Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Nguyễn đình trung dũng tổng hợp và thử tác dụng

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ năm 2020 về tổng hợp và thử nghiệm tác dụng kháng ung thư của các dẫn chất 1H indazol 6 amin bởi Nguyễn Đình Trung Dũng tại Hà Nội.

• Tác giả: Nguyễn Đình Trung Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Phương Thảo
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nguyễn Đình Trung Dũng Tổng hợp và Thử Tác Dụng Kháng Ung Thư Của Một Số Dẫn Chất 1H-Indazol-6-Amin
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Nguyễn Đình Trung Dũng và đề tài khóa luận

Nguyễn Đình Trung Dũng là một sinh viên dược sĩ tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp năm 2020 với chủ đề nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng kháng ung thư. Đề tài này tập trung vào việc tổng hợp các dẫn chất 1H-indazol-6-amin và đánh giá tiềm năng ức chế hoạt tính của các hợp chất này. Khóa luận được thực hiện dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia hàng đầu bao gồm TS. Trần Phương Thảo từ Bộ môn Hóa dược và ThS. Ngô Xuân Hoàng từ Bộ môn Hóa hữu cơ. Nghiên cứu này đại diện cho công trình khoa học có ý nghĩa trong lĩnh vực hóa dược và phát triển thuốc chống ung thư.

1.1. Bối cảnh và mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tổng hợp hóa học các dẫn chất indazol mới và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro. Các nhà khoa học nhận thấy rằng ức chế enzym IDO1 có thể là một chiến lược hiệu quả trong điều trị ung thư. Bằng cách phát triển các hợp chất mới, đề tài nhằm đóng góp vào việc khám phá các tác nhân chữa bệnh tiềm năng với hiệu quả cao và độc tính thấp.

1.2. Ý nghĩa khoa học của công trình

Khóa luận của Nguyễn Đình Trung Dũng có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển thuốc kháng ung thư mới. Các dẫn chất indazol được nghiên cứu có thể mở ra những hướng đi mới cho điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là thông qua cơ chế ức chế miễn dịch được điều hòa bởi IDO1. Công trình này góp phần vào nền tảng khoa học cho phát triển các liệu pháp ung thư hiệu quả hơn.

II. Nội dung chính của khóa luận tổng hợp và thử hoạt tính

Khóa luận tập trung vào hai phần chính: tổng hợp hóa học và thử hoạt tính sinh học. Trong phần tổng hợp, các nhà nghiên cứu đã thực hiện các phản ứng hóa học như amin hóa khử và khử hóa nhóm nitro thơm để tạo ra các dẫn chất mới. Các hợp chất được tổng hợp đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký và xác định cấu trúc thông qua phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Sau đó, các dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm A549, HCT-116, MDA-MB-231 và SNU-638 để đánh giá hiệu quả của chúng.

2.1. Các phương pháp tổng hợp hóa học

Nghiên cứu sử dụng phản ứng amin hóa khử như phương pháp chính để tạo ra các dẫn chất indazol-6-amin. Các phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm cũng được áp dụng để điều chỉnh cấu trúc phân tử. Các chất trung gian được sản xuất theo các sơ đồ tổng hợp được thiết kế cẩn thận nhằm đạt hiệu suất cao và độ tinh khiết tối ưu cho các chất mục tiêu cuối cùng.

2.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Phương pháp sulforhodamin B (SRB) được sử dụng để thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro. Các tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc RPMI với huyết thanh bào thai bò (FBS). Các dẫn chất được kiểm tra để xác định IC50 - nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư, giúp đánh giá hiệu quả kháng ung thư của các hợp chất.

III. Kết quả chính và khám phá khoa học

Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng một số dẫn chất indazol-6-amin (IIIa-e) có hoạt tính kháng ung thư đáng kể. Các phân tích phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạn nhân 1H và 13C xác nhận cấu trúc của các hợp chất được tổng hợp. Các dữ liệu thử hoạt tính in vitro cho thấy một số dẫn chất có hoạt tính mạnh mẽ chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau. Những phát hiện này được bàn luận chi tiết so sánh với các chất ức chế IDO1 đã biết, từ đó xác định các dẫn chất tiềm năng nhất cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.1. Hiệu suất tổng hợp và đặc tính cấu trúc

Các phản ứng hóa học đã thực hiện cho hiệu suất tổng hợp khác nhau, với các chất mục tiêu được khử hóa và amin hóa thành công. Phổ NMR và phổ khối lượng cung cấp bằng chứng rõ ràng về xác định cấu trúc của các dẫn chất. Độ tinh khiết được xác định bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy các hợp chất đã được tinh khiết tốt, phù hợp cho thử hoạt tính sinh học.

3.2. Hiệu quả kháng ung thư của các dẫn chất

Kết quả thử hoạt tính cho thấy một số dẫn chất có IC50 thấp trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như A549, HCT-116 và MDA-MB-231. Các hợp chất có hoạt tính mạnh với một số dẫn chất vượt trội so với các chất ức chế IDO1 tiêu chuẩn. Những kết quả này gợi ý rằng các dẫn chất indazol-6-amin này có tiềm năng phát triển thành các tác nhân chữa bệnh ung thư mới.

IV. Ý nghĩa và triển vọng phát triển tiếp theo

Khóa luận của Nguyễn Đình Trung Dũng đã đóng góp những hiểu biết quan trọng về tổng hợp hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn chất indazol mới. Những phát hiện này mở ra những khả năng mới cho phát triển thuốc kháng ung thư dựa trên cơ chế ức chế IDO1. Các dẫn chất hoạt tính cao có thể được tối ưu hóa thêm để cải thiện hiệu quả dược lý và độ an toàn. Công trình này cung cấp một nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển những thuốc ung thư hiệu quả có thể cứu sống hàng triệu bệnh nhân.

4.1. Triển vọng của dẫn chất indazol trong điều trị ung thư

Các dẫn chất indazol được tìm thấy có tiềm năng cao trong ức chế IDO1 - một enzym quan trọng trong điều hòa miễn dịch của khối u. Liên quan cấu trúc-hoạt tính được phân tích chi tiết cho thấy rằng những dẫn chất cải tiến có thể đạt được hoạt tính tốt hơn. Các công trình nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào tối ưu hóa dòng hợp chất này để phát triển thành thuốc tiềm năng cho các thử nghiệm lâm sàng.

4.2. Đóng góp cho y học hiện đại

Công trình của Nguyễn Đình Trung Dũng đại diện cho một bước tiến quan trọng trong y học hiện đại và phát triển thuốc. Bằng cách kết hợp hóa dược với sinh học phân tử, nghiên cứu này cho thấy cách thiết kế hợp chất mới dựa trên hiểu biết cơ chế bệnh. Kết quả này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ứng dụng lâm sàng tiềm năng, góp phần vào cuộc chiến chống bệnh ung thư - một trong những thách thức y tế lớn nhất hiện nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Khái niệm chung Indoleamin 2,3-dioxygenase hay còn gọi là IDO là một enzym nội bào bao gồm một chuỗi polypeptid và có chứa nhân hem, nó được mã hóa vởi gen IDO1 nằm ở trên nhiễm sắc thể. Vai trò chính của nó là điều khiển quá trình dị hóa tryptophan trong cơ thể theo con đường kynurenin (Kynurenine pathway-KP) [3]. Qúa trình mở vòng indol xúc tác bởi enzym IDO là bước đầu tiên và quyết định tới tốc đô dị hóa của tryptophan theo con đường kynurenin, theo con đường này tryptophan iến đổi thành các chất chuyển hóa khác như kynurenin (Kyn), kynurenic axit, 3-hydroxykynurenin, axit 3-hydroxyanthranilic, axit picolinic và axit quinolinic.

Sự tiêu thụ tryptophan thông qua con đường kynurenin (KP) có liên quan tới tự tăng trưởng và phát triển của tế bào. Các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng, KP còn có mối liên quan đến sự kháng khuẩn và ức chế miễn dịch trong cơ thể. IDO được chia thành hai loại với kí hiệu là IDO1 và IDO2, cả hai đều tham gia vào con đường kynurenin, tuy nhiên tốc độ xúc tác cho quá trình dị hóa tryptophan bởi hai enzym này là khác nhau do hoạt lực enzym của IDO2 chỉ bằng từ 3-5% so với enzym IDO1 [16]. Ngoài ra, người ta cũng biết đến một loại enzym chuyển hóa tryptophan khác có cơ chế giống như IDO đó là tryptophan 2,3-dioxxygenase (TDO), tuy nhiên sự phân bố của enzym này trong cơ thể là khác so với IDO và chúng cũng xuất hiện ở cả các vi khuẩn.

IDO và sự dung nạp miễn dịch của cơ thể Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, IDO giữ một vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào ung thư. Cụ thể, nó hoạt hóa quá trình viêm xung quanh tế bào khối u, ức chế miễn dịch thông qua sự điều hòa tế bào NK, tế bào T và tế bào T điều hòa [17]. Mặc dù chức năng điều hòa miễn dịch của các IDO chưa được nghiên cứu một cách thực sự đầy đủ nhưng nó có mối quan hệ mật thiết đối với sự suy giảm nồng độ của tryptophan và sự gia tăng chất chuyển hóa kyrunenin tại vị trí xung quanh môi trường tế bào ung thư. Đặc biệt hơn nữa, sự suy giảm tryptophan gây ra sự đình trệ chu trình tế bào của tế bào T và khích hoạt quá trình chết tế bào theo chương trình apotosis.Ở nồng độ tryptophan dưới ngưỡng 0,5 µM, quá trình biệt hóa của tế bào T bị ức chế [14], dẫn đến gia tăng sự biệt hóa các tế bào CD4+ thành các tế bào T điều hòa.

Mối liên quan giữa IDO và bệnh ung thư Nhìn chung, khi nghiên cứu mối liên quan giữa sự phát triển của tế bào ung thư và đáp ứng miễn dịch của cơ thể, người ra cho rằng Indoleamine 2,3-dioxygenase tác động đến sự biệt hóa và phân chia của các tế bào T, gây ra những tín hiệu điều hòa xuôi thông qua các GCN2, mTOR và AhR. IDO và quá trình ức chế miễn dịch Đầu tiên, sự suy giảm của tryptophan bởi IDO dẫn đến sự suy giảm nồng độ axit amin này trong môi trường nội mô và kết quả là sự tích lũy của t RNA vận chuyển ở trạng thái không liên kết với amino axit. GCN2 là một kinase đáp ứng với các “stress” bao gồm một vị trí điều hòa có vai trò điều tiết với các t RNA ở trạng thái không vận chuyển. Sự hoạt hóa của GCN2 dẫn đến sự phosphoryl hóa và giảm hoạt động của yếu tố khởi đầu dịch mã ở tế bào nhân eukaryote factor 2α.

eIF-2α bị phosphory hóa sẽ ngăn chặn quá trình phiên mã và giới hạn sự dịch mã protein trong điều kiện đó [13]. Bên cạnh đó, một phân tử nữa bị ức chế bởi sự thiếu hụt tryptophan đó là yếu tố điều khiển chuyển hóa mTOR, đây là phân tử đích của sự điều hòa bởi enzym kinase 1 phụ trách điều khiển sự nhận biết amino axit (GLK1). Sự thiếu hụt tryptophan cục bộ có thể khóa GLK1, dẫn đến sự ức chế mTORC1, một phức hợp protein có nhiệm vụ kiểm soát quá trình tổng hợp protein trong tế bào và cũng đủ để gây ra sự chết tế bào. IDO ức chế mTORC1 như các rapamycin kích hoạt quá trình autophagy và làm mất khả năng gây độc tế bào của các tế bào T.

Thông thường autophagy được định nghĩa là quá 3 trình tái cấu trúc lại tế bào, loại bỏ những phần không cần thiết hoặc những phần bị mất chức năng của tế bào, dẫn đến sự chết của các tế bào già và phục hồi các tế bào còn sống, tuy nhiên trong một số bệnh, autophagy có vẻ như kích thích sự chết của các tế bào hoặc trong một số trương hợp nó giúp tế bào sinh tồn và đáp ứng lại các bất lợi của môi trường [10]. Thứ ba, sản phẩm trung gian chuyển hóa của tryptophan bởi enzym IDO là kynurenin, là một phối tử nội sinh của thụ thể aryl hydrocacbon (AhR). AhR là yếu tố tham gia vào quá trình dịch mã được hoạt hóa bới phối tử, nó đáp ứng với các chất độc ngoại sinh như dioxin và liên quan tới quá trình phát triển phôi, đột biến và sự hình thành khối u. Kynurenin (KYN) liên kết với AhR là điều kiện cần thiết để kích hoạt sự biệt hóa các tế bào Tregs (tế bào T điều hòa) những tế bào có trách nhiệm trong việc ức chế miến dịch chống lại các khối u Sự hoạt hóa của các thụ thể AhR giúp các tế bào ung thư tạo ra một “chương trình” viêm đáp ứng với mầm bệnh tại môi trường xung quanh đó giúp nó có thể thoát khỏi sự giám sát của hệ thống miễn dịch.

Tín hiệu từ AhR được giải thích cho sự tương tác giữa hệ miễn dịch, độc tố và sự phát triển của tế bào ung thư. Cũng có thể giải thích cho việc tại sao sự tiêu thụ tryptophan giúp hình thành chương trình gây viêm đáp ứng với yếu tố bệnh sinh nhằm che mắt sự giám sát miễn dịch của cơ thể đối với sự tồn tại của tế bào ung thư và sự phát triền thành các tế bào ác tính [15]. Muller và các cộng sự [11] đã chỉ ra rằng vai trò của IDO trong nhiều cơ chế bệnh sinh là phức tạp hơn so với giả thiết IDO hoạt động như một tác nhân điều biến hệ miễn dịch, họ cho rằng IDO đã tạo ra môi trường viêm thuận lợi cho sự phát triển và di căn của tế bào ung thư. Trước đó vào năm 1996, Sakamuro cũng nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra sự mất kiểm soát trong hoạt động của IDO tại các khối u do gen Bin1 (Bridging integrator 1) [20].

Bin 1 là một protein tương tác với c-myc, ức chế tế bào ung thư thông qua tương tác với nguyên tử N cuối trong cấu trúc của c-Myc protein nhằm ngăn chặn các tác động gây đột biến hoặc sự biểu hiện gen do protein này gây ra. Dữ liệu thu nhập được từ các quan sát trên lâm sàng chỉ ra rằng sự thiếu hụt của Bin 1 và sự biển hiện quá mức của IDO xuất hiện trong rất nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư da, ung thư nguyên bào thần kinh và có liên quan tới những tiên lượng xấu trong lâm sàng ở các bệnh nhên có sự di căn trên diện rộng [6]. Bin1 có thể ngăn chặn sự phát 4 triển không kiểm soát và giảm thiểu sự trốn tránh với hệ thống miễn dịch của các tế bào khối u thông qua tác dụng điều hòa ức chế hoạt động của enzym IDO. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế IDO1 1.

Cấu trúc của enzym Cấu trúc tổng thể của IDO (hình 1.2) bao gồm hai chuỗi có cấu trúc khác biệt nhau (chuỗi lớn và chuỗi bé). Chuỗi lớn có cấu trúc xoắn toàn bộ bao gồm 13 cấu trúc xoắn alpha và 2 cấu trúc xoắn bậc 3. Bốn đoạn xoắn polypeptid của chuỗi lớn (C, I, Q và S) chạy song song với mặt phẳng nhân hem và tương tác với các cấu trúc xoắn xung quanh bằng tương tác kị nước. Cấu trúc của enzym IDO Chuỗi Q cung cấp một phối tử nội sinh cho nguyên tử sắt của nhân hem tại vị trí histamin 346 (hình 1.

Pocket xung quanh phân tử hem được tạo bởi 4 chuỗi này và 2 chuỗi xoắn khác (K-L và N). Các chuỗi bên K-L và N cũng đóng góp một phần vào tương tác với nhân hem cũng như tạo thành cầu nối liên kết hai chuỗi bên. Một vòng dài giúp liên kết hai chuỗi và chuỗi bé bao phủ đỉnh của của pocket chứa hem. Chuỗi bé có chứa sáu cấu trúc xoắn alpha, hai cấu trúc gấp nếp beta và ba cấu trúc xoắn 310.

Liên kết giữa hai chuỗi tạo thành bởi các tương tác kị nước, cầu muối, liên kết hydro bởi các nhóm chức trên các phân tử amino axit của các chuỗi. Cấu trúc của phức hợp IDO-phenyl imidazol (PI) 1. Môi trường nhân hem Hình 1.4 minh họa tương tác giữa phenyl imidazol (1 chất có khả năng ức chế enzym IDO) với trung tâm hoạt động của enzym này. Nhóm 6-propionat của nhân hem tương tác với nhóm guanidin của phân tử arginin 343 và phân tử nước số (hình 1.

Ngoài ra phân tử nước 2 cũng hình thành liên kết hydro với phân tử nước số 1 và nhóm carbony của phân tử amino axit leucin 388. Một nghiên cứu đột biến chuỗi bên [22] đã chỉ ra rằng phân tử axit amin aspartic 274 đóng vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác cho phản ứng oxy hóa của nhân hem. Tuy nhiên, phân tử này lại nằm tại chuỗi gần đó, tạo một cầu liên kết giữa nhóm carbonyl và nhóm guanidine của phân tử arginin 343, đồng thời phần nào đó cũng ảnh hưởng tới nhóm 6 propionat của nhân hem. Vì thế, sự giảm khả năng hoạt động của enzym xuất phát từ sự đột biến của phân tử aspartic 274 này dẫn đến sự không ổn định của vị trí định vị của nhân hem tại vị trí hoạt động của enzym 6 Hình 1.

Tương tác giữa nhân hem và phenyl imiadazol (PI) Quan sát các chuỗi polypeptit xung quanh môi trường nhân hem, người ta chỉ ra rằng nguyên tử N của phân tử imidazol thuộc phân tử histidine số 346 mang một phần bản chất là anion. Nó cũng phù hợp với dữ liệu phổ Rahman đưa ra là tần số của liên kết giữa sắt và phổi tử imidazol là 231 cm-1 [23]. Trong khi đó, đối với phối tử imidazol trung hòa trong phân tử myoglobin trị số này là 220 cm-1 và với phổi tử imidazol mang điện tích âm trong enzym peroxidase là 248 cm-1. Nhóm 7-propionat của phân tử hem hướng lên phía trên từ mặt phẳng hem để tương tác với nhóm chức hydroxyl của phân tử serin 263.