy-9-(((2R,3R,5S,6R)-3,4,5- trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-5,8,8a,9- tetrahydrofuro[3’,4’,6,7]naphtho[2,3-d][1,3]dioxol-6(5aH)-one. Công thức phân tử: C26H28 O13 Khối lượng phân tử: 369,0 Da Công thức cấu tạo: 5 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo cleisindosid D Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng.
Tan tốt trong dicloromethan, aceton, methanol và acetonitril, kém tan trong nƣớc. Tổng quan về chất chuẩn 1. Khái niệm chất chuẩn Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với các tính chất của chất cần thử.
Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. [1][14][16][28] Chất chuẩn đƣợc dùng trong các phép thử sau: (1) Định tính bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. (2) Định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang. (3) Các phép thử định tính tạp chất và định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký.
(4) Định lƣợng bằng phƣơng pháp vi sinh vật. (5) Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lƣợng. (6) Các phép thử sinh học. (7) Một số phép thử khác h ycó hƣớng dẫn trong các chuyên luận riêng.
Phân loại chất chuẩn 1. Chất chuẩn gốc (Primary Chemical Reference Substances – PCRS) Chất chuẩn gốc là chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi, có chất lƣợng phù hợp với những mục đích sử dụng cụ thể, trong những hoàn cảnh cụ thể mà không cần phải so sánh với chất hoá học khác. Chất chuẩn thứ cấp (Secondary Chemical Reference Substances – SCRS) Chất chuẩn thứ cấp là chất chuẩn có giá trị đƣợc xác định hoặc hiệu chuẩn bằng cách so sánh với chuẩn gốc của cùng một đại lƣợng. [13][23][27] Một số chuẩn thứ cấp nhƣ: chuẩn ASEAN (ARS) [17], chuẩn Dƣợc điển Việt Nam, chuẩn làm việc, .
