Khóa luận tốt nghiệp Kỹ thuật: Nguyễn thanh xuân xây dựng phƣơng pháp định

Nghiên cứu phương pháp định tính định lượng tạp chất A trong nguyên liệu terazosin. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của Nguyễn Thanh Xuân.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Xuân
• Người hướng dẫn: NCS. Đỗ Thị Thanh Thủy
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Nguyên Liệu Tạp Chất A Của Terazosin
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Terazosin và Tạp chất A

Terazosin là một loại thuốc quan trọng trong điều trị bệnh tăng huyết áp và phì đại tuyến tiền liệt. Khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân tập trung vào việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng nguyên liệu tạp chất A của terazosin. Tạp chất A (IAT - Impurity A of terazosin) là một tạp chất chính được sinh ra trong quá trình sản xuất terazosin. Việc kiểm soát tạp chất này là hết sức cần thiết để đảm bảo chất lượng và an toàn của các chế phẩm dược học. Đề tài khóa luận này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương dưới sự hướng dẫn của NCS. Đỗ Thị Thanh Thủy. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị ứng dụng thực tiễn cao trong ngành dược phẩm Việt Nam.

1.1. Định nghĩa và tác dụng của Terazosin

Terazosin là một chất ức chế thụ thể alpha-1 adrenergic, được sử dụng chủ yếu trong điều trị tăng huyết áp và các triệu chứng của phì đại tuyến tiền liệt ở nam giới. Cơ chế tác dụng của terazosin giúp giãn cơ trơn mạch máu, từ đó làm giảm huyết áp và cải thiện dòng chảy nước tiểu. Các chế phẩm chứa terazosin hiện nay rất đa dạng trên thị trường dược phẩm, nhưng việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu là điều không thể bỏ qua.

1.2. Nhu cầu kiểm soát chất lượng nguyên liệu

Trong quá trình sản xuất terazosin, có thể phát sinh các tạp chất, trong đó tạp chất A là tạp chất chính cần được kiểm soát. Để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, các nhà sản xuất dược phẩm cần phải xác định chính xác hàm lượng tạp chất này. Khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân đã góp phần phát triển các phương pháp phân tích tin cậy để định tính và định lượng tạp chất A, giúp nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc trong nước.

II. Phương pháp Sắc ký lớp mỏng TLC trong Xác định Tạp chất A

Phương pháp TLC (Thin Layer Chromatography) là một trong những kỹ thuật sắc ký cơ bản và hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong phân tích hóa dược. Trong khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân, phương pháp TLC được xây dựng để định tính tạp chất A của terazosin một cách nhanh chóng và đơn giản. Ưu điểm của TLC là chi phí thấp, không cần thiết bị phức tạp, và có thể thực hiện được trong các phòng thí nghiệm có điều kiện cơ bản. Quá trình khảo sát các hệ pha động khác nhau giúp xác định điều kiện tối ưu để tách biệt terazosin và tạp chất A một cách hiệu quả, tạo nền tảng cho các phương pháp phân tích chính xác hơn.

2.1. Nguyên lý và ưu điểm của phương pháp TLC

Phương pháp TLC hoạt động dựa trên nguyên lý phân vân các thành phần trong hỗn hợp trên lớp mỏng chất hấp phụ. Các thành phần có độ hấp phụ khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, từ đó tách biệt các chất. TLC có ưu điểm là nhanh chóng, kinh tế, và dễ thực hiện so với các phương pháp khác. Trong xây dựng phương pháp của Nguyễn Thanh Xuân, TLC được chọn để định tính sự có mặt của tạp chất A trong nguyên liệu terazosin.

2.2. Quá trình khảo sát và tối ưu hóa hệ pha động

Để đạt được phương pháp TLC tối ưu nhất, khóa luận đã tiến hành khảo sát nhiều hệ pha động khác nhau. Các hệ dung môi được lựa chọn phải đảm bảo tách biệt rõ ràng giữa terazosin và tạp chất A, đồng thời giữ các thành phần trên bản TLC trong khoảng thích hợp. Kết quả khảo sát giúp xác định được hệ pha động phù hợp nhất, từ đó xây dựng phương pháp TLC định tính một cách chính xác và tin cậy.

III. Phương pháp HPLC để Định lượng Tạp chất A

Phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) hay sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tiên tiến, cho phép định lượng chính xác và định tính các thành phần trong mẫu. Trong khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân, phương pháp HPLC được xây dựng để không chỉ định tính mà còn định lượng hàm lượng tạp chất A của terazosin trong nguyên liệu. HPLC có độ nhạy cao, độ phân giải tốt, và có thể thẩm định theo các tiêu chuẩn quốc tế như USP, EP, BP. Quá trình xây dựng phương pháp bao gồm việc lựa chọn cột sắc ký, pha động, điều kiện nhiệt độ, và bước sóng phát hiện để đạt hiệu suất tối ưu.

3.1. Nguyên lý hoạt động của HPLC và ứng dụng

HPLC là phương pháp sắc ký lỏng có áp suất cao, cho phép tách biệt và định lượng các thành phần với độ chính xác cao. Hệ thống HPLC bao gồm bơm áp cao, cột sắc ký, detector, và hệ thống ghi dữ liệu. Trong xây dựng phương pháp định lượng tạp chất A, HPLC cho phép xác định hàm lượng tạp chất một cách định lượng, chính xác đến ppm (parts per million), giúp đảm bảo chất lượng nguyên liệu terazosin.

3.2. Thẩm định phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn quốc tế

Phương pháp HPLC được phát triển trong khóa luận phải tuân thủ các tiêu chuẩn thẩm định như tính thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ ổn định của dung dịch phân tích. Quá trình thẩm định đảm bảo rằng phương pháp đáp ứng các yêu cầu khắt khe của các dược điển quốc tế (USP, EP, BP), làm cho phương pháp này có thể được sử dụng trong kiểm nghiệm thuốc chuyên nghiệp và công nhân hóa.

IV. Ý nghĩa và Ứng dụng Thực tiễn của Khóa luận

Khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân về xây dựng phương pháp định tính, định lượng tạp chất A của terazosin có ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn. Việc phát triển các phương pháp phân tích tin cậy giúp các nhà sản xuất dược phẩm kiểm soát chất lượng nguyên liệu một cách hiệu quả, đảm bảo an toàn và hiệu quả của các chế phẩm terazosin được cung cấp trên thị trường. Phương pháp TLC được sử dụng như công cụ sàng lọc nhanh, trong khi phương pháp HPLC cung cấp định lượng chính xác. Những kết quả từ khóa luận này có thể được áp dụng trong Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các cơ sở sản xuất dược phẩm, góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc trong nước và đạt chuẩn quốc tế.

4.1. Đóng góp cho ngành dược phẩm Việt Nam

Khóa luận của Nguyễn Thanh Xuân đã xây dựng hai phương pháp phân tích hiệu quả cho việc kiểm soát tạp chất A của terazosin. Những phương pháp này có thể được áp dụng trực tiếp tại các cơ sở kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm ở Việt Nam. Việc định tính bằng TLC đơn giản, chi phí thấp, phù hợp với các đơn vị sản xuất có điều kiện cơ bản. Định lượng chính xác bằng HPLC đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng đạt tiêu chuẩn quốc tế.

4.2. Triển vọng và khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Dựa trên kết quả của khóa luận, các nghiên cứu tiếp theo có thể mở rộng phạm vi ứng dụng phương pháp này cho các tạp chất khác của terazosin hoặc các thuốc tương tự. Phương pháp HPLC có thể được tối ưu hóa thêm để giảm thời gian phân tích. Các kết quả từ khóa luận này nên được công bố trên các tạp chí khoa học để chia sẻ kinh nghiệm với cộng đồng khoa học và công nghiệp dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo “Báo cáo chung tổng quan ngành y tế năm 2016”, gánh nặng bệnh tật ở ngƣời cao tuổi chủ yếu gây ra bởi các bệnh không lây nhiễm, chiếm đến 86-88% số trƣờng hợp tử vong [1]. Trong các bệnh không lây nhiễm, có hai căn bệnh rất phổ biến ở nam giới đó là tăng huyết áp và phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Terazosin là một thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic đƣợc chỉ định trong điều trị nội khoa hai căn bệnh này [24], [28], [39]. Khi kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin, một số Dƣợc điển yêu cầu thử giới hạn tạp chất, trong đó có tạp chất A (1-(4-amino- 6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid) [30], [40], [41], [42].

Phƣơng pháp thử giới hạn tạp chất đòi hỏi cần có tạp chuẩn A, tuy nhiên tạp chuẩn này không có sẵn mà phải mua ở nƣớc ngoài với giá thành cao, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm [16]. Từ nhu cầu thực tế, nhóm nghiên cứu đã tổng hợp và tinh chế thành công nguyên liệu tạp chất A tại bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [20]. Tuy nhiên, để có thể sử dụng nguyên liệu này thiết lập tạp chuẩn, cần có phƣơng pháp định tính và định lƣợng chính xác nguyên liệu IAT. Vì vậy, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng nguyên liệu tạp chất A của terazosin” đƣợc thực hiện với ba mục tiêu sau: 1- Xây dựng phƣơng pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC 2- Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT bằng HPLC 3- Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để định tính, định lƣợng IAT trong nguyên liệu tổng hợp đƣợc.

Một số thông tin chung về terazosin - Công thức cấu tạo: hình 1. Công thức cấu tạo của terazosin - Công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl - Phân tử lƣợng: 423,89. - Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2- furoyl)piperazin monohydroclorid. - Ngoài dạng khan, terazosin hydroclorid còn có dạng ngậm hai phân tử nƣớc với công thức phân tử: C19H25N5O4.2H2O, phân tử lƣợng: 459,92 [42].

- Tính chất: tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, hơi tan trong nƣớc, khó tan trong methanol, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong aceton và n- hexan, có khả năng hấp thụ IR và UV [29], [30], [40]. Tác dụng và chỉ định của terazosin - Terazosin có tác dụng ức chế chọn lọc thụ thể α1-adrenergic nên dẫn đến giãn mạch, giảm sức cản ngoại biên, hạ huyết áp, do đó đƣợc chỉ định sử dụng đƣờng uống trong các trƣờng hợp: điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở ngƣời lớn, phối hợp với thuốc hạ huyết áp khác trong trƣờng hợp tăng huyết áp kháng trị [3], [26], [28], [39]. - Terazosin có tác dụng giãn cơ trơn, làm tăng lƣu lƣợng nƣớc tiểu và cải thiện triệu chứng tắc nghẽn, do đó đƣợc chỉ định sử dụng đƣờng uống để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tiền liệt tuyến [28], [39], [45]. Các nghiên cứu đã cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả lâm sàng giữa terazosin với 2 các thuốc cùng nhóm nhƣ alfuzosin, doxazosin, tamsulosin.

Đây là một trong các lựa chọn đầu tay khi các triệu chứng tắc nghẽn chiếm ƣu thế [36], [39]. - Terazosin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt bằng cách làm gia tăng sự chết theo chu trình của các tế bào này mà không ảnh hƣởng tới chu trình tế bào bình thƣờng [35]. Bên cạnh đó, thuốc còn có thể có tác dụng tích cực đến lƣợng cholesterol trong máu của ngƣời bệnh [32]. Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trường Ở các nƣớc ASEAN và trên thế giới, terazosin đƣợc biết đến với nhiều biệt dƣợc khác nhau, phổ biến là viên nén với hàm lƣợng 1, 2, 5 và 10 mg (bảng 3.

Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trƣờng Hàm lượng STT Tên biệt dược Hãng sản xuất Nước lưu hành (mg) Canada, New Zealand, 1 Apo-terazosin 2, 5 Apotex Singapore 2 Heitrin 1, 2, 5, 10 Amdipharm Ireland Mỹ, Australia, 3 Hytrin 1, 2, 5, 10 Abbott Trung Quốc, Philipin, Indonesia, Nam Phi… Terazosin 1A 4 2, 5 1A - Pharma Đức - Pharma Terazosin Accord 5 2, 5 Cộng hòa Séc Accord Healthcare Terazosin HCl 6 2 Sandoz Mỹ dihydrate 3 Hình 1. Một số chế phẩm của terazosin trên thị trƣờng 1. Tạp chất A của terazosin 1. Một số thông tin chung về tạp A của terazosin - Công thức cấu tạo: hình 1.3 - Công thức phân tử: C14H19N5O2.

- Phân tử lƣợng: 362,25. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38 - Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid. - Tính chất: màu trắng hoặc trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy > 208oC, khó tan trong methanol, dimethyl sulfoxid [44]. - Độc tính: kích thích da, mắt và hệ hô hấp mức độ trung bình, có hại nếu nuốt phải, hít phải hoặc hấp thu qua da [44].

- Tạp chất A của terazosin theo USP tƣơng ứng với tạp chất I của terazosin theo KP X, tạp chất C của terazosin theo BP 2016 và EP 8. Tạp chất A của 4 terazosin cũng đồng thời là tạp chất F của doxazosin theo BP 2016 và EP 8. Nguyên nhân gây ra tạp chất A Khi dạng base hoặc muối hydroclorid của terazosin tiếp xúc với nƣớc có tính acid ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, liên kết amid bị phân cắt, tạo ra tạp chất A (hình 1. Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin Nếu muối hydrochlorid đƣợc tổng hợp dựa trên cơ sở phản ứng giữa terazosin base và acid hydrochloric, sản phẩm cuối cùng có thể chứa một lƣợng nhỏ acid, gây ra sự thủy phân theo thời gian [27], [29], [34].

Phương pháp xác định IAT bằng TLC Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng với các điều kiện ở bảng 1. Phƣơng pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin Đối tượng Pha Nồng Phát hiện vết Pha động TLTK mẫu tĩnh độ IAT IAT Silica Soi đèn UV Nguyên Cloroform - toluen - Chƣa gel 60 bƣớc sóng [29] liệu TEZ methanol (9 : 1 : 6) rõ F254 ngắn n-butanol - acid Silica Nguyên 2,5 Phun thuốc acetic băng - nƣớc gel 60 [14] liệu IAT mg/ml thử Ninhydrin (6 : 3 : 5) F254 Methanol - ethyl Silica Soi đèn UV Nguyên acetat - dung dịch gel 60 2,5 254 nm và [14] liệu IAT amoniac 25% F254 mg/ml 312 nm (8 : 2 : 0,5) Methanol - aceton : Silica Soi đèn UV Nguyên 2,5 dung dịch amoniac gel 60 254 nm và [14] liệu IAT mg/ml 25% (7 : 2 : 0,5) F254 312 nm n-propanol - n-hexan Silica Soi đèn UV Nguyên 2,5 - dung dịch amoniac gel 60 254 nm và [14] liệu IAT mg/ml 25% (24 : 8 : 1) F254 312 nm Ethyl acetat - Silica Nguyên methanol - 0,05 Soi đèn UV gel 60 [38] liệu DOX triethylamin mg/ml 345 nm F254 (4 : 0,4 : 0,3) 1. Phương pháp xác định IAT bằng HPLC Tạp chất A của terazosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện nhƣ sau: 1. Đối tượng mẫu là nguyên liệu TEZ Phƣơng pháp 1 - Điều kiện sắc ký: 6 + Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril (1685 : 315) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 254 nm + Nhiệt độ cột: 30°C + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.

Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn A, B, C của terazosin, trong đó nồng độ IAT chuẩn là 2 µg/ml. Dung môi dùng để pha IAT gồm có: Bƣớc 1: đệm citrat pH 3,2 Bƣớc 2: hỗn hợp nƣớc, acetonitril và methanol (60 : 30 : 10) Bƣớc 3: pha động. - Lƣợng IAT trong nguyên liệu terazosin đƣợc tính dựa trên nồng độ của IAT chuẩn và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. - Giới hạn: Tạp chất A không quá 0,3% [41], [42].

Phƣơng pháp 2 - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril - triethylamin (1650 : 350 : 2) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 245 nm + Nhiệt độ cột: 30°C + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động. Dung dịch chuẩn (a) đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch thử 1000 lần với pha động. 7 Dung dịch chuẩn (b) là dung dịch chứa “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống” (trong đó có chứa IAT và một số tạp chất khác của terazosin).

Dung môi dùng để pha dung dịch chuẩn (b) là pha động. - Sử dụng sắc ký đồ kèm theo “TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống” và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b) để phát hiện pic tƣơng ứng với IAT. Sau đó xác định giới hạn IAT bằng cách so sánh diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử với pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a). - Giới hạn: Diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử không gấp quá 5 lần diện tích pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a) (0,5%) [30], [40].

Phƣơng pháp 3 - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) + Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm các thành phần nƣớc, acetonitril, methanol và dung dịch amoniac 0,1% tt/tt + Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút + Detector: PDA 220 nm và QDa mass + Nhiệt độ cột: 20oC và 40oC + Thể tích tiêm mẫu: 0,2 µl. - Dung dịch tiêm sắc ký: là hỗn hợp gồm TEZ và các tạp chất từ A đến O theo EP. Trong đó nồng độ IAT là 7,5 µg/ml. Dung môi pha mẫu là methanol [37].

Đối tượng mẫu là nguyên liệu DOX - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (250 x 4 mm, 5 µm). + Pha động: Chƣơng trình gradient nồng độ gồm dung dịch acid phosphoric (5g/100ml), acetonitril và nƣớc + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút + Detector: 210 nm + Nhiệt độ cột: 35oC + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. 8 - Dung dịch tiêm sắc ký: Dung dịch thử là dung dịch DOX với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động. Dung dịch chuẩn là hỗn hợp gồm chất chuẩn DOX, tạp chuẩn A, B, C, D, E, F của doxazosin, tạp chuẩn A, C của terazosin trong đó nồng độ IAT chuẩn là 1,5 µg/ml.

Dung môi dùng để pha dung dịch chuẩn là hỗn hợp dung môi C và D tỷ lệ 9 : 1 trong đó C là nƣớc, D là hỗn hợp gồm 100 ml acetonitril và 2 g acid phosphoric (84 - 86%).