Luận văn thạc sĩ về xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống dây thìa canh Gymnema Sylvestre

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu adn mã vạch và nhân giống dây thìa canh gymnema sylvestre bằng phương pháp, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Đào Thị Thúy Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Việt
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Xây Dựng Cơ Sở Dữ Liệu ADN Mã Vạch Và Nhân Giống Dây Thìa Canh Gymnema Sylvestre Bằng Nuôi Cấy In Vitro
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sỹ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Chi Gymnema
• 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema
• 1.1.2. Các loài thuộc chi Gymnema
• 1.1.3. Các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam
• 1.2. Giới thiệu chung về cây Dây thìa canh
• 1.2.1. Nguồn gốc, phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Dây thìa canh
• 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào
• 1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
• 1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
• 1.3.3. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu và Dây thìa canh
• 1.3.3.1. Nghiên cứu trong nước
• 1.4. Tổng quan về mã vạch ADN
• 1.4.1. Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode)
• 1.4.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật
• 1.4.3. Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN ở thực vật
• 2. Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu tổng quát
• 2.2. Mục tiêu cụ thể
• 2.3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
• 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1.1. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá
• 2.4.1.2. Phương pháp theo dõi
• 2.4.1.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.5. Địa điểm và thời gian bố trí thí nghiệm
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cây Dây thìa canh
• 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
• 3.1.2. Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN
• 3.1.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các đoạn mồi khác nhau
• 3.2. Kết quả nhân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
• 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi
• 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi
• 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi
• 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
• 3.2.5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ
• 3.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ
• KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ADN mã vạch và Gymnema Sylvestre

Nghiên cứu về ADN mã vạch và Gymnema Sylvestre đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Dây thìa canh không chỉ là một loại dược liệu quý mà còn có giá trị kinh tế cao. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài này sẽ giúp xác định chính xác nguồn gốc và bảo tồn giống cây. Nghiên cứu này không chỉ mang lại lợi ích cho ngành dược mà còn cho nông nghiệp bền vững.

1.1. Giới thiệu về ADN mã vạch và ứng dụng

ADN mã vạch là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định loài và phân loại sinh vật. Phương pháp này sử dụng các đoạn ADN ngắn để nhận diện các loài khác nhau, giúp các nhà khoa học trong việc nghiên cứu đa dạng sinh học.

1.2. Đặc điểm và giá trị của Gymnema Sylvestre

Gymnema Sylvestre, hay còn gọi là dây thìa canh, là một loại cây có nhiều hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe. Cây này được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đường và các vấn đề tiêu hóa.

II. Thách thức trong việc bảo tồn và nhân giống Gymnema Sylvestre

Sự suy giảm số lượng và chất lượng của Gymnema Sylvestre trong tự nhiên đang là một thách thức lớn. Việc khai thác quá mức và điều kiện môi trường bất lợi đã dẫn đến tình trạng này. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp nhân giống là rất cần thiết để bảo tồn giống cây quý này.

2.1. Nguyên nhân suy giảm số lượng Gymnema Sylvestre

Các yếu tố như khai thác quá mức, biến đổi khí hậu và ô nhiễm môi trường đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của dây thìa canh. Việc hiểu rõ nguyên nhân này là cần thiết để có biện pháp bảo tồn hiệu quả.

2.2. Những thách thức trong nhân giống truyền thống

Phương pháp nhân giống truyền thống như gieo hạt và giâm hom có nhiều hạn chế, bao gồm tỷ lệ sống thấp và thời gian dài để phát triển. Điều này làm giảm khả năng cung cấp giống cây cho thị trường.

III. Phương pháp nuôi cấy in vitro trong nhân giống Gymnema Sylvestre

Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được chứng minh là một giải pháp hiệu quả để nhân giống Gymnema Sylvestre. Kỹ thuật này cho phép tạo ra số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, đồng thời đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất của giống cây.

3.1. Quy trình nuôi cấy mô tế bào

Quy trình nuôi cấy mô tế bào bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khử trùng và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo mẫu không bị nhiễm khuẩn.

3.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy cần được tối ưu hóa với các chất điều tiết sinh trưởng như auxin và cytokinin. Tỷ lệ giữa các chất này sẽ ảnh hưởng đến khả năng phát triển của mô nuôi cấy.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp nuôi cấy in vitro đã thành công trong việc nhân giống Gymnema Sylvestre. Số lượng cây giống đạt tiêu chuẩn đã được tạo ra, mở ra cơ hội cho việc phát triển bền vững loài cây này trong tương lai.

4.1. Kết quả tách chiết ADN mã vạch

Quá trình tách chiết ADN mã vạch từ mẫu cây đã cho kết quả khả quan, giúp xác định chính xác loài và nguồn gốc của dây thìa canh. Điều này hỗ trợ trong việc bảo tồn và phát triển giống cây.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất dược liệu

Việc nhân giống thành công sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho ngành dược liệu. Điều này không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về ADN mã vạch và nhân giống Gymnema Sylvestre bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã mở ra nhiều cơ hội mới. Việc bảo tồn và phát triển giống cây này là cần thiết để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường dược liệu.

5.1. Tầm quan trọng của bảo tồn giống cây

Bảo tồn giống cây không chỉ giúp duy trì đa dạng sinh học mà còn đảm bảo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp dược phẩm và thực phẩm.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và phát triển các phương pháp mới để nâng cao hiệu quả nhân giống và bảo tồn giống cây.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) được đánh giá là một trong những cây dược liệu quan trọng trong chiến lược phát triển thảo dược ở Việt Nam. Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học chính của dây thìa canh là axit gymnemic, một hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid. Ngoài ra, Dây thìa canh còn chứa các thành phần khác như flavone, anthraquinone, hentri- acontane, pentatriacontane, α và β-chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol. Axit gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào beta của tuyến tụy, giúp cơ thể tái thiết lập được khả năng cân bằng đường huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đường ở ruột; ức chế gan tân tạo glucose vào máu, đồng thời kích thích các enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đường tại các mô cơ.

Lá dây thìa canh được sử dụng rộng rãi trong điều trị đái tháo đường và thuốc lợi tiểu trên khắp thế giới, đặc biệt tại Ấn Độ, Việt Nam và một số nước khác. Một số hợp chất hoạt tính sinh học đã được phân lập từ thảo dược để chữa bệnh tiểu đường. Ngoài ra có thể sử dụng chống đầy hơi khó tiêu, táo bón, vàng da, bệnh trĩ, bệnh tim, hen suyễn, viêm phế quản. Hiện nay nhu cầu của con người về nguồn dược liệu trên ngày càng tăng, tuy nhiên loài cây này trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống và bảo tồn là rất cần thiết, cấp bách đối với việc lưu giữ nguồn gen quý này.

Mã vạch ADN là những đoạn ADN ngắn, nằm trong hệ gen (nhân, lục lạp và ty thể) đặc trưng của mỗi loài sinh vật. Do đó việc xác định loài bằng mã vạch ADN có độ chính xác rất cao. Phương pháp này trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài. 2 Dây thìa canh có thể được nhân giống bằng các phương pháp, gieo hạt và giâm hom, những biện pháp nhân giống này đều có những ưu điểm nhất định nhưng không tránh khỏi những nhược điểm như cây sinh trưởng không đồng đều, hệ số nhân thấp, phụ thuộc mùa vụ v.

Để giải quyết những nhược điểm trên, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã rút ngắn được thời gian và cho phép nhân nhanh để tạo được số lượng rất lớn cây giống Dây thìa canh trong thời gian ngắn, vẫn đảm bảo hàm lượng hoạt chất ổn định, không nhiễm bệnh, ưu việt hơn so với các phương pháp truyền thống trên. Với mục tiêu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Dây thìa canh nhằm xác định đúng loài cây phục vụ bảo tồn và phát triển cây dược liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về Chi Gymnema Lịch sử phân loại chi Gymnema gắn liền với lịch sử quan điểm phân loại của hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và họ Trúc đào (Apocynaceae).

Trong đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điển, chi Gymnema được xếp trong họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [52], [58]. Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại công bố năm 2009, Takhtajan đã theo quan điểm của Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress & Bruyns (2000) và Endress & Stevins (2001) để gộp Apocynaceae và Asclepiadaceae thành một họ duy nhất, và Gymnema trở thành một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae [47]. Cho đến nay quan điểm này được thừa nhận rộng rãi trong các hệ thống phân loại quốc tế [59]. Vị trí phân loại của chi Gymnema Theo thực vật chí Hệ thống của Bậc phân loại Trung Quốc [2], [52] Takhtajan (2009) [47] Ngành Magnoliophyta Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Magnoliopsida Phân lớp Lamiidae Lamiidae Bộ Gentianales Gentianales Họ Asclepiadaceae Apocynaceae Phân họ Asclepiadoideae Chi Gymnema Gymnema 1.

Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema Các loài thuộc chi Gymnema là cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm. Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến.

Tràng hình 4 bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải. Tràng phụ đơn,vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy; cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [14], [52].

Phân bố của chi Gymnema khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến Australia, châu Á. Các loài thuộc chi Gymnema Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67%), và 18 tên chưa xác định được chính xác thông tin (15%) [58]. Dưới đây là 52 loài thuộc chi Gymnema đã được chấp nhận theo “The plant list” [58]. Gymnema acuminatum Wall.

Gymnema albidum Decne.Rahman & Gymnema albiflorum Costantin Wilcock. Gymnema brevifolium Benth. Gymnema macrothyrsa Warb. Gymnema calycinum Schltr.

Gymnema maingayi Hook. Gymnema chalmersii Schltr. Gymnema mariae Schltr. Gymnema cumingii Schltr.

Gymnema micradenium Benth. Gymnema cuspidatum (Thunb.) Kuntze Gymnema molle Wall. Gymnema decaisneanum Wight Gymnema montanum Hook. Gymnema dissitiflorum Ridl.

Gymnema montanum var. beddomei Gymnema dunnii (Maiden & Betche) Hook. Gymnema muelleri Benth. Gymnema elegans Wight & Arn.

Gymnema pachyglossum Schltr. Gymnema erianthum Decne. Gymnema piperii Schltr. Gymnema foetidum Tsiang.

5 Gymnema glabrum Wight. Gymnema recurvifolium Blume. Gymnema griffithii Craib. Gymnema rotundatum Thwaites.

Gymnema hainanense Tsiang. Gymnema rufescens Decne. Gymnema hirtum Ridl. Gymnema schlechterianum Warb.

Gymnema inodorum (Lour. Gymnema spirei Costantin. Gymnema javanicum Koord. Gymnema khandalense Santapau.

Gymnema sylvestre (Retz. & Gymnema syringaefolium (Decne. Gymnema lacei Craib. Gymnema thorelii Costantin.

Gymnema tricholepis Schltr. Gymnema latifolium Wall. Gymnema littorale Blume. Gymnema uncarioides Schltr.

Gymnema yunnanense Tsiang 1. Các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam Tổng hợp thông tin các tài liệu thực vật trong nước của tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000), Võ Văn Chi (2004) [3] và Trần Thế Bách (2007) [4], đồng thời với địa điểm thu mẫu của các nghiên cứu liên quan đến chi Gymnema, một số loài thuộc chi Gymnema phân bố ở Việt Nam sẽ được liệt kê trong bảng 1.2 với tên chính thức đã được đối chiếu theo hệ thống danh pháp quốc tế. Các loài trong chi Gymnema ở Việt Nam TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố TLTK Gymnema albiflorum Bát Bạc 1 Lõa ti hoa trắng [4] Cost. Deene Lõa ti không mùi, Lõa Cạn, Thái Nguyên, Hòa [1], [2], [4], 2 (Tên khác: Gymnema ti nhuộm, Rau mỏ, Bình, Vĩnh Phúc [13], tingens (Roxb.) Dây thìa canh lá to - Rộng khắp trên đất rừng, [14] Sprengel cạnh suối và lùm bụi 6 TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố TLTK Hà Sơn Bình,Hòa Bình, Gymnema latifolium Dây thìa canh lá to, Ninh Bình, Kom Tum,Thái [1], [4], [13], 3 Wall.

ex Wight Lõa ti lá rộng Nguyên, Tuyên Quang, Gia [14] Lai, Tây Ninh. Gymnema Kiên Giang, Kom Tum, Gia 4 Lõa ti Nam Vân [1], [13], [14] yunnanense Tsiang Lai, Đăk Lăk Gymnema Lõa ti mạng, 5 reticulatum Dây thìa canh gân Núi Dinh, Tuyên Quang [1], [2], [4] (Moon) Alst. ) mạng Hà Bắc, Sầm Sơn, Thanh Hóa,Quảng Trị,Quảng Ninh, Gymnema sylvestre Dây thìa canh, dây Phú Yên, Vĩnh Phúc, Nam [1], [2], [4], 6 (Retz) R. Ex muôi, Lõa ti rừng Định, Quảng Trị, Khánh [13], [14] Schult Hòa, Quảng Nam Bờ bụi, hàng rào 1.

Giới thiệu chung về cây Dây thìa canh 1. Nguồn gốc, phân loại Dây thìa canh hay còn gọi là Dây muôi, với danh pháp khoa học là Gymnema sylvetre (Retz), chi Lõa ti (Gymnema), họ Thiên lý (Asclepiada ceae), ở Việt Nam, chi Lõa ti (Gymnema) có khoảng 8 loài [16],[36],[37]. Cây thường mọc trong các bờ bụi, hàng rào tại một số nơi ở miền Bắc Việt Nam từ Hải Hưng, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum,…Ngoài ra, còn phân bố ở Trung Quốc, Ấn độ, Inđonexia. Đặc điểm thực vật học của cây Dây thìa canh Dây leo, cao từ 3 - 5 m; thân non màu xanh, phủ lông mịn, thân già màu nâu; có lỗ vỏ, đường kính lỗ vỏ từ 0,5 - 1 mm.

Toàn cây có nhựa mủ màu trắng hay hơi vàng. Lá mọc đối, cuống dài 3 - 5 mm; đường kính cuống lá 2 - 3 mm; phiến lá hình bầu dục hoặc trứng hay trứng ngược, chiều dài lá 6 - 7 cm và 7 rộng 2,5 - 5 cm, mép nguyên; có 4 - 6 cặp gân phụ, rõ ở mặt dưới. Hoa nhỏ màu trắng hơi vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá. Có 5 lá đài, các thuỳ dài 1 mm, có lông mịn và rìa lông.

Tràng 5, dính nhau thành ống, dài 1,8 - 2 mm, mặt ngoài nhẵn; tràng phụ gắn với tràng, có 5 răng, dính với họng tràng. Cột nhị nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5 mm, rộng 0,8 - 1 mm. Bộ nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm hai thùy, dài khoảng 0,2 mm, liên kết với nhau nhờ trung đới màu vàng nâu. Bộ nhụy có vòi với đầu rộng hình nón vượt quá bao phấn.

Quả đại dài 5 - 6 cm, rộng ở dưới, đường kính chỗ lớn nhất khoảng 1,5 cm. Hạt dẹp, dài 3 mm, có mào lông màu trắng, dài khoảng 3 - 3,5 cm, thường có khoảng 40 hạt trong một quả [16],[36],[37]. cành mang hoa: 2. đài mở với các tuyến: 4.

cột nhị nhụy: 5. cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium): 7. hạt (hình theo Tsiang & Li. Gymnema sylvestre (Retz.

Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây [15] đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [11].