Khóa luận tốt nghiệp: Nguyễn kim anh tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào

Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 6-benzylamino-2-naphthalen-1-yl quinazolin-4-on năm 2019.

• Tác giả: Nguyễn Kim Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Văn Thị Mỹ Huệ
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 6-benzylamino-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-on
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nguyễn Kim Anh và Nghiên cứu Tổng hợp

Nguyễn Kim Anh là một sinh viên xuất sắc của Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ với chủ đề nghiên cứu tiên phong về tổng hợp dẫn chất quinazolin-4-on. Đề tài nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh tập trung vào việc tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất mới có cấu trúc 6-benzylamino-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-on. Công trình này được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Văn Thị Mỹ Huệ và ThS. Nguyễn Thị Lai tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Thuốc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nghiên cứu này đại diện cho một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa dược và phát triển thuốc chống ung thư.

1.1. Nền tảng khoa học của nghiên cứu

Dẫn chất quinazolin-4-on đã được chứng minh là có hoạt tính kháng ung thư rất hứa hẹn trong nhiều nghiên cứu trước đó. Những dẫn chất 2-arylquinazolin-4-on đặc biệt thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư cao. Nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh dựa trên cơ sở lý thuyết này để phát triển các dẫn chất mới có hoạt tính sinh học tốt hơn, với khả năng chọn lọc cao và độc tính thấp hơn.

1.2. Ý nghĩa lâm sàng của đề tài

Ung thư là một trong những bệnh lý nguy hiểm nhất hiện nay, đòi hỏi sự phát triển liên tục của thuốc kháng ung thư hiệu quả. Công trình tổng hợp dẫn chất quinazolin của Nguyễn Kim Anh nhằm tìm ra các hợp chất mới với tác dụng chống ung thư tốt hơn, có thể mở ra con đường phát triển thuốc điều trị ung thư an toàn và hiệu quả cho người bệnh.

II. Phương pháp tổng hợp hóa học dẫn chất

Nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học có tính khoa học cao để tạo ra các dẫn chất 6-benzylamino-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-on. Quá trình tổng hợp được thực hiện qua nhiều giai đoạn, bắt đầu từ việc chuẩn bị các chất trung gian như 5-benzyllamino-2-nitrobenzamid và 2-amino-5-benzylaminobenzamid. Các bước tổng hợp dẫn chất được kiểm soát chặt chẽ bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) để đảm bảo độ tinh khiết. Phương pháp này đạt hiệu suất cao và tạo ra các hợp chất có cấu trúc xác định rõ ràng, phù hợp cho các bài thử hoạt tính sinh học tiếp theo.

2.1. Quy trình tổng hợp chất trung gian

Chất trung gian 5-benzyllamino-2-nitrobenzamid được tổng hợp thông qua phản ứng benzylation từ 2-nitrobenzamid. Tiếp theo, chất 2-amino-5-benzylaminobenzamid được tạo ra bằng cách khử nhóm nitro bằng hydrogen hoặc thuốc khử thích hợp. Các bước này đòi hỏi điều kiện phản ứng tối ưu, nhiệt độ nóng chảy kiểm soát và dung môi hữu cơ phù hợp.

2.2. Tổng hợp dẫn chất cuối cùng

Dẫn chất 6-benzylamino-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-on được tạo ra thông qua phản ứng vòng hóa giữa chất trung gian amine và naphthalen-1-carbaldehyde. Phần lõi quinazolin-4-on được hình thành qua phản ứng đóng vòng trong điều kiện nhiệt hoặc xúc tác. Tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh từ dung môi hữu cơ cho phép thu được các dẫn chất có độ tinh khiết cao.

III. Khẳng định cấu trúc và đặc trưng hóa học

Sau khi tổng hợp, các dẫn chất quinazolin được khẳng định cấu trúc thông qua các phương pháp phân tích hiện đại. Nghiên cứu của Nguyễn Kim Anh sử dụng phổ NMR proton (1H-NMR) để xác định các nhóm chức năng và vị trí thế trên phân tử. Phổ NMR carbon-13 (13C-NMR) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc karbon và số lượng carbon độc lập trong hợp chất. Phổ khối lượng (MS) với phương pháp APCI (Atmospheric-pressure chemical ionization) xác định khối lượng phân tử chính xác. Phổ hồng ngoại (IR) giúp nhận diện các nhóm chức năng như amine, carbonyl và aromatic rings.

3.1. Phân tích phổ NMR

Phổ 1H-NMR ghi lại các tín hiệu proton từ nhóm benzylamino và hạt nhân naphthalene, cho phép xác định tính đối xứng và vị trí thế trên phân tử. Phổ 13C-NMR trong dung môi CDCl3 cung cấp mô hình carbon chi tiết, với các đỉnh đặc trưng tương ứng với các vùng aromatic và nhóm chức năng khác nhau. Hằng số tương tác spin-spin (J) giúp xác định quan hệ cộng hoà hóa giữa các proton lân cận.

3.2. Kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) với than hoạt tính và dung môi hợp thích hợp được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được. Nhiệt độ nóng chảy xác định được so sánh với giá trị lý thuyết để đánh giá độ tinh khiết. Các dẫn chất đạt độ tinh khiết cao (>95%) được lựa chọn cho các bài thử hoạt tính tiếp theo.

IV. Thử tác dụng kháng tế bào ung thư và kết quả

Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất được Nguyễn Kim Anh thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoli bromid). Các dòng tế bào ung thư KB, HeLa, A549, DLD1 được lựa chọn để đánh giá hoạt tính chống ung thư của các dẫn chất mới. Nồng độ ức chế 50% (IC50) được tính toán từ dữ liệu thử nghiệm, cho phép so sánh hiệu quả ức chế giữa các dẫn chất khác nhau. Kết quả cho thấy một số dẫn chất có hoạt tính mạnh, với IC50 ở mức micromolar thấp, cho thấy tiềm năng phát triển thành thuốc chống ung thư hứa hẹn.

4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính

Phương pháp MTT là một kỹ thuật tiêu chuẩn để đánh giá độc tính tế bào ung thư. Các tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường DME hoặc RPMI có chứa huyết thanh bò bhái thai. Dẫn chất được thêm vào ở các nồng độ khác nhau, sau đó tế bào được ủ trong 3 ngày. Độ hấp thụ quang được đo tại bước sóng 570nm bằng máy đo quang phổ tế bào, từ đó tính toán phần trăm ức chế tế bào và nồng độ IC50.

4.2. Kết quả và đánh giá hiệu quả

Các dẫn chất 6-benzylamino-2-(naphthalen-1-yl)quinazolin-4-on thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư đáng kể trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Một số dẫn chất có IC50 từ 1-10 μM, cao hơn đáng kể so với thuốc tương đương đã biết. Tác dụng chọn lọc trên các tế bào ung thư so với tế bào bình thường cho thấy tiềm năng lâm sàng của các hợp chất mới này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới năm 2018, ung thƣ là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai trên toàn cầu và ƣớc tính chiếm 9,6 triệu ca tử vong [27]. Tại Việt Nam, có 164671 ca mắc ung thƣ mới và 114871 ngƣời chết do ung thƣ trong năm 2018 [28]. Một trong các biện pháp điều trị ung thƣ phổ biến là hóa trị liệu. Một số thuốc điều trị ung thƣ đã đƣợc sử dụng trong lâm sàng, tuy nhiên số lƣợng không nhiều và giá cả đắt đỏ.

Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các hợp chất có hoạt tính chống ung thƣ tiềm năng là một nhu cầu cấp thiết của Việt Nam và thế giới. Raltitrexed và Nolatrexed là hai thuốc ung thƣ có cấu trúc 4(3H)– quinazolinon đã đƣợc cấp phép lƣu hành trên thế giới [24]. Nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam cũng đã nghiên cứu về tổng hợp và thử hoạt tính kháng ung thƣ của các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon và thu đƣợc nhiều hợp chất có hoạt tính tốt. Trong nhóm chất nói trên, các dẫn chất 2–arylquinazolin– 4(3H)–on đƣợc quan tâm hàng đầu nhờ tác dụng chống ung thƣ của chúng [6, 17, 26].

Nhiều nghiên cứu cho thấy các dẫn chất 2–arylquinazolin–4(3H)–on có chứa nhóm thế naphthalen–1–yl ở vị trí số 2 và nhóm thế amino ở vị trí số 6 thể hiện nhiều tiềm năng trong tác dụng chống ung thƣ [1, 2, 11, 15, 26]. Với định hƣớng sử dụng nhóm thế ở vị trí số 2 là các dẫn chất naphthalen–1–yl và nhóm thế ở vị trí số 6 là benzylamino để tìm hiểu mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung thƣ của dãy chất 2–arylquinazolin– 4(3H)–on, đồng thời tìm kiếm những hợp chất có khả năng gây độc tế bào, khóa luận: “Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on” đƣợc tiến hành với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp đƣợc một số dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1– yl)quinazolin–4–on. Thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp đƣợc trên một số dòng tế bào ung thƣ.

Hoạt tính kháng ung thƣ của dẫn chất 4(3H)–quinazolinon Quinazolinon là vòng quinazolin có gắn thêm nhóm carbonyl [9]. Trong số các cấu trúc quinazolinon, 4(3H)–quinazolinon là phổ biến nhất, là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm tự nhiên trong nhiều con đƣờng sinh tổng hợp đã đƣợc đề xuất. Điều này một phần là do cấu trúc có nguồn gốc từ các anthranilat (acid anthranilic hoặc các este khác nhau, anhydrid isatoic, anthranilamid và anthranilonitril) trong khi 2(1H)–quinazolinon chủ yếu là sản phẩm của anthranilonitril hoặc benzamid với các nitril [16]. Cấu trúc hóa học của quinazolin và 4(3H)–quinazolinon 4(3H)–quinazolinon là một nhóm lớn các hợp chất hóa học thể hiện hoạt tính sinh học đa dạng trên động vật cũng nhƣ trên ngƣời.

Các nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon có nhiều tác dụng nhƣ: chống HIV, chống ung thƣ, kháng khuẩn, chống trầm cảm, chống nấm…[10, 18, 19, 25]. Tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 4(3H)–quinazolinon đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu và đã thu đƣợc nhiều hợp chất có tác dụng tốt. Một số thuốc là dẫn chất 4(3H)–quinazolinon đã đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng nhƣ: Nolatrexed và Raltitrexed sử dụng trong điều trị ung thƣ,… [24]. Cấu trúc hóa học của hai thuốc Noltrexed, Raltitrexed 2 Trong các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon, 2–arylquinazolin–4–on là một nhóm hợp chất hóa học quan trọng, đƣợc quan tâm hàng đầu vì khả năng chống ung thƣ của chúng [6, 17, 26].

Trong số các 2–arylquinazolin–4–on, các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on thể hiện tác dụng chống ung thƣ tiềm năng. Điều này đƣợc thể hiện trong các nghiên cứu sau đây. Năm 2001, Yi Xia và các cộng sự đã tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất 2–phenylquinazolin–4–on và 2–(naphthalen–1– yl)quinazolin–4–on. Dựa trên kết quả thử độc tính tế bào trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB, có thể thấy hoạt tính gây độc tế bào của dẫn chất 2– (naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on mạnh hơn một số dẫn chất 2– phenylquinazolin–4–on có cùng các nhóm thế còn lại trên nhân 4(3H)– quinazolinon.

Nhƣ vậy, nhóm thế naphthlen–1–yl ở vị trí số 2 trên nhân 4(3H)– quinazolinon có vai trò quan trọng trong tác dụng chống ung thƣ [26]. Kết quả so sánh hoạt tính gây độc tế bào giữa các dẫn chất 2–(naphthalen–1– yl)quinazolin–4–on và 2–phenylquinazolin–4–on đƣợc thể hiện trong bảng 1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của một số dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và 2–phenylquinazolin–4–on (Ia–d, IIa–b) ED50 ED50 STT Công thức cấu tạo STT Công thức cấu tạo (µg/mL) (µg/mL) Ib >20 Ia 12,50 Ic >20 Id >20 3 IIa 7,30 IIb >20 Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành, Văn Thị Mỹ Huệ và Nguyễn Thị Huyền đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon. Kết quả thử hoạt tính của năm dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f) cho thấy, trong các dẫn chất có cùng nhân 6–methyl–quianzolin–4–on hoặc 7–methyl–quianzolin–4–on, dẫn chất có nhóm thế 2–(naphthalen–1–yl) có tác dụng kháng tế bào ung thƣ mạnh hơn một số dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 2 là dẫn chất của phenyl.

Trong đó, cả ba dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on (IIIa, IIId, IIIf) tổng hợp đƣợc đều cho hoạt tính gây độc tế bào rất tốt [2]. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f) đƣợc tổng hợp ở bảng 1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f) IC50 (µg/mL) R6/R7 STT Công thức cấu tạo Hep– KB LU MCF7 G2 IIIa 3,92 5,8 11,69 16,64 R6 = –CH3 IIIb 4,48 5,81 62 74 IIIc 29,17 24,8 104 29,25 4 IIId 14,85 20,75 30 30,62 R7 = –CH3 IIIe 70,4 32 104 >128 R6 = IIIf 0,051 0,096 0,125 0,5 –N(CH3)2 Ellipticin 0,31 0,35 0,45 0,53 Kết quả nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành và cộng sự còn cho thấy giữa các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on (IIIa, IIId, IIIf) tổng hợp đƣợc, dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 6 cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với nhóm thế ở vị trí số 7, đặc biệt là nhóm thế dimethylamino ở vị trí số 6 cho hoạt tính mạnh nhất, có IC50 (µg/mL) thấp hơn chất đối chứng dƣơng ellipticin [2]. Năm 2013, Mann Jen Hour và các cộng sự đã tổng hợp, thử hoạt tính gây độc tế bào và xác định cơ chế chống khối u của một số dẫn chất 2– arylquinazolinon với các nhóm thế khác nhau ở vị trí số 6.

Nghiên cứu đã tổng hợp đƣợc năm dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on đều có hoạt tính gây độc tế bào tốt, cho giá trị IC50 (µM) từ 0,03 – 8,74 µM trên năm dòng tế bào ung thƣ [11]. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào đƣợc tổng hợp trong bảng 1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (IVa–e) IC50 (µM) STT Công thức cấu tạo M21 CH27 H460 Hep3B HSC–3 IVa 0,09 0,09 0,07 1,94 0,15 5 IVb 0,63 0,43 4,37 8,74 0,20 IVc 0,03 0,05 0,08 1,35 0,04 IVd 0,44 0,38 0,38 7,46 1,65 IVe 0,9 0,78 0,44 1,11 0,63 Ngoài ra, nghiên cứu của Mann Jen Hour còn đƣa đến một kết luận quan trọng về cơ chế gây độc tế bào của 5 dẫn chất này (IVa–e) là nhắm đến mục tiêu kép, gắn kết với tubulin và JNK, chống ung thƣ và gây chết tế bào ung thƣ thông qua việc can thiệp vào chức năng điều khiển của tubulin và JNK [11]. Từ ba nghiên cứu trên, có thể thấy đƣợc nhóm thế ở vị trí số 2 trong nhân 4(3H)–quinazolinon có ý nghĩa quan trọng trong tác dụng gây độc tế bào, đặc biệt là nhóm thế naphthalen–1–yl.

Đồng thời, có thể nhận ra các dẫn chất 6– amino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on từ những nghiên cứu trên đều có hoạt tính kháng ung thƣ tốt. Trong số các 2–arylquinazolin–4–on, các dẫn chất có nhóm thế amino ở vị trí số 6 cũng đã đƣợc báo cáo là có tác dụng chống ung thƣ rất mạnh [15]. Một số nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất 6–amino–2–arylquinazolin–4–on khác đã đƣợc tiến hành thu đƣợc các dẫn chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt [1, 15]. Điều này cũng đƣợc thể hiện trong hai nghiên cứu sau đây.

Năm 2016, Lê Nguyễn Thành và các cộng sự đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính chống ung thƣ của các dẫn chất 2–aryl–6–diethylamino 6 quinazolinon. Hai dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4– on (Va–b) tổng hợp đƣợc đều có hoạt tính gây độc tế bào tốt, mạnh hơn chất chứng dƣơng ellipticin trên ba dòng tế bào ung thƣ KB, Hep–G2 và MCF–7, riêng với dòng tế bào ung thƣ LU–1, trong khi chất Vb có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng ellipticin thì chất Va cho hoạt tính yếu hơn. Trong khi đó, chất Vc có nhóm thế ở vị trí số 2 là naphthalen–2–yl lại cho hoạt tính kháng dòng tế bào KB yếu hơn chất Va, Vb và ellipticin, không có tác dụng trên ba dòng tế bào còn lại. Nhƣ vậy, nhóm thế 2–(naphthalen–1–yl) có tác động tốt hơn nhóm thế 2–(naphthalen–2–yl) đến khả năng gây độc tế bào của nhân 4(3H)– quinazolinon [15].

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hai dẫn chất 6– diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (Va–b) và một dẫn chất 6– diethylamino–2–(naphthalen–2–yl)quinazolin–4–on (Vc) đƣợc tổng hợp ở bảng 1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ của hai dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và một dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–2–yl)quinazolin–4–on (Va–c) IC50 (µM) STT Công thức cấu tạo KB Hep–G2 LU–1 MCF–7 Va 0,05 0,06 3,48 0,25 Vb 0,24 0,31 1,34 0,29 Vc 66,5 na na na Ellipticin 1,26 1,42 1,827 2,151 7 Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành, Ngô Xuân Hoàng và Trần Minh Huệ đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 6–butylamino–2–arylquinazolin–4–on. Trong số năm dẫn chất thu đƣợc, có hai dẫn chất có nhóm thế naphthalen–1–yl ở vị trí số 2. Hai dẫn chất này đều có hoạt tính rất tốt trên hai dòng tế bào ung thƣ KB và Hep–G2, mạnh hơn từ 2 – 17,25 lần so với chất chứng dƣơng ellipticin [1].

Kết quả thử hoạt tính đƣợc trình bày trong bảng 1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 6–(n– butylamino)–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (VIa–b) IC50(µM) STT Công thức cấu tạo KB Hep–G2 VIa 0,91 0,99 VIb 0,11 0,12 Ellipticin đo cùng VIb 1,665 2,07 Từ kết quả của những nghiên cứu trên, có thể thấy đƣợc tiềm năng chống ung thƣ của các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–6–aminoquinazolinon. Trong khóa luận này, các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–6–aminoquinazolinon với nhóm thế ở vị trí số 6 là benzylamino tiếp tục đƣợc tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính chống ung thƣ. Phƣơng pháp tổng hợp dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on 1.

Phản ứng amid hóa giữa anthranilonitril và naphthoyl clorid Nhƣ thể hiện trong sơ đồ 1.1, 2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp amid hóa anthranilonitril với naphthoyl clorid đã tạo ra các chất trung gian diaryl amid tƣơng ứng.