Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 5 locus di truyền

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích hus nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus penta e d18s51 d21s11 th01 và, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất

• Tác giả: Bùi Nguyên Hải
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Xây Dựng Thang Alen Chỉ Thị Huỳnh Quang Cho 05 Locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 Và D3S1358 Phục Vụ Giám Định
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Phương pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN
• 1.2. Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN
• 1.3. Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người
• 1.4. Các locus sử dụng trong nghiên cứu
• 1.5. Các phương pháp phát hiện ADN
• 1.6. Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị, vật tư nghiên cứu
• 2.3. Mồi cho các locus nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN
• 2.4.2. Phương pháp định lượng ADN
• 2.4.3. Phương pháp nhân bội ADN
• 2.4.4. Kỹ thuật điện di ADN
• 2.4.5. Phương pháp phát hiện ADN sau điện di
• 2.4.5.1. Phát hiện băng ADN bằng Ethidium bromide
• 2.4.5.2. Phát hiện băng ADN bằng kỹ thuật soi gel huỳnh quang
• 2.4.6. Phương pháp chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang
• 2.4.7. Thu thập và xử lý dữ liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết ADN
• 3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm nhân bội trên gel agarose
• 3.3. Kết quả điện di khảo sát mẫu trên gel poly acrylamide
• 3.4. Kết quả lựa chọn mẫu và tinh sạch sản phẩm nhân bội
• 3.5. Kết quả chế tạo thang alen dạng đơn lẻ
• 3.6. Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. Kết luận
• 4.2. Kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC (Bảng và Hình ảnh)

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thang alen chỉ thị huỳnh quang

Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 5 locus di truyền là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực giám định gen. Thang alen này không chỉ giúp xác định cá thể mà còn hỗ trợ trong các nghiên cứu di truyền học. Việc phát triển thang alen chỉ thị huỳnh quang cho các locus như Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 sẽ tạo ra một công cụ mạnh mẽ cho các nhà nghiên cứu và chuyên gia trong lĩnh vực này.

1.1. Tầm quan trọng của thang alen trong giám định gen

Thang alen là một hỗn hợp các alen có thể xuất hiện trong một quần thể người nhất định. Sự có mặt của thang alen cho phép xác định chính xác kiểu gen của mẫu phân tích. Điều này rất quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền và giám định hình sự.

1.2. Các locus di truyền được nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào 5 locus di truyền: Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358. Mỗi locus này có những đặc điểm riêng biệt và đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cá thể.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu thang alen

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như độ chính xác, tính khả thi và chi phí sản xuất là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Độ chính xác trong xác định alen

Độ chính xác của thang alen phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng mẫu ADN và phương pháp phân tích. Việc đảm bảo độ chính xác cao là rất quan trọng để tránh sai sót trong kết quả giám định.

2.2. Chi phí sản xuất thang alen

Chi phí sản xuất thang alen có thể cao, đặc biệt là khi sử dụng các công nghệ tiên tiến. Việc tìm kiếm các phương pháp tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đảm bảo chất lượng là một thách thức lớn.

III. Phương pháp nghiên cứu thang alen chỉ thị huỳnh quang

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang. Các kỹ thuật như PCR và điện di gel được áp dụng để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong quá trình phân tích.

3.1. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp quan trọng trong việc nhân bản ADN. Phương pháp này cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn ADN cụ thể, giúp tăng cường khả năng phát hiện alen.

3.2. Điện di gel trong phân tích ADN

Điện di gel là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các đoạn ADN dựa trên kích thước. Kỹ thuật này giúp xác định sự hiện diện của các alen trong mẫu phân tích một cách chính xác.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy thang alen chỉ thị huỳnh quang được xây dựng có độ chính xác cao và có thể ứng dụng rộng rãi trong giám định gen. Các locus được nghiên cứu đã cho thấy tính đa hình và khả năng phân biệt cá thể tốt.

4.1. Đánh giá kết quả thang alen

Kết quả cho thấy thang alen chỉ thị huỳnh quang có thể phân biệt rõ ràng giữa các cá thể khác nhau. Điều này mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong các lĩnh vực như pháp y và nghiên cứu di truyền.

4.2. Ứng dụng trong giám định hình sự

Thang alen này có thể được sử dụng trong các vụ án hình sự để xác định danh tính của nghi phạm hoặc nạn nhân. Việc áp dụng thang alen chỉ thị huỳnh quang sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong giám định gen.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 5 locus di truyền đã đạt được những kết quả khả quan. Tương lai, nghiên cứu này có thể mở rộng ra nhiều locus khác và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau.

5.1. Triển vọng mở rộng nghiên cứu

Có thể mở rộng nghiên cứu sang các locus khác để xây dựng một bộ thang alen hoàn chỉnh hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao khả năng phân tích và xác định cá thể trong các nghiên cứu di truyền.

5.2. Tác động đến ngành công nghệ sinh học

Nghiên cứu này có thể tạo ra những bước tiến mới trong ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực giám định gen và phân tích di truyền. Sự phát triển này sẽ góp phần nâng cao chất lượng và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Giám định gen xác định cá thể và quan hệ huyết thống là bước tiến vượt bậc của di truyền học hiện đại với độ chính xác đạt trên 99,9999%. Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật phân tích các đoạn lặp lại ngắn (STR - Short Tandem Repeat) tại Việt Nam vào những năm đầu thế kỷ XXI gặp nhiều thách thức lớn do phụ thuộc hoàn toàn vào các bộ kit thương phẩm nhập khẩu từ nước ngoài như Promega hay Perkin Elmer. Những bộ kit này có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu kéo dài từ 2 đến 4 tháng, gây khó khăn cho việc triển khai đại trà tại các phòng thí nghiệm địa phương. Trong mỗi bộ kit phân tích, thang alen chỉ thị (Allelic ladder) là thành phần cốt lõi bắt buộc phải có để định danh chính xác kiểu gen của đối tượng cần giám định.

Xuất phát từ yêu cầu tự chủ công nghệ sinh học phục vụ an ninh quốc gia và công tác tư pháp hình sự, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định". Nghiên cứu được hoàn thành vào năm 2012 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội dưới sự hướng dẫn của PGS. Đinh Đoàn Long, phối hợp cùng Phòng Công nghệ Gen và Vi sinh thuộc Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Bộ Công an).

Mục tiêu trọng tâm của đề tài là xây dựng thành công quy trình chế tạo thang alen gắn chất chỉ thị huỳnh quang Fluorescein cho 05 locus gen STR đa hình cao ở cả dạng đơn lẻ và dạng phức hợp. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi giúp giảm hơn 60% chi phí hóa chất so với sử dụng kit ngoại nhập, mở ra khả năng tự cung cấp sinh phẩm chuẩn cho các đơn vị kỹ thuật hình sự trên toàn quốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết cốt lõi của sinh học phân tử hiện đại:

• Nguyên lý đa hình phân tử các locus STR trong hệ gen người: Hệ gen người chứa xấp xỉ 200.000 vị trí mang các trình tự lặp lại ngắn STR với kích thước mỗi đơn vị lặp từ 2 đến 6 cặp bazơ nitơ (bp), phân bố chủ yếu ở các vùng intron không mã hóa hoặc gần tâm động của 23 cặp nhiễm sắc thể. Các locus STR có tính bảo thủ cao, di truyền ổn định qua các thế hệ với tỷ lệ đột biến rất thấp (dưới 0,2%), mang tính đặc trưng cho từng cá thể. Năm locus được lựa chọn nghiên cứu gồm Penta E (NST 15, đơn vị lặp pentanucleotide [AAAGA]), D18S51 (NST 18, tetranucleotide [AGAA]), D21S11 (NST 21, cấu trúc lặp phức hợp [TCTA] và [TCTG]), TH01 (NST 11, [AATG]) và D3S1358 (NST 3, [TCTG] và [TCTA]). Việc phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau đảm bảo tính phân ly độc lập hoàn toàn theo quy luật Menđen.
• Nguyên lý quang học huỳnh quang và dịch chuyển Stokes: Phương pháp đánh dấu huỳnh quang sử dụng phân tử Fluorophore (cụ thể là Fluorescein - FL) gắn vào đầu 5' của mồi PCR. Dưới tác động của nguồn laser bước sóng kích thích 490 nm, phân tử huỳnh quang hấp thụ năng lượng và phát xạ ánh sáng ở bước sóng dài hơn là 520 nm (hiện tượng dịch chuyển Stokes). Tín hiệu phát quang được ghi nhận qua hệ thống cảm biến quang học, cho phép phát hiện chính xác các phân tử ADN sau điện di với độ nhạy cao vượt trội và không độc hại như các phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ P32 hay Ethidium Bromide.

Phương pháp nghiên cứu

• Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Nghiên cứu sử dụng 50 mẫu máu toàn phần thu thập từ các cá thể người Việt Nam trưởng thành thuộc đề án Bảo tồn nguồn gen. Mẫu máu được bảo quản trên thẻ giấy thấm FTA chuyên dụng tẩm sẵn hóa chất ly giải và bảo vệ ADN. Mẫu khuôn ADN chuẩn K562 của hãng Promega (nồng độ 10 ng/µl) được sử dụng làm đối chứng dương nhằm chuẩn hóa và tạm thời định danh các alen theo quy ước quốc tế.
• Quy trình tách chiết và kiểm tra ADN: Tách chiết ADN bằng phương pháp Chelex 5% ở điều kiện ủ 56°C trong 30 phút và phá màng ở 100°C trong 8 phút. Mật độ quang và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng máy quang phổ kế NanoDrop (ThermoScientific) thông qua tỷ lệ hấp thụ A260/A280 nm.
• Kỹ thuật nhân bản PCR và tinh sạch: Sử dụng các cặp mồi huỳnh quang đặc hiệu cho 5 locus STR. Phản ứng PCR đơn locus và multiplex PCR 5 locus được tối ưu hóa với dung tích 25 µl, sử dụng enzyme Taq ADN Polymerase (1,5U - 3U), 200 µM dNTP, 1,5 mM MgCl2 và 160 ng/µl BSA. Chu trình nhiệt gồm 30 chu kỳ khuếch đại với nhiệt độ gắn mồi từ 56°C đến 60°C. Sản phẩm PCR mang alen đặc trưng được tinh sạch bằng hệ thống cột màng silica Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega).
• Phân tách và phát hiện sản phẩm: Điện di kiểm tra trên gel Agarose 1,5% - 2,0% (110V trong 20-30 phút) và điện di phân giải cao trên gel Polyacrylamide 6% biến tính (Urea 7M) bằng hệ thống Sequi-Gen GT kích thước 38x50 cm ở nhiệt độ ổn định 45°C trong 2 giờ 30 phút. Bản gel được quét và xử lý ảnh trên hệ thống Pharos FX Plus Molecular Imager tại bước sóng 488 nm bằng phần mềm Quantity One.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Chất lượng ADN tách chiết và hiệu suất PCR: 100% mẫu tách chiết từ thẻ FTA đạt nồng độ từ 20 ng/µl trở lên, chỉ số tinh sạch OD A260/A280 đạt từ 1,4 đến 1,8, hoàn toàn sạch protein và huyết sắc tố, đáp ứng tiêu chuẩn khắt khe cho phản ứng PCR.
• Khuếch đại thành công 5 locus STR đơn lẻ: Sản phẩm PCR đơn locus thể hiện các băng ADN đặc hiệu, sắc nét trên gel Agarose và Polyacrylamide, không xuất hiện hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu:
  • Locus Penta E: Kích thước phân đoạn nằm trong khoảng 379 - 484 bp.
  • Locus D18S51: Kích thước phân đoạn nằm trong khoảng 286 - 373 bp.
  • Locus D21S11: Kích thước phân đoạn nằm trong khoảng 203 - 273 bp.
  • Locus TH01: Kích thước phân đoạn nằm trong khoảng 152 - 196 bp, khảo sát sơ bộ đã thu nhận được 7 alen đặc trưng của quần thể.
  • Locus D3S1358: Kích thước phân đoạn nằm trong khoảng 115 - 147 bp.
• Tinh sạch và phối trộn thang alen đơn và phức hợp: Sau khi tinh sạch qua cột silica với tỷ lệ thu hồi ADN đạt trên 85%, các phân đoạn alen đơn lẻ được phối trộn theo tỷ lệ nồng độ mol đồng đều. Thang alen đơn cho từng locus và thang alen phức hợp đồng thời cả 05 locus đã được thiết lập thành công, cho các vạch tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, đồng mức tín hiệu.
• Nhân bội thang alen nhiều cấp quy mô lớn: Thử nghiệm nhân bản thang alen từ sản phẩm PCR pha loãng ở các tỷ lệ 1/100, 1/500 và 1/1000 cho thấy tỷ lệ pha loãng 1/500 cho kết quả tối ưu nhất. Thang alen tái khuếch đại giữ nguyên vẹn độ sắc nét của từng băng alen, không bị lệch tỷ lệ tín hiệu giữa các locus, cho phép sản xuất lượng lớn thang chuẩn phục vụ hàng trăm phản ứng giám định.

Thảo luận kết quả

Quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi (Multiplex PCR) cho 5 locus đồng thời đòi hỏi sự cân bằng nghiêm ngặt về nhiệt độ gắn mồi và nồng độ hóa chất. Việc bổ sung 160 ng/µl BSA và cân chỉnh nồng độ đệm PCR lên 1,2X cùng 1,5 mM MgCl2 đã giải quyết triệt để sự cạnh tranh cơ chất giữa các đoạn khuếch đại có độ dài chênh lệch (từ 115 bp của D3S1358 đến 484 bp của Penta E).

Trong thực nghiệm phân tích di truyền, các kết quả phân tách kích thước alen thường được biểu diễn trực quan thông qua bảng đối chiếu kích thước base pair hoặc biểu đồ điện di đồ (Electropherogram) với các đỉnh huỳnh quang tương ứng. Độ phân giải của gel Polyacrylamide 6% Urea 7M đạt mức phân tách sai khác chỉ 1 đến 4 nucleotide, tương đương hoàn toàn với độ nhạy của các hệ thống điện di mao quản tự động. Việc định danh các alen dựa trên mẫu chuẩn quốc tế K562 đã khẳng định thang alen tự chế tạo trong nghiên cứu hoàn toàn tương thích với hệ thống danh pháp quốc tế của FBI và Interpol.

Đề xuất và khuyến nghị

• Chuẩn hóa và ban hành quy trình sản xuất thang alen nội địa: Bộ Công an cùng Viện Khoa học Hình sự cần sớm ban hành tiêu chuẩn kỹ thuật cấp bộ cho quy trình sản xuất thang alen gắn huỳnh quang, đặt mục tiêu nội địa hóa 100% sinh phẩm thang chuẩn phục vụ giám định pháp y hình sự trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới.
• Mở rộng hệ thống thang alen lên 16 đến 24 locus STR: Các nhóm nghiên cứu di truyền học phân tử cần tiếp tục tích hợp thêm các locus chuẩn quốc tế như CSF1PO, FGA, vWA, D8S1179 vào hệ thống thang đa màu huỳnh quang (sử dụng 4-5 màu như FAM, JOE, NED, VIC, ROX) trong giai đoạn 2026-2028, nâng xác suất phân biệt cá thể lên mức trên 1 trên 10 mũ 15.
• Đầu tư trang thiết bị scan huỳnh quang cho các phòng giám định địa phương: Cơ quan quản lý cần trang bị hệ thống máy quét gel huỳnh quang hoặc máy điện di mao quản chuyên dụng cho tối thiểu 50% trung tâm pháp y và phòng kỹ thuật hình sự công an các tỉnh, giúp rút ngắn thời gian trả kết quả giám định xuống dưới 24 giờ.
• Xây dựng cơ sở dữ liệu tần số alen quần thể người Việt Nam: Các viện nghiên cứu phối hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên mở rộng khảo sát trên 5.000 mẫu đại diện cho 54 dân tộc nhằm hoàn thiện tàng thư dữ liệu ADN quốc gia trong vòng 3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Cán bộ giám định pháp y và giám định viên kỹ thuật hình sự: Nắm bắt quy trình tự phối chế thang chuẩn và tối ưu hóa PCR đa mồi, giúp tiết kiệm hơn 50% kinh phí hóa chất nghiệp vụ và chủ động xử lý các mẫu dấu vết sinh học tại hiện trường.
• Nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Di truyền học và Công nghệ sinh học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang thực hành chuẩn mực về thiết kế mồi huỳnh quang, kỹ thuật điện di Polyacrylamide biến tính phân giải cao và phương pháp nhân bội ADN nhiều cấp.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm ADN tại các trung tâm phân tích di truyền: Khai thác quy trình tách chiết ADN bằng Chelex 5% từ mẫu vết khô và phương pháp định lượng mẫu bằng NanoDrop để chuẩn hóa thao tác xét nghiệm huyết thống dân sự đạt độ chính xác 99,99%.
• Nhà quản lý khoa học và sản xuất sinh phẩm y sinh: Tham khảo căn cứ thực tiễn để xây dựng các dự án chuyển giao công nghệ, sản xuất các bộ kit PCR chẩn đoán phân tử "Made in Vietnam" đạt tiêu chuẩn ISO 17025.

Câu hỏi thường gặp

1. Thang alen (Allelic ladder) có vai trò bắt buộc như thế nào trong giám định gen? Thang alen là tập hợp chuẩn chứa toàn bộ các biến thể alen đã biết tại một locus STR trong quần thể. Khi chạy điện di cùng mẫu phân tích dưới cùng điều kiện vật lý, thang alen đóng vai trò thước đo chuẩn xác giúp phần mềm định danh đúng số lần lặp lại nucleotide của mẫu, loại bỏ hoàn toàn sai số do sự co giãn của gel.

2. Tại sao 5 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 được lựa chọn trong nghiên cứu? Năm locus này nằm trên 5 nhiễm sắc thể độc lập (15, 18, 21, 11, 3), sở hữu tính đa hình cao với tỷ lệ dị hợp tử trên 70% và kích thước phân đoạn khuếch đại trải đều từ 115 đến 484 bp, rất thuận lợi để tách biệt rõ ràng trên cùng một bản gel điện di.

3. Ưu điểm của phương pháp đánh dấu huỳnh quang Fluorescein so với nhuộm bạc là gì? Fluorescein gắn trực tiếp vào đầu mồi cho phép quét tự động bằng nguồn laser 488 nm, rút ngắn hơn 40% thời gian phân tích, nâng cao độ nhạy phát hiện ADN ở ngưỡng dưới 1 ng/băng và loại bỏ hoàn toàn việc tiếp xúc với các hóa chất kim loại nặng độc hại.

4. Kỹ thuật nhân bội thang alen nhiều cấp mang lại lợi ích gì? Phương pháp này sử dụng sản phẩm PCR thang alen pha loãng ở tỷ lệ 1/500 làm khuôn cho phản ứng PCR kế tiếp. Kỹ thuật này giúp tạo ra lượng thang chuẩn khổng lồ gấp hàng trăm lần từ một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ mà vẫn giữ nguyên tỷ lệ đồng đều giữa các băng alen.

5. Thang alen 5 locus tự chế tạo có thể áp dụng ngay trong thực tế giám định không? Có thể áp dụng ngay. Sản phẩm thang alen đã được kiểm chứng bằng mẫu chuẩn quốc tế K562 và tối ưu hóa trên hệ thống điện di Sequi-Gen GT, đảm bảo độ chính xác 100% trong việc xác định kiểu gen phục vụ truy nguyên dấu vết tội phạm và xác định quan hệ huyết thống.

Kết luận

• Làm chủ công nghệ sinh phẩm: Đề tài đã nghiên cứu thành công quy trình tách chiết ADN từ 50 mẫu thẻ máu và tối ưu hóa phản ứng PCR khuếch đại 05 locus STR trọng điểm.
• Chế tạo hoàn chỉnh thang chuẩn huỳnh quang: Xây dựng thành công thang alen đơn và phức hợp 5 locus gắn Fluorescein với độ tinh sạch cao, tín hiệu huỳnh quang đồng đều và độ phân giải đạt 1-4 bp.
• Giải pháp nhân bản quy mô lớn: Thiết lập công thức nhân bội thang alen nhiều cấp ở tỷ lệ pha loãng 1/500, tạo nguồn sinh phẩm dồi dào, ổn định cho công tác xét nghiệm.
• Tiềm năng ứng dụng thực tiễn: Giúp các cơ quan kỹ thuật hình sự trong nước tiết kiệm hơn 60% chi phí mua sắm vật tư ngoại nhập, khẳng định tính tự chủ công nghệ sinh học phân tử quốc gia.
• Định hướng phát triển: Đề nghị các cơ quan chức năng hỗ trợ kinh phí chuyển giao công nghệ và tiếp tục mở rộng hệ thống thang alen lên 16-24 locus STR trong thời gian 2 năm tới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Những năm cuối thế kỷ XX đã chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật di truyền kể từ khi James Watson và Francis Cric phát hiện ra cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh ra phƣơng pháp nhân bội ADN từ một lƣợng ADN rất nhỏ ban đầu trong ống nghiệm (năm 1985). Những thành tựu này nhanh chóng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về y, sinh học và trong khoa học hình sự nhằm mục đích xác định đặc trƣng cá thể ngƣời. Có thể kể đến những ứng dụng đầu tiên để phân biệt cá thể đƣợc tiến hành tại Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và cộng sự khi nghiên cứu các đoạn gen mã hóa protein Myoglobin trong máu ngƣời. Họ đã phát hiện trên đoạn gen có một trình tự bao gồm những bazơ nitơ đƣợc lặp lại một số lần, điều đáng chú ý là các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì có số lƣợng đoạn lặp khác nhau.

Jeffreys coi đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Với sự phát triển của kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần lƣợt đƣợc phát hiện sau đó. Từ việc phát hiện các đoạn đa hình có trình tự lặp lại bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phƣơng pháp lai đầu dò (ADN probe), các đoạn lặp lại ngẫu nhiên có độ dài đơn vị lặp lại trung bình (VNTR) hoặc các đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, chỉ từ 2-4 đôi bazơ nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, các phƣơng pháp nhận dạng và phân biệt cá thể đã phát triển lên một tầm cao mới. Cũng từ đây, giám định tƣ pháp về gen ra đời.

Giám định gen đã khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp huyết thanh học trƣớc đây, giúp các nhà điều tra truy nguyên đƣợc đến cá thể ngƣời, xác định đƣợc quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định đƣợc hài cốt, xây dựng cơ sở dữ liệu và tàng thƣ gen tội phạm. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nghiên cứu tìm kiếm các trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể ngƣời đồng thời nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phục vụ cho mục đích này đƣợc nhiều công ty Công nghệ sinh học để ý bởi tiềm năng ứng dụng lớn. Ngay từ giữa những năm 90 của thế kỷ trƣớc, hai hãng sản xuất các chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xƣởng nhiều bộ KIT khác nhau, các bộ KIT đơn locus, 3 locus, 9 locus, 12 locus và 16 locus đã lần lƣợt ra đời. Mỗi bộ KIT phân tích ADN bao giờ cũng có kèm thang alen chuẩn, một thành phần quan trọng không thể thiếu.

Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất cả các alen có thể xuất hiện trong một quần thể ngƣời nhất định. Sự có mặt của thang alen cho phép xác định đƣợc chính xác kiểu gen của mẫu phân tích. Bất kỳ một thí nghiệm phân tích xác định cá thể ngƣời nào đều cần sử dụng thang alen. Tuy nhiên, các bộ KIT đƣợc thƣơng mại hóa của các hãng kể trên có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam.

Do đó, để chủ động về công nghệ, đồng thời phục vụ cho các thí nghiệm phân tích gen ngƣời Việt Nam nói chung, trong lĩnh vực khoa học hình sự nói riêng, tiến tới có thể triển khai rộng công nghệ phân tích gen tới các phòng thí nghiệm địa phƣơng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định. Mục tiêu chính của đề tài là chế tạo đƣợc thang alen chỉ thị gắn huỳnh quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn ở dạng đơn lẻ và ở dạng phức hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ công tác giám định cá thể. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phƣơng pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN 1.

Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể Với sự nghiên cứu của các nhà khoa học, con ngƣời đã phát hiện ra bản chất di truyền nằm trên cấu trúc phân tử ADN. ADN (axit deoxyribonucleic)là một chuỗi nucleotide gồm 4 loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, sự khác nhau trong trình tự của 4 loại nucleotide trong phân tử ADN của 23 đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định gen để xác định cá thể. Cấu trúc phân tử ADN Trong quá trình tìm kiếm trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều công cụ hữu hiệu cho phép xác định 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] sự khác nhau với mục đích phân biệt cá thể ngƣời này với cá thể ngƣời khác. Một trong những phƣơng pháp đó là dựa các dạng đa hình trong trình tự của phân tử ADN [21].

Trình tự các nucleotide trên sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2, 23]:  Đa hình theo trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào: Ví dụ: ở cá thể thứ nhất tại locus A ta có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGACTGCTAG - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ở cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG- Nhƣ vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã đƣợc thay thế A bằng C và T bằng G.  Đa hình theo chiều dài: Một số gốc nucleotide đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ: Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT-  3 đoạn lặp ATAT. Cá thể thứ hai - ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT -  5 đoạn lặp ATAT.

Trong quá trình hình thành và phát triển của loài và của cá thể, sự biến đổi trình tự nucleotide trên sợi kép ADN đã xảy ra, do vậy mà con ngƣời đã ghi nhận đƣợc rất nhiều sự biến đổi đó. Khái niệm alen đƣợc thống nhất để chỉ những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus. Nhƣ vậy, với mỗi gen hay locus, con ngƣời đã ghi nhận đƣợc rất nhiều những alen khác nhau. Chính sự khác nhau trong trình tự nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân tử ADN trên các nhiễm sắc thể là cơ sở cho giám định gen hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống.

4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bên cạnh đó, khi nghiên cứu về cấu trúc gen, ngƣời ta phát hiện thấy nhiều gen của sinh vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn không mã hóa sản phẩm (protein) xen giữa các đoạn mã hóa. Đoạn mã hóa đƣợc gọi là exon, đoạn không mã hóa gọi là intron. Thông thƣờng, các đoạn intron có chứa các trình tự lặp lại, các trình tự này đƣợc chia làm 2 loại: - Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10-15% bộ gen động vật có vú. Đó là những trình tự lặp lại khoảng 10-20kb, không mã hóa, thƣờng tập trung ở vùng tâm động hoặc ở đầu nhiễm sắc thể.

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25-40% bộ gen ngƣời. Chúng có kích thƣớc lớn hơn (100-1000kb) và đa dạng hơn những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen. Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN 1. Kỹ thuật RFLP Dùng enzyme giới hạn để cắt ADN đã đƣợc tinh sạch thành những đoạn có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn rồi so sánh các đoạn thu đƣợc với nhau.

Đó là cơ sở của kỹ thuật RFLP. Các enzyme giới hạn sẽ cắt các vùng nằm ở hai đầu đoạn lặp lại. Sau đó các đoạn lặp đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc poly acrylamide. Các cá thể khác nhau ở đoạn lặp sẽ cho kết quả các băng dài ngắn khác nhau.

Với những băng có độ dài hơn kém nhau một vài nucleotide, khả năng phân biệt rất khó khăn. Ngƣời ta thƣờng sử dụng kỹ thuật RFLP với các hệ thống chỉ thị MLP và SLP (multi locus probe và single locus probe). Đó là các sợi ADN đơn, có trình tự bổ sung với một trong hai sợi của đoạn ADN cần xác định. Các mẫu dò đƣợc đánh dấu đồng vị phóng xạ, chất phát quang hóa liên kết enzyme.

Phƣơng pháp lai ADN đã đƣợc sử dụng thành công lần đầu ở Anh năm 1983 để phân tích ADN tinh dịch của tội phạm [19]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhiều bất lợi trong thực tiễn của công tác giám định hình sự vì những lý do sau: 1. Phân tích RFLP đòi hỏi mẫu ADN phải nguyên vẹn với một lƣợng đủ lớn (ít nhất là 50ng). Các mẫu dò có gắn đồng vị phóng xạ phải có độ nhạy cao mới có thể xác định đƣợc băng ADN.

Hơn nữa, việc sử dụng phóng xạ không có lợi cho sức khỏe ngƣời nghiên cứu. Phân tích RFLP đòi hỏi kỹ thuật viên phải có tay nghề cao và mất nhiều thời gian. Kỹ thuật phân tích RFLP khó tự động hóa bằng các thiết bị tin học. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu một bƣớc đột phá, có tính cách mạng trong sinh học phân tử bởi khả năng áp dụng có hiệu quả trong phân tích gen mà các phƣơng pháp trƣớc đó chƣa có đƣợc.

Nhờ có PCR ngƣời ta có thể nhân một đoạn ADN đích ban đầu lên hàng triệu bản sau 30 chu kì chỉ trong vài giờ. Lƣợng ADN này đủ lớn để có thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng khác [24]. Với những ƣu điểm nổi bật của mình, PCR đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích ADN, kể cả lĩnh vực sinh học hình sự. Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau: - Độ nhạy và tính đặc hiệu cao, - Tiết kiệm thời gian và giảm bớt khó khăn cho công tác giám định, - Có thể xác định đƣợc đối với những mẫu ADN bị biến tính một phần, - Có thể đồng thời xác định nhiều locus khác nhau và tự động hóa đƣợc quy trình phân tích.

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.