MỞ ĐẦU Những năm cuối thế kỷ XX đã chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật di truyền kể từ khi James Watson và Francis Cric phát hiện ra cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh ra phƣơng pháp nhân bội ADN từ một lƣợng ADN rất nhỏ ban đầu trong ống nghiệm (năm 1985). Những thành tựu này nhanh chóng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về y, sinh học và trong khoa học hình sự nhằm mục đích xác định đặc trƣng cá thể ngƣời. Có thể kể đến những ứng dụng đầu tiên để phân biệt cá thể đƣợc tiến hành tại Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và cộng sự khi nghiên cứu các đoạn gen mã hóa protein Myoglobin trong máu ngƣời. Họ đã phát hiện trên đoạn gen có một trình tự bao gồm những bazơ nitơ đƣợc lặp lại một số lần, điều đáng chú ý là các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì có số lƣợng đoạn lặp khác nhau.
Jeffreys coi đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Với sự phát triển của kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần lƣợt đƣợc phát hiện sau đó. Từ việc phát hiện các đoạn đa hình có trình tự lặp lại bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phƣơng pháp lai đầu dò (ADN probe), các đoạn lặp lại ngẫu nhiên có độ dài đơn vị lặp lại trung bình (VNTR) hoặc các đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, chỉ từ 2-4 đôi bazơ nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, các phƣơng pháp nhận dạng và phân biệt cá thể đã phát triển lên một tầm cao mới. Cũng từ đây, giám định tƣ pháp về gen ra đời.
Giám định gen đã khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp huyết thanh học trƣớc đây, giúp các nhà điều tra truy nguyên đƣợc đến cá thể ngƣời, xác định đƣợc quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định đƣợc hài cốt, xây dựng cơ sở dữ liệu và tàng thƣ gen tội phạm. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nghiên cứu tìm kiếm các trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể ngƣời đồng thời nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phục vụ cho mục đích này đƣợc nhiều công ty Công nghệ sinh học để ý bởi tiềm năng ứng dụng lớn. Ngay từ giữa những năm 90 của thế kỷ trƣớc, hai hãng sản xuất các chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xƣởng nhiều bộ KIT khác nhau, các bộ KIT đơn locus, 3 locus, 9 locus, 12 locus và 16 locus đã lần lƣợt ra đời. Mỗi bộ KIT phân tích ADN bao giờ cũng có kèm thang alen chuẩn, một thành phần quan trọng không thể thiếu.
Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất cả các alen có thể xuất hiện trong một quần thể ngƣời nhất định. Sự có mặt của thang alen cho phép xác định đƣợc chính xác kiểu gen của mẫu phân tích. Bất kỳ một thí nghiệm phân tích xác định cá thể ngƣời nào đều cần sử dụng thang alen. Tuy nhiên, các bộ KIT đƣợc thƣơng mại hóa của các hãng kể trên có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam.
Do đó, để chủ động về công nghệ, đồng thời phục vụ cho các thí nghiệm phân tích gen ngƣời Việt Nam nói chung, trong lĩnh vực khoa học hình sự nói riêng, tiến tới có thể triển khai rộng công nghệ phân tích gen tới các phòng thí nghiệm địa phƣơng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định. Mục tiêu chính của đề tài là chế tạo đƣợc thang alen chỉ thị gắn huỳnh quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn ở dạng đơn lẻ và ở dạng phức hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ công tác giám định cá thể. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phƣơng pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN 1.
Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể Với sự nghiên cứu của các nhà khoa học, con ngƣời đã phát hiện ra bản chất di truyền nằm trên cấu trúc phân tử ADN. ADN (axit deoxyribonucleic)là một chuỗi nucleotide gồm 4 loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, sự khác nhau trong trình tự của 4 loại nucleotide trong phân tử ADN của 23 đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định gen để xác định cá thể. Cấu trúc phân tử ADN Trong quá trình tìm kiếm trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều công cụ hữu hiệu cho phép xác định 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sự khác nhau với mục đích phân biệt cá thể ngƣời này với cá thể ngƣời khác. Một trong những phƣơng pháp đó là dựa các dạng đa hình trong trình tự của phân tử ADN [21].
Trình tự các nucleotide trên sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2, 23]: Đa hình theo trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào: Ví dụ: ở cá thể thứ nhất tại locus A ta có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGACTGCTAG - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ở cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG- Nhƣ vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã đƣợc thay thế A bằng C và T bằng G. Đa hình theo chiều dài: Một số gốc nucleotide đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ: Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT- 3 đoạn lặp ATAT. Cá thể thứ hai - ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT - 5 đoạn lặp ATAT.
Trong quá trình hình thành và phát triển của loài và của cá thể, sự biến đổi trình tự nucleotide trên sợi kép ADN đã xảy ra, do vậy mà con ngƣời đã ghi nhận đƣợc rất nhiều sự biến đổi đó. Khái niệm alen đƣợc thống nhất để chỉ những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus. Nhƣ vậy, với mỗi gen hay locus, con ngƣời đã ghi nhận đƣợc rất nhiều những alen khác nhau. Chính sự khác nhau trong trình tự nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân tử ADN trên các nhiễm sắc thể là cơ sở cho giám định gen hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống.
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bên cạnh đó, khi nghiên cứu về cấu trúc gen, ngƣời ta phát hiện thấy nhiều gen của sinh vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn không mã hóa sản phẩm (protein) xen giữa các đoạn mã hóa. Đoạn mã hóa đƣợc gọi là exon, đoạn không mã hóa gọi là intron. Thông thƣờng, các đoạn intron có chứa các trình tự lặp lại, các trình tự này đƣợc chia làm 2 loại: - Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10-15% bộ gen động vật có vú. Đó là những trình tự lặp lại khoảng 10-20kb, không mã hóa, thƣờng tập trung ở vùng tâm động hoặc ở đầu nhiễm sắc thể.
- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25-40% bộ gen ngƣời. Chúng có kích thƣớc lớn hơn (100-1000kb) và đa dạng hơn những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen. Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN 1. Kỹ thuật RFLP Dùng enzyme giới hạn để cắt ADN đã đƣợc tinh sạch thành những đoạn có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn rồi so sánh các đoạn thu đƣợc với nhau.
Đó là cơ sở của kỹ thuật RFLP. Các enzyme giới hạn sẽ cắt các vùng nằm ở hai đầu đoạn lặp lại. Sau đó các đoạn lặp đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc poly acrylamide. Các cá thể khác nhau ở đoạn lặp sẽ cho kết quả các băng dài ngắn khác nhau.
Với những băng có độ dài hơn kém nhau một vài nucleotide, khả năng phân biệt rất khó khăn. Ngƣời ta thƣờng sử dụng kỹ thuật RFLP với các hệ thống chỉ thị MLP và SLP (multi locus probe và single locus probe). Đó là các sợi ADN đơn, có trình tự bổ sung với một trong hai sợi của đoạn ADN cần xác định. Các mẫu dò đƣợc đánh dấu đồng vị phóng xạ, chất phát quang hóa liên kết enzyme.
Phƣơng pháp lai ADN đã đƣợc sử dụng thành công lần đầu ở Anh năm 1983 để phân tích ADN tinh dịch của tội phạm [19]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhiều bất lợi trong thực tiễn của công tác giám định hình sự vì những lý do sau: 1. Phân tích RFLP đòi hỏi mẫu ADN phải nguyên vẹn với một lƣợng đủ lớn (ít nhất là 50ng). Các mẫu dò có gắn đồng vị phóng xạ phải có độ nhạy cao mới có thể xác định đƣợc băng ADN.
Hơn nữa, việc sử dụng phóng xạ không có lợi cho sức khỏe ngƣời nghiên cứu. Phân tích RFLP đòi hỏi kỹ thuật viên phải có tay nghề cao và mất nhiều thời gian. Kỹ thuật phân tích RFLP khó tự động hóa bằng các thiết bị tin học. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu một bƣớc đột phá, có tính cách mạng trong sinh học phân tử bởi khả năng áp dụng có hiệu quả trong phân tích gen mà các phƣơng pháp trƣớc đó chƣa có đƣợc.
Nhờ có PCR ngƣời ta có thể nhân một đoạn ADN đích ban đầu lên hàng triệu bản sau 30 chu kì chỉ trong vài giờ. Lƣợng ADN này đủ lớn để có thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng khác [24]. Với những ƣu điểm nổi bật của mình, PCR đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích ADN, kể cả lĩnh vực sinh học hình sự. Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau: - Độ nhạy và tính đặc hiệu cao, - Tiết kiệm thời gian và giảm bớt khó khăn cho công tác giám định, - Có thể xác định đƣợc đối với những mẫu ADN bị biến tính một phần, - Có thể đồng thời xác định nhiều locus khác nhau và tự động hóa đƣợc quy trình phân tích.
6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.