Nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của virus PRRS 04 gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Luận văn thạc sĩ phân tích vnua nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội chứng, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Hà Văn Thịnh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY - PRRS - 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN
• 3.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 3.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PRRS 04 và ảnh hưởng đến lợn

Virus PRRS 04, một trong những chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn, đã trở thành mối đe dọa lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Virus này có khả năng gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe và năng suất sinh sản của lợn. Nghiên cứu về virus PRRS 04 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của virus mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PRRS 04

Virus PRRS 04 thuộc nhóm virus RNA, có khả năng gây bệnh cao và dễ lây lan. Đặc điểm sinh học của virus này bao gồm khả năng tấn công vào tế bào đại thực bào, dẫn đến suy giảm miễn dịch ở lợn. Điều này tạo điều kiện cho các loại virus và vi khuẩn khác tấn công, gây ra nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi.

1.2. Tác động của virus PRRS đến sức khỏe lợn

Virus PRRS 04 gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng như sảy thai, chậm động dục, và giảm số lượng lợn con sinh ra. Những tác động này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của lợn mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát virus PRRS

Việc kiểm soát virus PRRS 04 gặp nhiều thách thức do tính biến đổi cao của virus. Các chủng virus khác nhau có thể gây ra các triệu chứng khác nhau, làm cho việc chẩn đoán và điều trị trở nên khó khăn. Hơn nữa, sự xuất hiện của các chủng virus mới cũng làm tăng thêm độ phức tạp trong công tác phòng ngừa.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán virus PRRS

Chẩn đoán virus PRRS 04 gặp khó khăn do triệu chứng lâm sàng không rõ ràng và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Việc phát hiện sớm và chính xác virus là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của bệnh.

2.2. Tính biến đổi cao của virus PRRS

Virus PRRS có khả năng đột biến cao, tạo ra nhiều chủng khác nhau với độc lực khác nhau. Điều này làm cho việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa trở nên khó khăn hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu virus PRRS 04 hiệu quả

Để nghiên cứu virus PRRS 04, các phương pháp nuôi cấy trên tế bào Marc-145 và xác định hiệu giá virus TCID50 được sử dụng. Những phương pháp này giúp đánh giá khả năng gây bệnh và đặc tính sinh học của virus một cách chính xác.

3.1. Nuôi cấy virus PRRS trên tế bào Marc 145

Nuôi cấy virus PRRS 04 trên tế bào Marc-145 cho phép nghiên cứu sự phát triển và khả năng gây bệnh của virus. Phương pháp này giúp xác định hiệu giá virus và theo dõi sự biến đổi của virus qua các đời cấy chuyển.

3.2. Xác định hiệu giá virus TCID50

Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 là một trong những cách hiệu quả để đánh giá khả năng gây bệnh của virus PRRS 04. Kết quả từ phương pháp này cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vaccine.

IV. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu virus PRRS 04

Nghiên cứu virus PRRS 04 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của virus mà còn cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong thực tiễn để giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra.

4.1. Phát triển vaccine phòng ngừa virus PRRS

Dựa trên các nghiên cứu về virus PRRS 04, việc phát triển vaccine hiệu quả là rất cần thiết. Vaccine có thể giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn, giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra.

4.2. Các biện pháp phòng ngừa hiệu quả

Ngoài vaccine, các biện pháp phòng ngừa như quản lý chăn nuôi, vệ sinh chuồng trại và kiểm soát dịch bệnh cũng rất quan trọng. Những biện pháp này giúp ngăn chặn sự lây lan của virus PRRS trong đàn lợn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus PRRS 04

Nghiên cứu virus PRRS 04 là một lĩnh vực quan trọng trong ngành thú y. Việc hiểu rõ về virus và các biện pháp phòng ngừa sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi lợn. Tương lai của nghiên cứu này cần tiếp tục được đẩy mạnh để phát triển các giải pháp hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus PRRS

Nghiên cứu virus PRRS 04 không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe lợn mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi. Các kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về tính biến đổi của virus PRRS và phát triển các vaccine mới. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả phòng ngừa và điều trị bệnh cho lợn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), thường được gọi là bệnh Tai xanh, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu gây tổn thất kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê dịch tễ từ Cục Thú y, chỉ riêng đợt bùng phát năm 2010, dịch bệnh đã lan rộng khắp 3 miền khiến hơn 621.000 con lợn mắc bệnh và trên 336.000 con bị chết hoặc phải tiêu hủy bắt buộc. Mặc dù các dòng vắc xin ngoại nhập đã được cấp phép lưu hành, nhưng do đặc tính biến dị di truyền nhanh và tính đa dạng kháng nguyên cao của virus PRRS, hiệu quả bảo hộ thực tế của các sản phẩm thương mại đối với đàn lợn nội địa vẫn còn nhiều hạn chế. Việc chủ động nghiên cứu và lựa chọn các chủng virus phân lập trong nước có đặc tính sinh học ổn định là yêu cầu cấp thiết để phục vụ sản xuất vắc xin đặc hiệu.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Hà Văn Thịnh, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thị Lan tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập trung giải quyết bài toán trọng tâm này. Mục tiêu chính của đề tài là đánh giá toàn diện tính ổn định về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY-PRRS-04 qua 40 đời cấy chuyển liên tục trên môi trường tế bào Marc-145. Đề tài được triển khai từ tháng 9/2015 đến tháng 6/2016 tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi xác lập các chỉ số sinh học định lượng chuẩn xác như hiệu giá virus đạt đỉnh 10^6,74 TCID50/25µl và độ tương đồng nucleotide đoạn gen ORF5 đạt từ 98,15% đến 100%, cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho việc chế tạo vắc xin nhược độc phòng chống dịch tai xanh tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng vi sinh vật học phân tử và miễn dịch học thú y chuyên sâu về virus PRRS thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales.

Thứ nhất, lý thuyết cấu trúc hệ gen phân tích hạt virus dạng hình cầu có màng bọc với kích thước từ 45 nm đến 80 nm, chứa bộ gen RNA chuỗi đơn dương dài khoảng 15 kb gồm 7 khung đọc mở chính từ ORF1 đến ORF7. Trong đó, vùng gen ORF1 chiếm 80% chiều dài hệ gen đảm nhiệm mã hóa enzym sao chép polymerase, còn các vùng ORF2 đến ORF7 mã hóa các protein cấu trúc bề mặt và vỏ bọc.

Thứ hai, lý thuyết miễn dịch kháng nguyên nhấn mạnh vai trò của glycoprotein GP5 được mã hóa bởi đoạn gen ORF5 có kích thước 603 bp (tương ứng 200 axit amin). Đây là protein liên kết vỏ bọc có tính bám dính tế bào đa dạng nhất và chứa các epitope quan trọng nhất kích thích cơ thể vật chủ sản sinh kháng thể trung hòa.

Thứ ba, mô hình sinh bệnh học giải thích cơ chế virus chọn lọc xâm nhập và phá hủy trực tiếp tới 40% đại thực bào phế nang (PAM), làm suy giảm nghiêm trọng hệ miễn dịch tự nhiên của lợn, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn kế phát như Streptococcus suis hay Pasteurella multocida xâm nhập gây viêm phổi cấp tính.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 30 mẫu bệnh phẩm phổi và hạch phổi thu thập từ lợn nghi mắc bệnh tại ổ dịch Bắc Giang năm 2014. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được thực hiện dựa trên các chỉ tiêu chẩn đoán lâm sàng của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), phân bố đồng đều trên 5 nhóm đối tượng: 10 lợn con theo mẹ, 7 lợn sau cai sữa, 6 lợn choai, 4 nái mang thai và 3 nái nuôi con.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích RT-PCR và giải trình tự gen trực tiếp là nhằm đảm bảo độ nhạy, độ chính xác cao trong việc xác định sự hiện diện của virus PRRS, đồng thời kiểm tra loại trừ khả năng tạp nhiễm với 4 mầm bệnh phổ biến gồm dịch tả lợn cổ điển (CSFV), lở mồm long móng (FMDV), tiêu chảy thành dịch (PEDV) và viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV).

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa qua các bước:

• Nuôi cấy chủng KTY-PRRS-04 qua 40 đời cấy chuyển (từ P0 đến P40) trên dòng tế bào Marc-145 trong môi trường DMEM bổ sung 5% huyết thanh thai bò (FCS) với tỷ lệ đa nhiễm MOI đạt 0,01.
• Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và xác định hiệu giá virus theo phương pháp Behrens-Karber tại các thời điểm từ 24 đến 120 giờ sau gây nhiễm.
• Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kít QIAamp Viral RNA Mini Kit, thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen ORF5 kích thước 603 bp với chu kỳ nhiệt 35 chu kỳ.
• Tinh sạch sản phẩm và giải trình tự tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000, sau đó so sánh trình tự và thiết lập cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA5 trong thời gian nghiên cứu từ 09/2015 đến 06/2016.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã mang lại 4 phát hiện khoa học quan trọng:

Thứ nhất, tỷ lệ mẫu dương tính với virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR trong đàn lợn nghi nhiễm tại Bắc Giang đạt 83,33% (25/30 mẫu). Đáng chú ý, nhóm lợn nái mang thai và nái nuôi con ghi nhận tỷ lệ dương tính tuyệt đối 100%, lợn choai đạt 83,33%, lợn con theo mẹ đạt 80% và lợn sau cai sữa đạt 71,43%. Mẫu virus KTY-PRRS-04 phân lập từ phổi lợn nái được khẳng định âm tính hoàn toàn với các virus CSFV, FMDV, PEDV và TGEV.

Thứ hai, khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng KTY-PRRS-04 trên tế bào Marc-145 thể hiện tính ổn định cao qua các đời cấy chuyển đại diện P0, P10, P20, P30 và P40. Sau 36 giờ gây nhiễm, tế bào bắt đầu co cụm với tỷ lệ hủy hoại đạt 5% đến 10%; sau 48 giờ đạt 40% đến 45%; sau 60 giờ đạt 70% đến 80%; và đến 72 giờ toàn bộ 100% tế bào bị phá hủy, bắt đầu bong tróc khỏi đáy bình nuôi cấy.

Thứ ba, động học nhân lên của virus đạt hiệu giá cực đại tại thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm. Hiệu giá virus trung bình tăng mạnh từ 10^4,23 TCID50/25µl ở 24 giờ lên mức cao nhất là 10^6,74 TCID50/25µl ở 72 giờ (tăng gấp hơn 300 lần về mật độ hạt virus), sau đó suy giảm dần xuống mức 10^3,63 TCID50/25µl ở thời điểm 120 giờ.

Thứ tư, tính ổn định di truyền của đoạn gen ORF5 (kích thước 603 bp mã hóa 200 axit amin) được bảo tồn vượt trội qua 40 thế hệ cấy chuyển. Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các đời đạt từ 98,15% đến 100%, trong khi độ tương đồng về chuỗi axit amin dao động từ 96,88% đến 100%.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng mạnh mẽ của hiệu giá virus và đạt đỉnh ở mốc 72 giờ được giải thích bởi cơ chế nhân lên phụ thuộc mật độ tế bào chủ cảm nhiễm. Tại thời điểm 72 giờ, hầu hết tế bào Marc-145 bị thoái hóa hoàn toàn làm giải phóng tối đa lượng virion tự do vào dịch môi trường. Sau mốc 72 giờ, việc hiệu giá sụt giảm xuống còn 10^3,63 TCID50/25µl tại 120 giờ là do cạn kiệt tế bào sống để virus tiếp tục nhân lên, kết hợp với hiện tượng bất hoạt nhiệt độ tự nhiên của lớp vỏ lipid ở 37°C.

So sánh với các công bố khoa học trong ngành, tốc độ nhân lên của chủng KTY-PRRS-04 đạt đỉnh nhanh hơn so với chủng nhược độc Hanvet1.VN (đạt đỉnh ở 80 đến 96 giờ theo ghi nhận của các nghiên cứu trước đó), nhưng lại tương đồng với đặc tính sinh học của chủng KTY-PRRS-05 khi cấy chuyển trên tế bào Marc-145. Điều này chứng minh chủng KTY-PRRS-04 có khả năng thích ứng tế bào cao và duy trì độc lực nhược hóa ổn định.

Về phương thức trình bày dữ liệu, động học nhân lên của virus được thể hiện trực quan qua đồ thị đường cong sinh trưởng dạng biểu đồ biến thiên hiệu giá Log10 TCID50/25µl theo thời gian từ 24 đến 120 giờ, kết hợp cùng bảng ma trận so sánh các vị trí đột biến nucleotide và chuỗi polypeptide của protein GP5 giữa các thế hệ P0, P10, P20, P30 và P40, giúp minh chứng rõ nét tính ổn định di truyền của chủng nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đạt được, đề tài đưa ra 4 giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình công nghệ thu hoạch sinh khối virus nhược độc ở đúng thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm tế bào Marc-145. Mục tiêu đặt ra là đảm bảo hiệu giá thu hồi đạt mức tối thiểu từ 10^6,5 TCID50/25µl trở lên, do các cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắc xin triển khai áp dụng ngay trong chu kỳ sản xuất tới.

Thứ hai, lựa chọn và sử dụng chủng virus KTY-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển từ P10 đến P30 để xây dựng ngân hàng giống sản xuất vắc xin phòng bệnh PRRS. Các thế hệ này duy trì độ tương đồng di truyền trên 98,15%, loại trừ rủi ro đột biến hoặc biến đổi kháng nguyên, giao cho các Viện nghiên cứu thú y và Trung tâm chẩn đoán thú y quản lý lưu trữ an toàn trong giai đoạn 2026-2027.

Thứ ba, thiết lập quy trình kiểm tra an toàn sinh học định kỳ 100% các lô giống sản xuất bằng kỹ thuật RT-PCR nhằm kiểm soát triệt để nguy cơ tạp nhiễm 4 mầm bệnh CSFV, FMDV, PEDV và TGEV trước khi tiến hành nuôi cấy diện rộng.

Thứ tư, triển khai các thử nghiệm lâm sàng đánh giá độc lực tồn dư và hiệu lực bảo hộ miễn dịch chéo của chủng KTY-PRRS-04 trên đàn lợn thực nghiệm, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ bảo hộ kháng thể trung hòa trên 85% đối với các phân nhóm virus thực địa lưu hành tại Việt Nam trong lộ trình 12 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu học thuật và thực tiễn có giá trị chuyên môn cao đối với 4 nhóm đối tượng sau:

Thứ nhất, các nhà khoa học, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y, Bệnh lý học và Vi sinh vật học: Luận văn cung cấp quy trình bài bản về phương pháp phân lập virus, xác định hiệu giá TCID50 và kỹ thuật giải trình tự phân tích gen ORF5 trên phần mềm chuyên dụng.

Thứ tư, các kỹ sư R&D tại các doanh nghiệp và nhà máy sản xuất vắc xin sinh phẩm thú y: Tài liệu cung cấp thông số thực nghiệm chính xác về mốc thời gian thu hoạch tối ưu 72 giờ và ngưỡng hiệu giá 10^6,74 TCID50/25µl để tối ưu hóa hiệu suất dây chuyền sản xuất vắc xin nhược độc.

Thứ ba, bác sĩ thú y và cán bộ quản lý dịch tễ tại các Chi cục Chăn nuôi và Thú y: Sử dụng dữ liệu về tỷ lệ lây nhiễm bệnh tích lâm sàng và quy trình RT-PCR chẩn đoán phân biệt nhằm nâng cao độ chính xác trong công tác giám sát, khoanh vùng dịch tai xanh tại địa phương.

Thứ tư, các chủ trang trại và nhà quản lý hệ thống chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp: Nắm bắt cơ chế gây hại của virus PRRS (gây sảy thai lên tới 93,75% ở nái mang thai kỳ cuối) để thiết lập hệ thống an toàn sinh học và lộ trình tiêm phòng vắc xin chủ động cho đàn vật nuôi.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng virus KTY-PRRS-04 trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và mang đặc tính gì nổi bật? Chủng KTY-PRRS-04 được phân lập từ mẫu phổi của lợn nái mắc bệnh tại ổ dịch Bắc Giang năm 2014. Chủng virus này có hiệu giá đạt 10^6,74 TCID50/25µl, phát triển tốt trên tế bào Marc-145 và âm tính hoàn toàn với 4 loại mầm bệnh nguy hiểm CSFV, FMDV, PEDV và TGEV.

2. Vì sao thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm là mốc thu hoạch virus tối ưu nhất? Tại thời điểm 72 giờ, 100% tế bào Marc-145 bị phá hủy hoàn toàn giúp giải phóng tối đa hạt virus ra môi trường với hiệu giá đạt đỉnh 10^6,74 TCID50/25µl. Sau 72 giờ, hiệu giá virus sụt giảm mạnh xuống 10^3,63 TCID50/25µl ở 120 giờ do thoái hóa nhiệt độ.

3. Mức độ ổn định di truyền của đoạn gen ORF5 qua 40 đời cấy chuyển được đánh giá như thế nào? Đoạn gen ORF5 dài 603 bp mã hóa 200 axit amin của protein GP5 có độ ổn định rất cao. Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các thế hệ cấy chuyển đạt từ 98,15% đến 100%, và tương đồng về axit amin đạt từ 96,88% đến 100%, chứng minh cấu trúc kháng nguyên không bị biến đổi.

4. Việc kiểm tra tạp nhiễm các loại virus khác trong huyễn dịch giống có ý nghĩa gì đối với sản xuất vắc xin? Kiểm tra bằng RT-PCR khẳng định giống virus không nhiễm CSFV, FMDV, PEDV và TGEV giúp loại trừ hoàn toàn nguy cơ lan truyền mầm bệnh nguy hiểm chéo vào chế phẩm vắc xin, đáp ứng tiêu chuẩn an toàn sinh học khắt khe của ngành thú y.

5. Tế bào dòng Marc-145 có ưu thế gì vượt trội so với tế bào đại thực bào phế nang PAM? Tế bào Marc-145 là dòng tế bào liên tục dễ duy trì, bảo quản ổn định và chuẩn hóa quy mô công nghiệp, khắc phục hoàn toàn nhược điểm số lần phân chia giới hạn và nguy cơ mang mầm bệnh tiềm ẩn từ vật chủ của tế bào sơ cấp PAM.

Kết luận

• Chủng virus KTY-PRRS-04 phân lập tại Bắc Giang có hoạt lực sinh học cao với hiệu giá đạt đỉnh 10^6,74 TCID50/25µl trên tế bào Marc-145.
• Quá trình gây bệnh tích tế bào tiến triển ổn định, đạt tỷ lệ phá hủy tế bào hoàn toàn 100% tại mốc 72 giờ sau gây nhiễm.
• Mốc thời gian thu hoạch sinh khối virus tối ưu được xác định chính xác ở 72 giờ nhằm thu hồi nồng độ kháng nguyên cực đại.
• Đoạn gen ORF5 dài 603 bp mã hóa 200 axit amin duy trì độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100% qua 40 đời cấy chuyển liên tục.
• Nghiên cứu khẳng định chủng virus KTY-PRRS-04 đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn về độ ổn định sinh học và sinh học phân tử để làm giống sản xuất vắc xin.

Đóng góp cốt lõi của luận văn là đã cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm toàn diện và minh chứng tính ổn định di truyền vững chắc của chủng KTY-PRRS-04 qua 40 thế hệ cấy chuyển, tạo tiền đề vững chắc cho việc tự chủ công nghệ sản xuất vắc xin tai xanh nhược độc nội địa. Trong lộ trình 12 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu cần tiếp tục thử nghiệm đánh giá hiệu lực bảo hộ trên đàn lợn thực địa. Các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc xin thú y hãy chủ động tiếp cận, ứng dụng ngay kết quả nghiên cứu này để nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh bền vững cho ngành chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC KTY - PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả, số liệu nêu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được bảo vệ ở một học vị nào khác. Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày.năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập và rèn luyện dưới mái trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp tôi hòa thiện hơn về nhân cách và trình độ chuyên môn.

Tôi đã nhận được sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các Thầy, Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô giáo công tác tại Khoa Thú y. Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú y cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến các Thầy, Cô giáo – những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS. Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Hà Nội, cô đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đến các Thầy, Cô trong bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh chị phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi tôi thực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất. Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này. Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày.năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục các từ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn.

ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài:. Mục tiêu đề tài. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Tình hình dịch PRRS trên thế giới. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài.

Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV). Hình thái, cấu tạo. Phân loại virus PRRS.

Khả năng gây bệnh của virus PRRS. Sức đề kháng của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.

Đặc điểm chung. Động vật cảm nhiễm. Chất chứa mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây.

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS. Bệnh tích của lợn mắc PRRS. 17 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các phương pháp chẩn đoán PRRS.

Biện pháp phòng và trị bệnh. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Nguyên liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145. Phương pháp nghiên cứu. Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145.

Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS. Phương pháp giải trình tự Gen.

Phương pháp đọc kết quả. Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu.

Kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus kty - PRRS - 04. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển.

Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY – PRRS - 04. 41 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04.

Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY - PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. Kết luận và kiến nghị.

53 Tài liệu tham khảo. 55 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng sự DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay kDa : Kilodalton LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MK : Monkey kidney cell MSD : Mistery Swine Disease OIE : Tổ chức thú y thế giới ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA : Ribonucleic acid SHFV : Simian hemorrhaghic fever virus L1 : Lần 1 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Protein cấu trúc của PRRSV. Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh.

Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR. Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR. Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được.

Kết quả chẩn đoán RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS. Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu. Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, PED và TGE. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua các đời.

Hiệu giá của chủng virus KTY – PRRS – 04 tại các thời điểm thu hoạch. Hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng PRRS nghiên cứu. So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY - PRRS – 04 các đời cấy chuyển.

Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY - PRRS - 04. So sánh sự tương đồng về axit amin của virus PRRS – 04 các đời cấy chuyển. 50 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới.

Cấu trúc hạt của PRRS virus. Cấu trúc bộ gen của PRRS virus.4: Bộ gen của virus PRRS. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus.

Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây gây nhiễm.

Đường cong sinh trưởng của virus KTY – PRRS - 04. Log10 hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5.

Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-04 ở đời cấy chuyển thứ 10. So sánh trình tự nucleotide của chủng KYT-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển. So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển. Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS -.

52 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN 1. Tên tác giả: Hà Văn Thịnh 2. Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” 3. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 4.

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá được sự ổn định một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng các phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen. Kết quả chính và kết luận 1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04: Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145. Chủng virus PRRS có hiệu giá cao và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145.

Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm. Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04: Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục.