Luận văn thạc sĩ hus phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh khánh hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của chúng

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh khánh hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Lê Thị Hồng Nhung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Hữu Cường
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của chúng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: VI SINH VẬT SỐNG TRÊN RONG BIỂN VÀ MỐI QUAN HỆ GIỮA CHÚNG
• 1.1. Rong biển
• 1.2. Vi sinh vật sống trên rong biển
• 1.3. Vi sinh vật sống nội sinh và trên rong
• 1.3.1. Đa dạng vi sinh vật sống trên rong
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật
• 2.3.2. Phương pháp lên men và thu cao chiết vi sinh vật
• 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.3.4. Phương pháp định danh và phân loại
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các vi sinh vật sống trên rong
• 3.2. Lên men vi sinh vật và thu cao chiết
• 3.3. Hoạt tính sinh học của cao chiết vi sinh vật
• 3.3.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
• 3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư người
• 3.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết nấm
• 3.4. Vị trí phân loại của các chủng vi sinh vật
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa

Nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Vùng biển Khánh Hòa với sự đa dạng sinh học phong phú là nơi lý tưởng để tìm kiếm các chủng vi sinh vật mới. Các vi sinh vật này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có tiềm năng ứng dụng trong y dược và công nghệ sinh học. Việc phân lập và nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp sinh học.

1.1. Đặc điểm sinh học của rong biển Khánh Hòa

Rong biển Khánh Hòa có sự đa dạng về loài và cấu trúc sinh học. Chúng chủ yếu thuộc ba ngành: rong đỏ, rong nâu và rong lục. Mỗi loại rong biển đều có các đặc điểm sinh học riêng biệt, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật sống trên chúng.

1.2. Vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái biển

Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng sinh thái biển. Chúng tham gia vào các chu trình dinh dưỡng, phân hủy chất hữu cơ và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, góp phần bảo vệ sức khỏe của hệ sinh thái biển.

II. Thách thức trong nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa cũng gặp phải nhiều thách thức. Việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật mới là một quá trình phức tạp. Ngoài ra, sự đa dạng sinh học cao cũng làm cho việc nghiên cứu trở nên khó khăn hơn.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập vi sinh vật

Phân lập vi sinh vật từ rong biển đòi hỏi các phương pháp nuôi cấy đặc biệt. Nhiều vi sinh vật không thể được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm thông thường, dẫn đến việc thiếu thông tin về sự đa dạng của chúng.

2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính sinh học

Môi trường sống của rong biển có thể ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của vi sinh vật. Các yếu tố như nhiệt độ, độ mặn và ánh sáng đều có thể làm thay đổi khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi sinh vật.

III. Phương pháp phân lập vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa

Để nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển, các phương pháp phân lập hiện đại được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp phân lập vi sinh vật mà còn xác định được hoạt tính sinh học của chúng. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cũng giúp nâng cao độ chính xác trong nghiên cứu.

3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống

Phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn được sử dụng phổ biến để phân lập vi sinh vật. Tuy nhiên, nó có nhiều hạn chế trong việc phát hiện các vi sinh vật khó nuôi cấy.

3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu vi sinh vật

Kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và phân tích trình tự gen giúp xác định chính xác các chủng vi sinh vật. Những phương pháp này cho phép phát hiện các vi sinh vật mà không cần nuôi cấy, từ đó mở rộng khả năng nghiên cứu.

IV. Hoạt tính sinh học của vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa cho thấy nhiều tiềm năng ứng dụng trong y dược. Các vi sinh vật này có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn, kháng virus và chống oxi hóa, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm sinh học mới.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn của vi sinh vật

Nhiều chủng vi sinh vật phân lập từ rong biển đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ. Các nghiên cứu cho thấy chúng có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh.

4.2. Tiềm năng chống oxi hóa của vi sinh vật

Các vi sinh vật từ rong biển cũng được nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa. Các hợp chất này có thể giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do, từ đó có thể ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

V. Ứng dụng thực tiễn của vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa

Vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Chúng có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và các sản phẩm sinh học khác. Việc khai thác và ứng dụng các vi sinh vật này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp sinh học.

5.1. Ứng dụng trong ngành thực phẩm

Vi sinh vật từ rong biển có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng. Chúng có khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng và hỗ trợ sức khỏe.

5.2. Ứng dụng trong ngành dược phẩm

Nghiên cứu cho thấy vi sinh vật từ rong biển có thể sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Các sản phẩm từ vi sinh vật này có thể giúp phát triển các loại thuốc mới.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển

Nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển Khánh Hòa đang mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành sinh học. Việc phân lập và nghiên cứu hoạt tính sinh học của các vi sinh vật này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái biển mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho khoa học và công nghệ.

6.1. Tương lai của nghiên cứu vi sinh vật

Nghiên cứu vi sinh vật từ rong biển sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của các công nghệ hiện đại. Việc áp dụng các phương pháp mới sẽ giúp phát hiện và khai thác các chủng vi sinh vật có giá trị.

6.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khai thác tiềm năng của vi sinh vật từ rong biển trong các lĩnh vực như y dược, thực phẩm và công nghệ sinh học. Việc này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam sở hữu đường bờ biển dài hơn 3.260 km cùng diện tích vùng đặc quyền kinh tế trên 1.000.000 km², được quốc tế công nhận là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học biển hàng đầu thế giới. Nguồn tài nguyên này lưu giữ khoảng 638 loài rong biển, trong đó hơn 100 loài có giá trị kinh tế và khoảng 60 loài đang được khai thác trực tiếp trong chế biến thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp chiết xuất keo sinh học. Bề mặt và mô bên trong của rong biển tạo nên vi môi trường sống đặc thù với mật độ vi sinh vật đạt từ 10² đến 10⁷ CFU/cm², nơi xảy ra sự cạnh tranh sinh thái và tương tác hóa học vô cùng khốc liệt.

Các thống kê quốc tế chỉ ra rằng các hợp chất tự nhiên mới phát hiện từ vi nấm sống trên rong biển chiếm tới 21% tổng số cấu trúc hóa học biển, vượt trội hơn các nguồn từ bọt biển (19%) hay rừng ngập mặn (16%). Tuy nhiên, tiềm năng sinh học của hệ vi sinh vật cộng sinh trên các loài rong biển nhiệt đới tại vùng duyên hải miền Trung Việt Nam vẫn chưa được khai thác toàn diện. Đề tài luận văn thạc sĩ tập trung phân lập tập đoàn vi khuẩn và vi nấm từ các loài rong biển thu thập tại tỉnh Khánh Hòa trong giai đoạn 2018–2019, đồng thời đánh giá sàng lọc 3 hoạt tính sinh học trọng điểm gồm: ức chế enzyme alpha-glucosidase, gây độc tế bào ung thư người và dọn dẹp gốc tự do DPPH. Nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ sưu tập gồm 289 chủng vi sinh vật biển, phát hiện những chủng nấm sợi nội sinh có chỉ số ức chế IC50 ấn tượng đạt 7,26 µg/mL đối với enzyme đích trị tiểu đường và tiêu diệt 100% tế bào ung thư thử nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh thái hóa học biển (Marine Chemical Ecology) và lý thuyết cộng sinh phân tử giữa thực vật biển với vi sinh vật (Host-Microbe Interactions). Trong môi trường đại dương, rong biển không có hệ thống miễn dịch thu nhận như động vật bậc cao, do đó chúng phải dựa vào mối quan hệ cộng sinh để tự bảo vệ trước sự bám dính của màng sinh học (biofilm) gây hại và áp lực từ các loài ăn thực vật. Hệ vi sinh vật biển được chia thành hai nhóm sinh thái rõ rệt: vi sinh vật ngoại sinh sống bám trên bề mặt mô (epibionts) và vi sinh vật nội sinh cư trú bên trong gian bào của rong (endophytes).

Để tồn tại và duy trì trạng thái cân bằng sinh thái, vi sinh vật nội sinh tiến hóa các con đường trao đổi chất thứ cấp đặc biệt, tổng hợp nên các hợp chất tự nhiên có hoạt tính cao như polyketide, alkaloid, sesquiterpene và diketopiperazine. Các tài liệu chuyên ngành xác nhận có tới 43% hợp chất phát hiện từ nấm nội sinh rong biển là những cấu trúc hóa học hoàn toàn mới chưa từng tìm thấy trong đất liền, với 27% hợp chất mới có nguồn gốc từ tảo biển. Về mặt dược lý, cơ chế ức chế enzyme alpha-glucosidase giúp làm chậm quá trình phân giải carbohydrate thành glucose tại ruột non, kiểm soát hiệu quả chỉ số đường huyết sau ăn. Song song đó, cơ chế dọn dẹp gốc tự do DPPH và hoạt tính gây độc tế bào theo con đường ức chế tăng sinh tế bào ác tính tạo nền tảng cho việc tìm kiếm các ứng viên thuốc điều trị ung thư và chống lão hóa.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 33 mẫu rong biển tươi đại diện cho 6 nhóm loài kinh tế và sinh thái tại Khánh Hòa: rong sứ xanh, rong sứ nâu (Kappaphycus striatum), rong mơ (Sargassum sp.), rong sụn gai (Eucheuma denticulatum), rong quạt (Padina sp.) và rong nho (Caulerpa lentillifera). Mẫu được thu thập theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên có định hướng tại các rạn san hô và bãi triều, bảo quản lạnh vô trùng và xử lý trong vòng 24–48 giờ tại phòng thí nghiệm.

Quy trình phân lập tách biệt rõ hai nhóm: vi sinh vật sống bám được thu bằng kỹ thuật quét bề mặt và pha loãng tới nồng độ 10⁻⁵; vi sinh vật nội sinh được phân lập sau khi khử trùng bề mặt mô rong bằng dung dịch NaClO và cồn 70% trong 60 giây, sau đó nghiền vô trùng và trải trên đĩa thạch. Môi trường nuôi cấy chuyên biệt gồm PDA bổ sung nước biển nhân tạo (25 g/L NaCl, pH 7,2–7,5) kèm kháng sinh chloramphenicol (40 µg/mL) và streptomycin (100 µg/mL) cho vi nấm; môi trường LB cải tiến chứa nystatin chống nấm dùng cho vi khuẩn.

Từ bộ chủng phân lập, 70 chủng vi sinh vật đại diện (35 vi khuẩn và 35 nấm sợi) được lên men tĩnh kết hợp lắc 200 vòng/phút ở thể tích 500 mL dịch nuôi cấy trong thời gian 7 đến 20 ngày. Sinh khối và dịch lên men được chiết kiệt 3 lần bằng dung môi ethyl acetate (tỷ lệ 1:1, thể tích/thể tích), cô quay chân không tại nhiệt độ 45°C thu trên 5 mg cao chiết mỗi chủng. Các phương pháp đánh giá hoạt tính được chuẩn hóa:

• Đánh giá ức chế enzyme alpha-glucosidase sử dụng cơ chất pNPG ở bước sóng 405 nm (đối chứng dương Voglibose).
• Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người gồm HepG2 (ung thư gan), LU (ung thư phổi) và RD (ung thư màng tim) bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) sau 72 giờ ủ (đối chứng dương Ellipticine).
• Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH ở bước sóng 515 nm.
• Giám định phân tử được thực hiện bằng cách tách chiết DNA tổng số, nhân bản đoạn gen 18S rDNA (~1,5 kb) bằng cặp mồi EF4f/EF3r trên máy luân nhiệt, giải trình tự chuỗi và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA7 theo thuật toán Neighbor-Joining với hệ số lặp lại 500 bootstrap.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ 33 mẫu rong biển đã thu hồi tổng cộng 289 chủng vi sinh vật thuần khiết, gồm 125 chủng vi khuẩn và 164 chủng vi nấm. Cụ thể, vi khuẩn gồm 54 chủng ngoại sinh và 71 chủng nội sinh; vi nấm bao gồm 70 chủng nấm men ngoại sinh và 94 chủng nấm sợi (với 58 chủng nấm sợi nội sinh chiếm 61,7%). Vi khuẩn nội sinh thể hiện sự đa dạng vượt trội về hình thái và sắc tố khuẩn lạc (vàng cam, đỏ tươi, nâu đất, trắng đục) so với nhóm sống bám vốn chủ yếu mang màu vàng nhạt da người.

Nhóm hoạt tính sinh học	Số mẫu hoạt tính / Tổng mẫu thử	Chủng vượt trội nhất	Giá trị hoạt tính ghi nhận	Tỷ lệ ức chế tại 100 µg/mL
Ức chế alpha-glucosidase	5 / 70 mẫu (Toàn bộ là nấm sợi)	Nấm sợi HN37	IC50 = 7,26 µg/mL	91,1%
Gây độc tế bào HepG2	14 / 35 mẫu nấm sợi	Nấm sợi HN22	Tế bào sống = 0,0%	100% tiêu diệt tế bào
Gây độc tế bào LU	12 / 35 mẫu nấm sợi	Nấm sợi HN22	Tế bào sống = 3,5%	96,5% ức chế tế bào
Gây độc tế bào RD	14 / 35 mẫu nấm sợi	Nấm sợi HN22	Tế bào sống = 0,0%	100% tiêu diệt tế bào
Chống oxy hóa DPPH	9 / 70 mẫu thử nghiệm	Nấm sợi HN33	SC50 = 15,1 µg/mL	91,1% bao vây gốc tự do

Ở thử nghiệm ức chế alpha-glucosidase, có 5/70 cao chiết thể hiện hoạt tính ức chế trên 50% ở nồng độ 100 µg/mL (HN1, HN2, HN3, HN4 và HN37). Đáng chú ý, toàn bộ 5 chủng này đều là nấm sợi nội sinh, trong khi các mẫu vi khuẩn không thể hiện hoạt tính rõ rệt. Chủng HN37 đạt hiệu quả mạnh nhất với giá trị IC50 đạt 7,26 µg/mL, vượt xa chủng HN3 (IC50 = 20,5 µg/mL) và HN2 (IC50 = 42,2 µg/mL).

Đối với hoạt tính gây độc tế bào ung thư, 14/35 mẫu cao chiết nấm sợi (chiếm 40,0%) có khả năng ức chế mạnh ít nhất một dòng tế bào ác tính. Đặc biệt, 4 chủng nấm sợi gồm HN22, HN37, HN49 và HN56 gây tiêu diệt hoàn toàn 100% cả 3 dòng tế bào HepG2, LU và RD ở nồng độ 100 µg/mL. Chủng nấm HN22 duy trì khả năng ức chế gần như tuyệt đối khi tỷ lệ tế bào sống sót của dòng HepG2 và RD là 0%, dòng LU chỉ còn 3,5%.

Ở thử nghiệm dọn dẹp gốc tự do DPPH, 9/70 mẫu cao chiết thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do rõ rệt, trong đó chủng nấm sợi HN33 ghi nhận chỉ số SC50 thấp nhất là 15,1 µg/mL (đạt hiệu suất dọn dẹp 91,1% tại nồng độ thử nghiệm ban đầu).

So sánh chỉ số IC50 / SC50 giữa các chủng nấm sợi ưu việt (µg/mL):
(Chỉ số càng thấp thể hiện hoạt tính sinh học càng mạnh)

Thảo luận kết quả

Khả năng sinh tổng hợp hoạt chất vượt trội của nấm sợi nội sinh bắt nguồn từ áp lực thích nghi sinh hóa trong mô chủ. Nhằm ngăn chặn các gốc oxy phản ứng (ROS) do rong biển sản sinh trong quá trình quang hợp dưới nước sâu, vi nấm bắt buộc phải tích lũy các chất chống oxy hóa đậm đặc như polyphenol và sesquiterpene. So sánh với các công bố quốc tế, hoạt tính ức chế alpha-glucosidase của chủng nấm HN37 (IC50 = 7,26 µg/mL) cao hơn gấp 11 lần so với vi khuẩn biển Bacillus amyloliquefaciens (IC50 = 84 µg/mL) và cao hơn 73 lần so với Shewanella algae (IC50 = 530 µg/mL) trong các nghiên cứu trước đây.

Dữ liệu thử nghiệm tế bào ung thư có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ cột phân nhóm thể hiện tỷ lệ tế bào sống sót và ma trận nhiệt (heat map) tương quan nồng độ - đáp ứng. Kết quả phân tích cây phát sinh loài 18S rDNA dài hơn 1330 bp cho thấy chủng HN37 có độ tương đồng 99% với các chi Chaetomium và Fusarium, trong khi chủng HN22 có độ tương đồng 99% với các chi Penicillium, Aspergillus và Chromocleista. Do đoạn 18S rDNA có tính bảo thủ cao trong giới nấm, mức độ tương đồng trên 96–99% chưa đủ để định danh chính xác loài đơn lẻ, đặt ra yêu cầu phải phân tích bổ sung các trình tự phân loại chuyên sâu hơn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Giải trình tự đa locus (MLST) và phân tích vùng ITS: Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cùng các trung tâm nghiên cứu chuyên ngành cần phối hợp giải trình tự toàn bộ vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 kết hợp gen mã hóa beta-tubulin và calmodulin cho hai chủng nấm chủ chốt HN37 và HN22 trong thời gian 6–9 tháng tới, nhằm định danh chính xác 100% đến cấp độ loài.
2. Tối ưu hóa công nghệ lên men quy mô bán công nghiệp: Nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học cần tiến hành khảo sát các thông số môi trường (nguồn cacbon, nitơ, độ mặn, nhiệt độ và pH) trong hệ thống nồi lên men (bioreactor) dung tích 10–50 lít trong vòng 12 tháng, đặt mục tiêu gia tăng hàm lượng hoạt chất thứ cấp tích lũy từ 35% đến 50% so với phương pháp nuôi cấy bình tam giác truyền thống.
3. Chiết tách và xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết: Các phòng thí nghiệm hóa dược cần ứng dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ (LC-MS/MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong lộ trình 18 tháng để phân lập, tinh chế tối thiểu 3–5 hợp chất tinh khiết chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính ức chế enzyme (IC50 = 7,26 µg/mL) và độc tính tế bào ung thư.
4. Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo: Các đơn vị nghiên cứu dược lý thực nghiệm cần thiết lập các mô hình chuột chuyển gen mắc đái tháo đường typ 2 và chuột mang khối u dị ghép (xenograft) trong thời gian 24 tháng, nhằm đánh giá độ an toàn sinh học, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và kiểm chứng khả năng giảm tối thiểu 40% đường huyết huyết tương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn hóa từ khâu lấy mẫu rong biển, xử lý vô trùng mô, phân lập vi sinh vật nội sinh và sống bám, đến kỹ thuật lên men, điện di và giải mã trình tự gen 18S rDNA.
• Nhà khoa học, chuyên gia nghiên cứu Hóa thực vật và Dược học: Cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm phong phú về 70 cao chiết vi sinh vật biển với đầy đủ các thông số định lượng IC50, SC50, hỗ trợ quá trình sàng lọc các dẫn chất tiềm năng trong điều trị đái tháo đường và ung thư.
• Doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm và Thực phẩm chức năng: Giúp các đơn vị sản xuất tiếp cận giải pháp công nghệ lên men vi sinh vật bền vững, rút ngắn thời gian thu sinh khối xuống còn 7–20 ngày, loại bỏ sự phụ thuộc vào việc khai thác tự nhiên các loài rong biển quý hiếm.
• Cơ quan quản lý tài nguyên biển và viện nghiên cứu môi trường: Cung cấp dẫn liệu khoa học giá trị về hiện trạng đa dạng sinh học vi sinh vật tại vùng biển Khánh Hòa, phục vụ công tác xây dựng ngân hàng gen quốc gia và hoạch định chính sách bảo tồn tài nguyên sinh vật biển nhiệt đới.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao vi sinh vật nội sinh trong rong biển lại sở hữu hoạt tính sinh học mạnh hơn vi sinh vật sống tự do ngoài môi trường nước biển?
Môi trường nội sinh trong mô rong biển tạo ra áp lực chọn lọc sinh thái vô cùng khắc nghiệt về không gian và nồng độ oxy phản ứng. Vi sinh vật nội sinh buộc phải biến đổi hệ gen để tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp bảo vệ mô chủ. Các báo cáo chuyên ngành ghi nhận có tới 30–50% vi sinh vật cộng sinh trên rong biển có khả năng sinh chất kháng sinh, cao gấp 3–5 lần so với tỷ lệ dưới 10% ở các chủng sống tự do ngoài nước biển khơi.

Chủng nấm sợi HN37 có tiềm năng ứng dụng nổi bật nhất trong lĩnh vực nào?
Chủng nấm sợi nội sinh HN37 thể hiện tiềm năng vượt trội trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường typ 2. Cao chiết ethyl acetate từ chủng nấm này ức chế tới 91,1% hoạt tính của enzyme alpha-glucosidase ở nồng độ 100 µg/mL và đạt chỉ số IC50 rất thấp là 7,26 µg/mL, mạnh hơn gấp nhiều lần so với các chủng vi khuẩn biển từng được công bố trên thế giới.

Mức độ gây độc của cao chiết nấm sợi HN22 đối với các dòng tế bào ung thư người được ghi nhận như thế nào?
Thử nghiệm nhuộm SRB định lượng chứng minh cao chiết nấm HN22 có hoạt tính gây độc tế bào phổ rộng. Tại nồng độ 100 µg/mL, chủng này tiêu diệt hoàn toàn 100% tế bào ung thư gan HepG2 và ung thư màng tim RD (tỷ lệ sống sót 0%), đồng thời ức chế 96,5% dòng tế bào ung thư phổi LU (tỷ lệ sống sót chỉ còn 3,5%).

Vì sao phân tích đoạn gen 18S rDNA chưa thể xác định được tên loài chính xác của chủng HN37 và HN22?
Đoạn gen 18S rDNA có tính bảo thủ tiến hóa rất cao. Kết quả phân tích cho thấy trình tự 18S rDNA dài trên 1330 bp của HN37 và HN22 đều có độ tương đồng 99% với nhiều loài thuộc các chi khác biệt như Chaetomium, Fusarium, Penicillium và Aspergillus. Trong vi nấm học, hai chủng có độ tương đồng 18S rDNA đạt 99%–100% vẫn có thể là hai loài khác nhau, do đó cần phải giải trình tự thêm vùng gen ITS và phân tích bào tử.

Làm thế nào để phân lập chính xác vi sinh vật nội sinh mà không bị tạp nhiễm bởi vi sinh vật sống bám ngoài bề mặt rong?
Nghiên cứu sử dụng quy trình khử trùng bề mặt nghiêm ngặt: mẫu rong biển tươi sau khi rửa sạch bằng nước biển vô trùng được ngâm trong dung dịch NaClO và cồn 70% đúng 60 giây để tiêu diệt 100% vi sinh vật bám ngoài, sau đó mới tiến hành cắt mẫu thành các phiến nhỏ 0,5 × 0,5 cm hoặc nghiền mô để cấy trên môi trường chọn lọc.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công bộ sưu tập 289 chủng vi sinh vật từ 33 mẫu rong biển tại vùng biển Khánh Hòa, gồm 125 chủng vi khuẩn và 164 chủng vi nấm (với 58 chủng nấm sợi nội sinh).
• Đã lên men bán quy mô 70 chủng và sàng lọc thành công 3 hoạt tính sinh học trọng yếu, phát hiện chủng nấm HN37 có khả năng ức chế mạnh enzyme alpha-glucosidase (IC50 = 7,26 µg/mL).
• Ghi nhận 4 chủng nấm sợi (đặc biệt là HN22) có khả năng tiêu diệt 100% các dòng tế bào ung thư người HepG2, RD và ức chế 96,5% dòng LU; đồng thời chủng nấm HN33 thể hiện khả năng chống oxy hóa DPPH vượt trội với SC50 = 15,1 µg/mL.
• Giải trình tự đoạn gen 18S rDNA và thiết lập cây phát sinh chủng loại cho hai chủng nấm ưu việt HN37 và HN22, đặt tiền đề cho các bước nghiên cứu phân loại chuyên sâu bằng chỉ thị gen ITS.
• Lộ trình 12–24 tháng tới cần tập trung tối ưu hóa lên men quy mô bioreactor, tinh sạch hoạt chất đơn phân và thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác bộ dữ liệu thực nghiệm phong phú này để phát triển các dòng sản phẩm dược phẩm sinh học thế hệ mới từ đại dương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. Vi sinh vật sống trên rong biển và mối quan hệ giữa chúng 1. Rong biển Rong biển là tảo lớn (macro algae) sống ở biển và có cấu tạo đa bào (multicellular). Chúng chủ yếu là những sinh vật quang tự dưỡng và được chia làm 3 ngành chính gồm: ngành rong đỏ (Rhodophyta), ngành rong nâu (Phaeophyta) và ngành rong lục (Chlorophyta) [25].

Rong biển khác thực vật bậc cao ở chỗ chúng không thực sự có rễ, thân hoặc lá. Tuy nhiên, ở những loài rong lớn, chúng thường xuất hiện rễ giả hoặc một phần có hình dạng như thân cây gọi là cuống (stipe) hay hình dạng phiến mỏng giống lá (như ở chi Laminaria). Một vài loài có kiểu đĩa dẹt (như rong lục Ulva). Ở những loài rong biển nhỏ, chúng cấu trúc dạng sợi là chủ yếu.

Rong biển có chứa nhiều polysaccharide (từ 20-76%), protein (15-40%), carotenoid, các khoáng chất và các axit béo không no như omega-3 (acid béo), docosahexanoic acid (DHA). Nhiều thành phần hoạt chất trong đó đã được chứng minh là có khả năng giúp cải thiện sức khỏe và ngăn ngừa các bệnh tật liên quan đến chuyển hóa [19]. Vi sinh vật sống trên rong biển Vi sinh vật là thành phần thiết yếu của sinh quyển, đặc biệt ở biển chúng đa dạng và có số lượng rất lớn. Một mL nước biển chứa hàng triệu vi rút, vi khuẩn, hàng nghìn nấm, các vi tảo và hàng trăm cấu trúc nhỏ, bào tử [10].

Các yếu tố môi trường biển sẽ hỗ trợ việc tạo các màng sinh học (biofilm) trên bề mặt sinh vật sống như rong, động vật, thực vật trôi nổi là nơi sống của các vi sinh vật nhỏ khác. Rong biển và quần thể vi sinh tạo nên một hệ sinh thái phức tạp và luôn biến động, gồm các loại vi sinh vật đa dạng (Hình 1. Quần thề vi sinh vật sống trên bề mặt rong, trong đó vi khuẩn là thành phần chiếm ưu thế, tiếp theo là các vi tảo và nấm biển [12]. Trong khi một số rong biển có chứa nhiều vi sinh vật cố định trên chúng, thì có những rong khác hầu như không có vi khuẩn bám cho dù chúng sống 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trong cùng môi trường.

Điều này chứng tỏ rằng cơ chế chống xâm nhập của rong chỉ xảy ra trên một số rong nhất định [39]. Bằng các phương pháp khác nhau như: phương pháp nuôi cấy truyền thống; phương pháp sử dụng kính hiển vi và phương pháp sinh học phân tử phân tích ADN ribosome. Ta có thể phát hiện được nhiều loài vi sinh vật sống trên rong. Một số hình thức sống của vi sinh vật trên rong: + Hình thức sống bám (epibiosis): vi sinh vật cố định và sống trên bề mặt của rong.

Dạng sống này thường tạo màng sinh học (biofilm) trên rong và đôi khi gây hại cho rong, hạn chế sự sống và tính đàn hồi của mô. Màng cũng có thể hạn chế sự trao đổi khí và giảm cường độ ánh sáng, giảm hoạt động quang hợp [6]. + Hình thức sống nội sinh (endobiosis): vi sinh vật sống bên trong mô của rong và chúng không gây triệu chứng nhiễm bệnh hay tác hại cho rong. Có tác giả cho rằng trong quá trình tiến hóa một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập mô chủ và cùng tiến hóa, thích nghi với môi trường bên trong cơ thể.

Chúng có thể sống nội sinh bắt buộc hoặc tùy tiện [11]. Chúng có thể đóng vai trò hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh hoặc ôn hòa đối với rong. Các vi sinh vật bám hoặc nội sinh ở rong biển đa dạng hơn so với các động thực vật đa bào khác. Vi sinh vật sống nội sinh và trên rong 1.

Đa dạng vi sinh vật sống trên rong Phương pháp phân lập thường được áp dụng để tìm các loài mới, nuôi cấy và ứng dụng chúng vào các lĩnh vực công nghệ sinh học, y dược. Manmadhan (2008) phân lập 92 chủng vi sinh vật từ 9 loài tảo đỏ. Trong số đó, có 33 loài có hoạt tính kháng vi sinh vật, một số thuộc nhóm Bacillus, Vibrio, Microbacterium và Psychrobacter [15]. Trong nghiên cứu khác của tác giả Mahadevan và cs (2013) tìm thấy 10 loài vi khuẩn đã được phân lập từ rong Ulva reticulata.

Trong số đó, 2 loài Bacillus sp. và Pseudomonas sp. có hoạt tính kháng vi khuẩn. Ở rong Ascophyllum nodosum có 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 25 vi khuẩn được phân lập, chủ yếu thuộc 3 chi Vibrio, Fladobacterium và Pseudomonas với mật độ cao hơn nghìn lần so với ở môi trường nước [26].

Zifeng (2009) đã phân lập và phân tích sự đa dạng của vi khuẩn ở 4 loài rong thuộc chi Gracilaria, Ulva pertusa, Laminaria và Polysiphonia. Kết quả cho thấy, 4 loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio gồm Halomonas venusta, Vibrio tasmaniensis, Vibrio lentus và Vibrio splendidus. Rong Polysiphonia có mật độ và sự đa dạng cao hơn cả, rong lục Ulva pertusa chỉ chứa 1vi khuẩn là V. lentus, rong câu đỏ Gracilaria chứa 1 loài Halomonas venusta [20].

Rong lục Ulva pertusa có 4 chi vi khuẩn được phát hiện là Vibrio, Micrococcus, Aeromonas và Enterobacterium. yezoensis có 5 chi vi khuẩn gồm Vibrio, Staphylococcus, Micrococcus, Enterrobacteriaceae và Corynebacterium. Trong số đó, Vibrio sp. được phân lập với tần suất và số lượng nhiều hơn cả [20].

Zheng và cs (2005) đã phân lập 175 chủng vi khuẩn từ 7 loại rong biển khác nhau, với số lượng là 18-40 chủng cho mỗi rong [37]. Boyd và cs (1999) phân lập vi khuẩn bám trên 7 loài rong bao gồm rong lục, rong nâu và rong đỏ. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 6 loại môi trường khác nhau cho phân lập [16]. Kết quả tác giả thu được 280 chủng với mỗi môi trường sử dụng, trung bình phân lập được 8-9 chủng.

Các loài thuộc chi Pseudoaltermonas, Alteromonas, Brevibacterium, Bacillus, Vibrio, Staphylococcus, Micococcus, Leucobacter, Salinispora, Eutintinnus được phân lập trong 6 loài rong [34]. Năm 2008, Wiese và cs đã nghiên cứu rất tỉ mỉ về vi sinh vật trên rong nâu Laminaria saccharina bằng phương pháp phân lập trên nhiều loại môi trường và mẫu thu trong thời gian 2 năm. Tác giả đã phân lập được 103 chủng vi khuẩn thuộc 21 chi khác nhau trong nhóm Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria. Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường được phân lập và nghiên cứu.

Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn, nhưng chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về loài. Loque (2010) phân lập nấm ở ba loài rong là Adenocystis utricalaris, Desmarestia anceps và Palmaria decipiens ở Nam cực thì thu được tổng số 75 loài nấm, trong đó có 27 loài nấm sợi và 48 loài 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nấm men. Các nấm thuộc các chi Geomyces, Antarctomyces, Oidiodendron, Penicillium, Phaeosphaeria, Aureobasidium, Cryptococcus, Leucosporidium, Metschnikowia và Rhodotorula [24].utricularis chứa tới 25 loài nấm sợi, trái lại D.anceps chỉ có 2 loài nấm sợi. Loài nấm Geomycespannorum tập trung nhiều nhất ở loài rong A.

Zuccaro và cs (2008) phân lập nấm từ rong nâu Fucus serratus với các mẫu rong thu thập ở các vị trí địa lý và tại mùa khác nhau trong năm. Kết quả tác giả phân lập được 42 loài nấm (336 isolate), nằm trong 35 chi khác nhau. Theo tác giả, các nấm thường gặp nhất là Sterilia mycelia (56 isolate), Sigmoidea marina (56 isolate), Cladosporium sp. Điều đặc biệt, các rong khỏe mạnh thì có độ đa dạng nấm và tần suất xuất hiện cao hơn so với rong bị bệnh [38].

*Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại (metagenomes, thư viện gene rDNA, PCR-DGGE và T-RFLP) xác định sự đa dạng của vi sinh vật trên rong Như đã biết, các vi sinh vật trong môi trường biển rất đa dạng. Tuy nhiên, chỉ 0,1-2% trong số chúng có thể được phân lập, nuôi cấy mục đích nghiên cứu các đặc tính lý hóa học và đặc tính sinh học. Các vi sinh vật phân lập chưa phản ánh được sự đa dạng của quần thể vi sinh vật trong môi trường nhất định. Vì vậy, việc nghiên cứu quần thể vi sinh vật ở rong biển không qua nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử là rất quan trọng và hữu hiệu [8].

Việc ứng dụng đặc điểm của các phương pháp như PCR-DGGE, T-RFLP, cloning/sequencing hoặc pyrosequencing đã được đề cập chi tiết [36]. Ở rong lục Ulva australis, các nhóm vi khuẩn Alphaproteobacteria và Bacteroidetes là chiếm ưu thế. Đặc biệt là các họ sau Rhodobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Flavobacteriaceaeand, Sapropiraceae. Rong đỏ Delisea pulchra mọc ở bờ biển Sydney cũng có các vi khuẩn thuộc Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Planctomycetia và Bacteroidetes, đặc biệt thuộc các họ Rhodobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Flavobacteriaceae và Planctomycetaceae [3], [23].

Các nghiên cứu về quần thể vi sinh vật trên rong cho thấy mỗi loài rong đều có những loại vi sinh vật đặc hiệu cho loài rong đó và có thể không thấy trong môi 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trường biển xung quanh. Ví dụ ở loài tảo bẹ Laminaria hyperborea, một đơn vị loài (OTU) được phát hiện ở 78% các mẫu tảo trong tất cả các mùa. Các vi sinh vật đặc hiệu này có thể thay đổi theo thời gian hoặc vị trí địa lý rong biển. Cùng một loài rong sẽ chứa thành phần vi sinh vật tương đối giống nhau, cho dù rong sống ở các vùng địa lý khác nhau.

Mặc dù vậy, cũng có các nghiên cứu cho thấy những nhận định sau về sự khác nhau của quần thể vi sinh vật trên một loài rong: vi sinh vật không đặc thù, và chúng có thể khác nhau ở các cá thể chủ cùng loài. Loài rong Ulva australia sống ở các vùng sâu khác nhau sẽ có sự sai khác về quần thể vi sinh vật (tới 40% sai khác, dựa vào phân tích DGGE). Khi phân tích trình tự rộng hơn, Burke và cs. (2011b) cho thấy dưới 20% trình tự gen 16S rRNA (tương đồng >97%) là có ở 6 mẫu rong Ulva australia.

Rong Laminaria hyperborea sống ở các vùng khác nhau, cũng có những quần thể vi sinh vật khác nhau trên chúng [33]. Quần thể vi sinh vật trên rong cũng khác nhau theo mùa, được thấy ở các loài như Fucus vesiculosus, Gracilaria vermiculophylla, và Ulva intestinali. Một số loài rong có sự khác nhau lớn đến mức không có các quần thể vi sinh vật đặc hữu. Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian, thức ăn), khắc nghiệt do vi sinh vật tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuất chất tiêu diệt vi sinh vật có hại nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơ chế đặc biệt mới tồn tại được.

Sự đa dạng vi sinh vật trên một loài rong nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố (mùa trong năm, nhiệt độ, môi trường biển). Rong là nguồn phân lập nhiều vi sinh vật mới. Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định.