CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Nguồn gốc - Quercetin là một trong những flavonoid bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm flavonol, có màu vàng. - Quercetin có nhiều trong táo, nho, hành tây, tỏi, rượu vang đỏ. Trong các nguồn thực vật này, quercetin thường tồn tại ở dạng liên kết với đường (glycosid) ít khi gặp dưới dạng tự do (aglycon) [98].
- Ở nước ta và một số nước châu Á khác, quercetin được thu nhận chủ yếu từ rutin trong nụ hoa khô của cây hòe (Sophora japonica L.) bằng phương pháp thủy phân [4]. Ngoài ra, hoạt chất này cũng được tách chiết từ một số dược liệu khác như củ hành tím (Allium cepa L.), cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb. - Quercetin sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng quercetin dihydrat [17], [100], [138]. Công thức hóa học Hình 1.
Cấu trúc hóa học của quercetin [124] - Tên IUPAC: 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4- one. - Công thức phân tử: C15H10O7. - Khối lượng mol phân tử: 302,23 đvC [124]. - Xét trên phương diện hóa học, quercetin có cấu tạo khung kiểu C6 - C3 - C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon.
Một phân tử quercetin có 5 nhóm hydroxyl (ở các vị trí 3, 3’, 4’, 5 và 7) do đó quercetin là một trong những hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong nhóm flavonoid [114]. Phần lớn flavonoid là các dẫn chất có gốc phenyl vì vậy về bản chất quercetin là polyphenol có tính acid yếu. Tính chất lý hóa ❖ Đặc tính lý học: - Cảm quan: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Bình thường tồn tại ở dạng dihydrat, trở nên khan ở 95 - 97oC.
- Góc quay cực riêng [a]20D là -83o, chỉ số khúc xạ là 1,823. - Nhiệt độ nóng chảy: 316,5oC; áp suất hơi là 2,81 x 10-14 mmHg ở 25oC [73]. - Trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS), quercetin thuộc phân nhóm II vì hoạt chất có tính thấm tốt với hệ số thấm là (7,30 ± 1,95) x 10-4 cm/s nhưng ít tan [79]. Ở nhiệt độ 25oC, độ tan của quercetin trong môi trường nước khoảng 1 µg/ml; trong dịch dạ dày nhân tạo là 5,5 µg/ml, trong dịch ruột nhân tạo là 28,9 µg/ml; trong ethanol khoảng 2 mg/ml và trong DMSO là 30 mg/ml [18].
Độ tan của quercetin phụ thuộc vào nhiệt độ và pH. Khi nhiệt độ tăng từ 25oC đến 140oC, độ tan trong nước của quercetin tăng từ 0,00163 mg/ml lên 1,49 mg/ml [121]. Sự gia tăng độ tan quercetin cũng nhận thấy khi pH thay đổi từ 1,2 - 7,4 [69]. - Hệ số phân bố là 1,82 ± 0,32 trong môi trường n-octan/nước [106].
- Hệ số khuếch tán D: 1,6 x 10-7 - 6,1 x 10-7 cm2/s [79]. - Khối lượng riêng (g/cm3): 1,799 [55]. - Một đặc điểm quan trọng của quercetin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại do hiệu ứng liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen. Theo USP 41, hoạt chất có cực đại hấp thụ tại bước sóng 255 nm và 371 nm trong methanol [124].
❖ Đặc tính hóa học: - Quercetin có tính acid yếu. Hằng số phân ly pKa1 = 7,17 (phenol); pKa2 = 8,26 (phenol); pKa3 = 10,13 (phenol); pKa4 = 12,30 (phenol); pKa5 = 13,11 (phenol) [50]. - Phản ứng của nhóm hydroxyl (-OH) [2]: + Phản ứng oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa (bạc nitrat, các gốc tự do,…) hay enzym polyphenoloxydase, quercetin sẽ bị oxy hóa thành các gốc ArO. Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa với các gốc tự do khác tạo thành liên kết mới C - C, C - O hoặc O - O.
- Phản ứng của vòng thơm: Phản ứng thế dễ hơn benzen; phản ứng diazo và azo hóa được sử dụng để phát hiện quercetin trên sắc ký đồ. Thuốc thử thường là những amin thơm [2]. - Phản ứng của nhóm carbonyl [2]: + Phản ứng Shinoda (hay cyanidin): Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như sắt, kẽm, magnesi trong môi trường HCl. Phản ứng này đặc trưng cho các flavonoid có nhóm carbonyl ở vị trí C4 và có nối đôi giữa C2 = C3 điển hình là flavonol (quercetin).
4 + Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng là một trong những tính chất quan trọng, liên quan đến hoạt tính sinh học của quercetin. Do có nhóm chức carbonyl ở vị trí C4 và hydroxy ở vị trí C3 - C5 nên quercetin dễ tạo phức với kim loại (hình 1. Độ ổn định - Độ ổn định của các flavonoid phụ thuộc vào cấu trúc hóa học. Thông thường, hợp chất nào có số nhóm -OH phenol càng nhiều thì càng kém ổn định.
Tuy nhiên, cấu trúc của quercetin có hơn một vòng benzen, do đó độ ổn định của hoạt chất không phụ thuộc hoàn toàn vào số nhóm -OH phenol. - Tại pH kiềm, quercetin kém ổn định. Sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy này là 2,4,6-trihydroxymandelat và 2,4,6-trihydroxyphenylglyoxylat [39]. - Quercetin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao.
Số phân tử nước cũng có ảnh hưởng đến sự nhạy cảm của quercetin với nhiệt độ, trong đó quercetin dihydrat thể hiện tính ổn định nhất [30]. Các phương pháp định lượng quercetin Dược điển Mỹ USP 41 [124] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng quercetin. Pha động là hỗn hợp methanol, nước và acid phosphoric với tỷ lệ 100:100:1. Điều kiện sắc ký: Cột C18 (4,6 x 250 mm; đường kính hạt 5,0 µm); tốc độ dòng 1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl và detector UV với bước sóng 370 nm.
Mẫu thử và mẫu chuẩn được pha trong hỗn hợp methanol - nước. Dựa vào đáp ứng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn để xác định lại hàm lượng quercetin trong nguyên liệu. Một số nghiên cứu trong nước lựa chọn pha động là hỗn hợp methanol - acetonitril - đệm phosphat 0,01 M pH 3 tỷ lệ 30:60:10. Điều kiện sắc ký có một số sự thay đổi so với USP 41: Thể tích tiêm 10 µl; tốc độ dòng 0,6 ml/phút [10].
Ưu điểm của phương pháp HPLC là có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng với độ lặp lại tốt. Ngoài ra, quá trình định lượng có thể tiến hành trên nhiều mẫu trong thời gian ngắn và các mẫu có thể ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, quy trình chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký phức tạp và sử dụng nhiều dung môi hữu cơ. Vì vậy, trong một số trường hợp không yêu cầu phương pháp định lượng có độ chính xác quá cao như trong phép thử độ hòa tan, có thể sử dụng phương pháp đo phổ tử ngoại để định lượng quercetin ở bước sóng 370 nm [69], bước sóng 374 nm [73].
Tác dụng dược lý - Tác dụng chống oxy hóa: Các gốc tự do có thể được tạo ra từ các hợp chất có tính oxy hóa mạnh mang gốc kim loại (Fe) hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc như nitrit (NO), carboxyl (O C=O), carbonyl ( C=O)…, dưới tác dụng của các tác 5 nhân gây oxy hóa như oxy phân tử (O2), tia cực tím (UV), phóng xạ, các chất xúc tác (enzym). Các chất mang gốc tự do sinh ra nhiều là nguyên nhân gây tăng sự lão hóa, đột biến, bất thường sinh tế bào (ung thư) và các tác hại cho hoạt động sinh lý (như sinh hóa máu, rối loạn tiêu hóa, gan thận…). Quercetin là hoạt chất có khả năng chống lại các quá trình oxy hóa có hại, hoạt tính này có thể được giải thích dựa vào đặc điểm cấu trúc phân tử [54], [114]: + Trong phân tử quercetin, các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp hoạt chất có thể tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử, bắt giữ các gốc tự do (ví dụ: gốc peroxyl ROO. + ArOH → ROOH + ArO.
Gốc phenoxyl (ArO.) có thể nhường một nguyên tử hydro thành quinon hoặc phản ứng với các gốc tự do, các gốc phenoxyl khác tạo thành chất ổn định hơn. + Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C = C, C = O) tạo nên hệ liên hợp giúp hoạt chất có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxy hoạt động và các gốc tự do. + Quercetin có thể phản ứng với ion kim loại để hình thành phức chelat, do đó làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxy hoạt động. Về mặt lý thuyết, khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của quercetin tăng khi có sự hiện diện của ion Cu2+ và Cr3+.
Tuy nhiên, ion Sn2+ và Cd2+ làm giảm hoạt tính của quercetin [141]. Các vị trí của quercetin có thể liên kết với các ion kim loại [147] - Ức chế quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin trên da thông qua việc ức chế hoạt động của enzym tyrosinase [79]. - Giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch: Quercetin tác động lên gốc peroxyl nên ức chế sự hình thành của hydroperoxyd, đồng thời tác động lên gốc alkoxyl nên ngăn chặn sự oxy hóa của LDL - cholesterol [73]. - Chống dị ứng bằng cách ổn định màng tế bào của dưỡng bào [98].
- Chống viêm: Quercetin ức chế hoạt động của cyclo - oxygenase và lipo – oxygenase do đó hạn chế sự hình thành các tác nhân gây viêm [98]. - Giảm một số triệu chứng của bệnh gút: Quercetin ức chế hoạt động của xanthin oxidase, enzym có vai trò xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric, kết quả làm giảm lượng uric máu [47]. Dược động học - Hấp thu: Sau khi uống chế phẩm có chứa quercetin, tại khoang miệng, quercetin có thể tương tác với protein trong nước bọt hình thành dạng quercetin - protein. Nhưng phức hợp này hầu như không có ảnh hưởng đến sự hấp thu của hoạt chất trong cơ thể [32].
Tiếp theo, hoạt chất sẽ đi xuống theo thực quản tới dạ dày do áp lực nhu động. Trong môi trường acid của dịch vị, một phần quercetin (khoảng 7 %) bị phân hủy thành acid phenolic (ví dụ acid protocatechuic). Các acid phenolic này có thể được hấp thu tại dạ dày [29]. Quercetin được hấp thu chủ yếu qua niêm mạc ruột non, với mức độ hấp thu thấp do hoạt chất ít tan trong nước.
Theo nghiên cứu của Yousry E. và cộng sự, nồng độ tối đa quercetin trong huyết tương chuột sau khi uống liều 50 mg/kg là 2,01 µmol/lit, chứng tỏ sinh khả dụng (SKD) đường uống của hỗn dịch quercetin chỉ khoảng 16% [145]. Tương tự, sau khi cho lợn uống mức liều như trên, sinh khả dụng đường uống của quercetin khoảng 17 % [20]. Trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (chỉ số khối cơ thể dao động trong khoảng 18,5 - 27) uống liều đơn 500 mg quercetin, nồng độ trong huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 10,93 ± 2,22 ng/ml [102].